WYKRYCIE WĘGORKA CHRYZANTEMOWCA (APHELENCHOIDES RITZEMABOSI) W NASIONACH SZAŁWII BŁYSZCZĄCEJ (SALVIA SPLENDENS)

Transkrypt

1 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011 WYKRYCIE WĘGORKA CHRYZANTEMOWCA (APHELENCHOIDES RITZEMABOSI) W NASIONACH SZAŁWII BŁYSZCZĄCEJ (SALVIA SPLENDENS) ANETA CHAŁAŃSKA 1, GABRIEL ŁABANOWSKI 1, TADEUSZ MALEWSKI 2 1 Instytut Ogrodnictwa Konstytucji 3 Maja 1/3, Skierniewice aneta.chalanska@inhort.pl 2 Muzeum i Instytut Zoologii Polskiej Akademii Nauk Wilcza 64, Warszawa I. WSTĘP Szałwia błyszcząca Salvia splendens Sello ex Roem. et Schult. w Polsce jest rośliną jednoroczną, ze względu na walory estetyczne uprawianą z przeznaczeniem na rabaty. Rośliny rozmnaża się przez nasiona wysiewane na przełomie lutego i marca. Zahartowaną rozsadę wysadza się do gruntu pod koniec maja. Węgorek chryzantemowiec Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz, 1911) Steiner & Buhrer, 1932 jest nicieniem żerującym w tkankach miękiszowych liści i w pąkach (Hesling i Wallace 1961). W Polsce od wielu lat jest znanym i powszechnym szkodnikiem chryzantemy (Baranowski 1976; Wojtowicz i Łabanowski 1993), truskawki (Szczygieł 1967) oraz wielu krzewów ozdobnych uprawianych w szkółkach (Soika i Łabanowski 2003). Szałwia jest znana jako roślina żywicielska węgorka chryzantemowca (Goodey 1956), jednakże w Polsce nie stwierdzono dotychczas występowania tego nicienia na omawianej roślinie. Nie zanotowano również rozprzestrzeniania się tego nicienia przez nasiona. II. MATERIAŁ I METODY Typowe objawy żerowania węgorka chryzantemowca w tkankach liści szałwii błyszczącej (S. splendens) z grupy Compacta erecta, rosnącej w gruncie zaobserwowano wiosną 2009 roku w Skierniewicach. W próbach uszkodzonych liści pobranych do analizy laboratoryjnej stwierdzono obecność nicieni. Jesienią 2009 roku z roślin tych zebrano nasiona, które przechowywano przez zimę zgodnie z praktyką ogrodniczą, następnie pod koniec lutego 2010 roku wysiano do multiplatów w szklarni. Po 6 tygo-

2 2 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) 2011 dniach siewki przesadzono do doniczek. Obserwowano objawy żerowania nicieni, słabszy wzrost i deformacje liści. W 2010 roku nicienie ekstrahowano zarówno z liści, jak i nasion. Pozyskane osobniki zakonserwowano w 4% roztworze wodnym formaldehydu. Następnie przygotowano mikroskopowe preparaty trwałe przy użyciu metody Steinhorsta (Steinhorst 1959). Identyfikacji gatunku dokonano przy pomocy mikroskopu świetlnego Nikon Eclipse 80i (powiększenie 1000x) z wykorzystaniem kontrastu interferencyjnoróżniczkowego DIC (technika Nomarskiego). Dla potrzeb badań molekularnych część pozyskanych nicieni zakonserwowano w mieszaninie DESS (20% dimetylosulfotlenku DMSO, 0,25M kwasu etylenodiaminotetraoctowego EDTA, nasycony roztwór NaCl, ph 8,0) (Yodern i wsp. 2006). Izolację DNA prowadzono na kolumienkach z dwutlenkiem krzemu przy użyciu zestawu GenElute Mammalian Genomic DNA Purification Kit (Sigma-Aldrich, Milwaukee, WI), zgodnie z instrukcją producenta. Oczyszczone DNA użyte zostało jako matryca w łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Dostępna w GenBanku sekwencja DNA genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) dla A. ritzemabosi (GenBank Acc No GU367869) porównana została za pomocą programu BLASTn z dostępnymi w GenBanku sekwencjami innych gatunków z rodzaju Aphelenchoides w celu określenia podobieństwa między nimi. Para starterów specyficzna dla A. ritzemabosi [forward (5_-gggctggaactagttgggta-3_) i reverse (5_-tccagctaagacaggcaaaga-3_)] służąca amplifikacji genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) została zaprojektowana w programie Primer3 edu/primer3 (Rozen i Skaletsky 2000). Amplifikacja wytypowanej sekwencji przeprowadzona została przy użyciu aparatu Rotor-Gene 6500 thermal cycler (Corbett Research, Mortlake, NSW, Australia). Startery PCR nabyto w IBB Oligo (Warszawa). Każdą reakcję PCR przeprowadzono w 20 µl mieszaniny reakcyjnej w składzie: 10 µl 2x SYBR Green JumpStart Taq ReadyMix (Sigma-Aldrich), 4 µl 10 µm każdego starteru, 4 µl wyizolowanego DNA, 2 µl H 2 O. W każdej analizie obecna była próba kontrolna negatywna (bez matrycy DNA). Wstępna denaturacja przeprowadzona została w 95 C przez 10 min., a profil termiczny następnych 40 cykli to: 95 C przez 30 s, 50 C przez 30 s i 72 C przez 30 s. Pomiary fluorescencji prowadzono przy długości fali 510 nm, w trakcie fazy wydłużania łańcucha DNA. Reakcję PCR zakończono po 40 cyklach. Krzywą amplifikacji mierzono w zakresie temperatur C co 0,1 C/s. III. WYNIKI I DYSKUSJA Badania mikroskopowe, jak i analizy molekularne potwierdziły obecność A. ritzemabosi zarówno w tkankach liści, jak i w nasionach szałwii błyszczącej. Wykazano także możliwość rozwoju populacji nicieni w rozsadzie szałwii uprawianej z porażonych przez A. ritzemabosi nasion. Wykorzystywana para starterów pozwoliła zaobserwować różnice w sekwencji genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) pomiędzy A. ritzemabosi, A. xylocapae, A. besseyi i A. fragariae (rys. 1).

