WERYFIKACJA METODYCZNYCH PARAMETRÓW OZNACZANIA PRZECIWBAKTERYJNEJ AKTYWNOŚCI OLEJKÓW ETERYCZNYCH

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: Aleksandra Budzyńska 1, Marzena Więckowska-Szakiel 2, Danuta Kalemba 3, Beata Sadowska 2, Barbara Różalska 2 WERYFIKACJA METODYCZNYCH PARAMETRÓW OZNACZANIA PRZECIWBAKTERYJNEJ AKTYWNOŚCI OLEJKÓW ETERYCZNYCH 1 Laboratorium Usług Mikrobiologiczno-Technicznych, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, UŁ Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. M. Mikołajczyk-Chmiela 2 Zakład Biologii Zakażeń, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii, UŁ Kierownik Zakładu: prof. dr hab. B. Różalska 3 Instytut Podstaw Chemii Żywności, PŁ Dyrektor Instytutu: prof. dr hab. S. Wysocki Badano aktywność olejków eterycznych wobec Staphylococcus aureus i Escherichia coli, metodami dyfuzji z krążka i studzienki oraz metodami mikrorozcieńczeń w bulionie. Wykazano, że ważnym parametrem danej metodyki jest wybór właściwego rozpuszczalnika olejków. Metody dyfuzji w agarze oceniono jako skryningowe o stosunkowo niskiej czułości. Wykazano natomiast, że metody mikrorozcieńczeń są bardziej dokładne dając możliwość wyznaczenia minimalnego stężenia hamującego wzrost bakterii. Przy badaniu olejków, jako produktów trudno rozpuszczalnych w wodzie, których niepełny stopień rozproszenia może interferować z odczytem absorbancji, wskazane jest zastosowanie indykatorów wzrostu, np. wskaźnika redox - rezazuryny. Wobec ciągłego wzrostu antybiotykooporności drobnoustrojów oraz tendencji odwrotu od powszechnego stosowania konserwantów chemicznych, możliwość użycia roślinnych olejków eterycznych w praktyce medycznej lub w ochronie różnorodnych produktów przed degradacją mikrobiologiczną, staje się coraz bardziej atrakcyjna. Jednakże, ich zastosowanie praktyczne często ogranicza brak standaryzacji metod oznaczania aktywności biologicznej. Przegląd danych piśmiennictwa wskazuje na pewne ograniczenia dotyczące możliwości porównania aktywności przeciwdrobnoustrojowej olejków i innych produktów naturalnych badanych w różnych laboratoriach, wynikające z dowolności stosowanych w tym celu metod badawczych (4, 5, 6, 7, 8, 9). Autorzy prezentowanej pracy zamierzają wskazać na najbardziej istotne parametry dostępnych metodyk, których dokładna analiza, odrzucenie, akceptacja lub modyfikacja, może skutkować podniesieniem wiarygodności otrzymanych wyników badań.

2 282 A. Budzyńska i inni Nr 3 MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. W badaniach użyto szczepów referencyjnych: Staphylococcus aureus ATCC i Escherichia coli NCTC Bakterie wysiewano na płytki BHA (Brain Heart Agar, Difco). Po inkubacji (24 godz, 37 C) kolonie zbierano i zawieszano w roztworze fizjologicznym NaCl (0,85%), przygotowując zawiesinę o gęstości ok. 1 x 10 8 kom/ml (pomiar nefelometryczny). Podłoża i inne odczynniki chemiczne. Podłoża bakteriologiczne: MHA - Mueller-Hinton agar (Difco, USA), MHB - Mueller-Hinton bulion (Mast-Diagnostic, USA). Emulgatory olejków: Tween 20 (Sigma, USA), Tween 80 (LOBA CHEMIE, Niemcy), DMSO (Sigma, USA), 96% alkohol etylowy (POCH, Polska) - roztwory w podłożu MHB oraz 0,15% agar w MHB. Rezazuryna (7-hydroksy-3H,-fenoksyazyno-3-on-10-osydo sól sodowa) 0,01% roztwór wodny (Sigma, USA). Olejki eteryczne. Badano komercyjnie dostępne olejki roślinne (Pollena Aroma, Warszawa): lawendowy (Lavandulae aetheroleum) z Lavandula angustifolia, cytrynowy (Limonis aetheroleum) z Citrus limon i olejek drzewa herbacianego (Melaleucae aetheroleum) z Melaleuca alternifolia. Przygotowano ich rozcieńczenia (v/v) bezpośrednio w podłożu MHB zawierającym określone stężenie emulgatora, lub wstępnie w alkoholu etylowym (96%) w stosunku 1:1 