3 Wykrycie węgorka chryzantemowca w nasionach szałwii 3 Starter forward A. ritzemabosi GGGCTGGAACTAGTTGGGTA A. xylocopae.ttg...t..a...a..t A. besseyi...g...a...t A. fragariae..tg...t...t Starter reverse A. ritzemabosi TCTTTGCCTGTCTTAGCTGGA A. xylocopae...a...t...t A. besseyi...a...t..g..g... A. fragariae...a..g..a...t Rys. 1. Różnice sekwencji DNA genu I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) A. ritzemabosi, A. xylocapae, A. besseyi i A. fragariae dla starteru forward i starteru reverse Fig. 1. Differences between the A. ritzemabosi, A. xylocapae, A. besseyi and A. fragariae DNA sequence of the cytochrome oxidase gene subunit I (COI) for the primer pair Sekwencja, na podstawie której zaprojektowano startery do przeprowadzenia reakcji amplifikacji PCR, dla regionu COI, dla A. ritzemabosi obejmowała 248 par zasad. Do reakcji amplifikacji użyto DNA wyizolowanego z jednego osobnika. W próbach ujemnych nie pojawiła się krzywa amplifikacji. Udokumentowanie przeżycia osobników węgorka chryzantemowca w nasionach szałwii jest nową informacją w literaturze. Jest ona zgodna z doniesieniem Browna (1956), który wykrył A. ritzemabosi w nasionach Callistephus chinensis i wskazał, że istnieje możliwość rozprzestrzeniania się tego gatunku poprzez nasiona. Inni autorzy udowodnili, że osobniki węgorka chryzantemowca w suchych liściach chryzantem mogą przeżyć nawet kilka lat. Ponadto wskazali, że porażenie upraw w roku następnym nie następuje poprzez glebę, w której nicienie przeżywają dość krótko (około 3 4 miesięcy). Właściwym źródłem porażenia są suche części roślinne, zwłaszcza jeżeli są przetrzymywane w niskiej temperaturze (około 4 C). Żywe osobniki A. ritzemabosi mogą być w nich obecne nawet po 3 latach (French i Barraclough 1962). Krusberg (1967) wykazał, że dzieje się tak dzięki wysokiej zawartości lipidów w ciele nicieni tego gatunku, co umożliwia im przeżycie w warunkach odwodnienia. Tak więc proces suszenia nasion i ich przechowywania, wykorzystywany w praktyce ogrodniczej, nie eliminuje nicieni, które do nich wniknęły. Do odbudowania populacji wystarczy jedna samica (French i Barraclough 1961). Węgorek chryzantemowiec poraża ponad 200 gatunków roślin, w tym zarówno chwasty, jak i rośliny ozdobne (Goodey 1956; Sturhan 1962). Konsekwencją wysiania nasion zawierających żywe osobniki A. ritzemabosi będzie porażenie wielu sąsiadujących upraw. W warunkach polowych do porażenia dochodzi, gdy odległość między roślinami nie przekracza 1 m (Hesling i Wallace 1961). W Polsce, w szkółkach roślin ozdobnych szkody wywołane występowaniem węgorka chryzantemowca obserwuje się od 1996 roku (Łabanowski i Soika 1996; Łabanowski i Soika 2002), a lista gatunków i odmian roślin ozdobnych, które są żywicielami węgorka chryzantemowca wciąż się rozszerza (Soika i Łabanowski 2003; Chałańska i Łabanowski 2010). IV. WNIOSKI 1. A. ritzemabosi przeżywa w nasionach szałwii błyszczącej okres zimy i jest źródłem porażenia siewek, a tym samym roślin w okresie wegetacji.