a następnie w MHB/emulgator, w zakresie zależnym od ocenianej metody badania aktywności. Metoda dyfuzyjno-krążkowa. Metoda zgodna w założeniach z zaleceniami CLSI/ NCLS (10). Podłoże MHA (średnica płytek 90 mm) posiewano zawiesiną bakteryjną o gęstości 10 8 /ml. Następnie, na powierzchnię posiewu nakładano jałowe krążki bibułowe (śr. 6 mm, Emapol, Polska) i nanoszono na nie po 10 µl odpowiedniego stężenia olejku (rozcieńczenia w podłożu MHB z dodatkiem określonego emulgatora w zakresie stężeń 75,0-3,12%). Kontrolę ujemną stanowił krążek nasączony podłożem z dodatkiem emulgatora, kontrolę dodatnią krążek zawierający gentamycynę (10 µg/ml, Mast-Diagnostic, USA). Po inkubacji (24 godz, 37 o C) mierzono strefę zahamowania wzrostu (wraz ze średnicą krążka). Metoda dyfuzyjno-studzienkowa. Metoda oparta na założeniach metody dyfuzyjno-krążkowej. Podłoże MHA (śr. płytek 90 mm) posiewano zawiesiną bakteryjną o gęstości 10 8 /ml. Następnie w podłożu wycinano studzienki (śr. 5 mm) i nanoszono po 50 µl odpowiedniego stężenia olejku w zakresie 50,0-0,78%. Kontrole - dodatnia i ujemna, jak podano wyżej (antybiotyk: oksacylina 8 µg/ml, Sigma, USA). Po inkubacji (24 godz, 37 o C) mierzono strefę zahamowania wzrostu (wraz ze średnicą studzienki). Metoda mikrorozcieńczeń w bulionie. Metoda oparta na zaleceniach CLSI/NCLS. Olejki rozcieńczano bezpośrednio w podłożu MHB/0,5% Tween 20 lub, w modyfikacji metody - wstępnie w alkoholu etylowym (1:1 v/v), a dalej w podłożu MHB/0,5% Tween 20. Badane stężenia olejków (zakres 50,0-0,048%) nanoszono w objętości 100 µl do studzienek 96-dołkowej płaskodennej płytki polistyrenowej (NUNC, Dania) i dodawano po 100 µl zawiesiny bakteryjnej o gęstości 10 6 /ml w MHB/0,5% Tween 20). Kontrola dodatnia: zawiesina bakterii w 200 µl MHB/0,5% Tween 20; kontrola ujemna: podłoże bez bakterii. Po 24 godz. inkubacji w temp. 37 C dokonywano odczytu absorbancji (OD 600, czytnik Victor 2, Wallac, Finlandia). Za MIC (Minimal Inhibitory Concentration) przyjmowano stężenie badanego olejku, przy którym OD 600 w danej studzience nie przekraczała wartości absorbancji podłoża. Uzupełnienie tej metody stanowiła wizualizacja wyniku hamowania

3 Nr 3 Przeciwbakteryjna aktywność olejków eterycznych 283 wzrostu bakterii, przez przeprowadzenie reakcji redukcji rezazuryny, którą opisano w szczegółach poniżej. Jako referencyjną substancję o działaniu przeciwbakteryjnym zastosowano ofloksacynę (Sigma, USA), wyznaczając jej MIC dla S. aureus ATCC na 0,5 µg/ml) i dla E. coli NCTC 8196 na 0,015 µg/ml. Metoda mikrorozcieńczeń w bulionie z dodatkiem 0,15% agaru, z zastosowaniem rezazuryny. Metoda oparta na założeniach opisanych przez Mann i Markham (9). Etapy przygotowania rozcieńczeń olejków i zawiesiny bakteryjnej, ich nanoszenia do studzienek mikropłytki oraz etap 24 godzinnej inkubacji, wykonano jak opisano wyżej. Dokonano pierwszego odczytu absorbancji (OD 600 ) a następnie, do wszystkich studzienek dodano po 10 µl 0,01% roztworu wodnego rezazuryny. Próby inkubowano w temp. 37 C przez 2 godz (w ciemności) i dokonywano kolejnego pomiaru absorbancji oraz oceny wizualnej powstałej barwy. WYNIKI I DYSKUSJA Celem pracy było przeprowadzenie analizy istotnych parametrów metodycznych oznaczania przeciwbakteryjnej aktywności olejków eterycznych i wskazanie ich krytycznych punktów, mających wpływ na otrzymywanie wiarygodnych i porównywalnych wyników badań. Jako obiekt badań wybrano trzy olejki eteryczne znane ze swojej aktywności antyseptycznej: olejek z liści drzewa herbacianego Melaleuca alternifolia, olejek lawendowy z kwiatów Lavandula angustifolia oraz olejek cytrynowy uzyskiwany z owocni cytrynowca zwyczajnego (Citrus limon) (1, 2, 3). Ich aktywność przeciwbakteryjną badano