4 4 Progress in Plant Protection/Postępy w Ochronie Roślin 51 (3) Zastosowanie specyficznych dla A. ritzemabosi starterów amplifikujących gen I podjednostki oksydazy cytochromowej (COI) pozwala identyfikować ten gatunek. V. LITERATURA Baranowski T Badania nad szkodliwą fauną złocieni w okolicach Poznania. Rocz. Nauk Roln., Seria E, 6: Brown E.B A seed-borne attack of Chrysanthemum eelworm (Aphelenchoides ritzemabosi) on the annual aster (Callistephus chinensis). J. Helminth. 30: Chałańska A., Łabanowski G Diagnostyka nicieni liściowych z rodzaju Aphelenchoides. Instrukcja wykrywania nicieni na podstawie uszkodzeń roślin ozdobnych. Agencja Reklamowo-Wydawnicza Estet, 20 ss. French N., Barraclough R.M Observations on the reproduction of Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz). Nematologica 6: French N., Barraclough R.M Survival of Aphelenchoides ritzemabosi (Schwartz) in soil and dry leaves. Nematologica 7: Goodey T The Nematode Parasites of Plants Catalogued under their Hosts. Comm. Agricul. Bur., Farn. Royal, England, 140 pp. Hesling J.J., Wallace H.R Observations on the biology of chrysanthemum eelworm Aphelenchoides ritzema-bosi (Schwartz) Steiner in florists chrysanthemum. Ann. Appl. Biol. 49: Krusberg L.R Analyses of total lipids and fatty acids of plant-parasitic nematodes and host tissues. Comp. Biochem. Physiol. 21: Łabanowski G., Soika G Najgroźniejsze szkodniki w szkółkach roślin ozdobnych. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 36 (1): Łabanowski G., Soika G Aktualne problemy w ochronie roślin ozdobnych przed szkodnikami. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 42 (1): Rozen S., Skaletsky H.J Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. p In: Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology (S. Krawetz, S.A. Misener, eds.). Humana Press, Totowa, 512 pp. Soika G., Łabanowski G Zagrożenie upraw szkółkarskich roślin ozdobnych przez węgorka chryzantemowca i próba jego zwalczania. Prog. Plant Protection/Post. Ochr. Roślin 43 (2): Steinhorst J.W A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous glycerin. Nematologica 4: Sturhan D Über neue Wirtspflanzen der Blattäichen Aphelenchoides fragariae und A. ritzemabosi, mit Bemerkungen zu den Wirtspflanzenkreisen beider Nematodenarten. Anz. Schädlingsk. 35: Szczygieł A Wstępna ocena szkodliwości nicieni z rodzaju Aphelenchoides dla truskawek w Południowej Polsce. Prace Inst. Sad. 11: Wojtowicz M., Łabanowski G Wpływ nematocydów na wzrost złocieni i rozwój węgorka chryzantemowca (Aphelenchoides ritzemabosi). Zesz. Nauk. ISiK 1: Yoder M., Tandingan De Ley I., King I.W., Mundo-Ocampo M., Mann J., Blaxter M., Poiras L., De Ley P DESS: a versatile solution for preserving morphology and extractable DNA of nematodes. Nematology 83:

5 Wykrycie węgorka chryzantemowca w nasionach szałwii 5 ANETA CHAŁAŃSKA, GABRIEL ŁABANOWSKI, TADEUSZ MALEWSKI DETECTION OF APHELENCHOIDES RITZEMABOSI (SCHWARTZ) IN SCARLET SAGE (SALVIA SPLENDENS) SEEDS SUMMARY Characteristic damage caused by feeding leaf nematodes were recorded on sage plants of Compacta erecta group growing in the field in spring Nematological analysis showed the Aphelenchoides ritzemabosi presence in collected leaves. Seeds were sampled in the autumn from sage plants and then used for seedlings production in the next vegetation season. Collected seeds were stored over the winter and then sown into plastic boxes in the glasshouse conditions in February In April seedlings were replanted into larger pots. They already had symptoms such as weak growth and partial leaf deformations. These were the typical symptoms of damage caused by foliar nematodes which were later found in the field during the vegetation period. The analysis of leaves confirmed A. ritzemabosi presence. Further investigation showed also the presence of nematodes in seeds. In Poland, this was the first record leaf damages caused by A. ritzemabosi on Salvia splendens. Comparison of Aphelenchoides cytochrome oxidase gene subunit I (COI) allowed to design primers for molecular identification of A. ritzemabosi. The primer pair reproducibly amplified the COI region of A. ritzemabosi, generating a 248-bp product using total genomic DNA extracted from individual nematodes. Key words: Aphelenchoides ritzemabosi, scarlet sage, cytochrome oxidase gene subunit I (COI)