czterema metodami, najczęściej stosowanymi w tym celu, używając jako bioindykatorów - Staphylococcus aureus i Escherichia coli. Zwykle hydrofobowe właściwości olejków eterycznych powodują, że niezwykle ważnym aspektem w metodyce oznaczania ich aktywności biologicznej jest dobór właściwego emulgatora/surfaktantu/rozpuszczalnika, który powinien zapewnić jednorodność mieszaniny. Dobór ten musi być jednak poprzedzony wyznaczeniem ich maksymalnego stężenia dodawanego do podłoża hodowlanego, które nie spowoduje obniżenia żywotności organizmu testowego. W związku z tym, we wstępnych badaniach tej pracy sprawdzono wrażliwość szczepów referencyjnych (S. aureus i E. coli) na wybrane do doświadczeń emulgatory, tj. Tween 20, Tween 80, DMSO, 96% alkohol etylowy. W tym celu zastosowano metodę mikrorozcieńczeń w bulionie, identyczną jak oznaczanie MIC preparatów biobójczych/biostatycznych wg. CLSI. Stężenia użytych substancji, które nie wywierały żadnego wpływu na wzrost bakterii, oscylowały w granicach 1-0,5%. Stężenia wyższe wpływały negatywnie na namnażanie bakterii, w stopniu zależnym od typu emulgatora i rodzaju bakterii. Maksymalne dopuszczalne stężenia użytych produktów dla S. aureus wynosiło: 5% DMSO, 3% etanolu, 1% Tween 20, 0,5% Tween 80. Stężenia emulgatorów nie zmieniające dynamiki wzrostu E. coli, wynosiły: 3% DMSO, 1% etanolu, 0,5% Tween 20, 0,5% Tween 80. Stężenia powyższych preparatów, podawane w dostępnym piśmiennictwie, są porównywalne lub niekiedy nieco wyższe (5, 8). Następnym etapem było wyznaczenie stopnia dyspersji olejków w podłożu z dodatkiem danego emulgatora oraz ocena stabilności utworzonego roztworu. Zaobserwowano, że podłoża zawierające 1% DMSO lub 0,5% alkohol etylowy, stosunkowo trudno mieszały się z olejkami (nawet po długim, intensywnym mieszaniu nie

4 284 A. Budzyńska i inni Nr 3 uzyskiwano jednorodnej mieszaniny). Z kolei, zastosowanie podłoża z dodatkiem MHB/0,5% Tween 80 zapewniało wydajniejszą dyspersję olejków do fazy wodnej, chociaż stabilność jednorodnej mieszaniny w czasie była wciąż niezadowalająca. Dodatek do podłoża MHB 0,5% Tween 20, okazał się zdecydowanie lepszy w tym względzie, stabilizując dyspersję badanych olejków przez dłuższy czas, wystarczający do przygotowania szeregu ich stężeń roboczych. Jednolitą i trwałą dyspersję olejków uzyskano natomiast przy użyciu 0,15% agaru w podłożu MHB. Modyfikacją metodyki przygotowywania roboczych stężeń olejków było ich wstępne dwukrotne rozcieńczenie w alkoholu etylowym (96%). Tak otrzymany roztwór olejków rozcieńczano dalej w podłożu MHB z dodatkiem 0,5% Tween 20, wybranego wcześniej, ze względu na jego najlepsze oczekiwane parametry. Zastosowanie tej procedury zapewniło stabilną dyspersję olejku w podłożu, przekładając się na podniesienie czułości metod dyfuzji w agarze. Wyniki badań nad wpływem zastosowanych emulgatorów na wielkość stref zahamowania wzrostu w metodzie dyfuzji ze studzienek przedstawiono w Tabeli I, na przykładzie działania olejku herbacianego na S. aureus. Tabela I. Wpływ rodzaju emulgatora na wielkość strefy zahamowania wzrostu (mm) S. aureus Dyfuzja olejku drzewa herbacianego ze studzienki w agarze. Stężenie olejku * (% v/v) Emulgator ** Strefa zahamowania wzrostu *** (mm) 25 12,5 6,25 3,125 1,56 0,78 T T DMSO EtOH/T20 nb * olejki rozcieńczano v/v w podłożu MHB z dodatkiem emulgatorów; ** T80-0,5%Tween 80; T20-0,5% Tween 20; DMSO - 0,5% DMSO; EtOH/T20 - wstępne rozcieńczenie olejku w 96% alkoholu etylowym 1:1, następne w MHB/0,5% Tween 20, *** średnica studzienki 5 mm = brak strefy zahamowania wzrostu, nb - nie badano Z obserwacji własnych wynika, iż ważny wpływ na stopień rozpuszczalności olejków wywiera także kolejność ich mieszania z podłożem zawierającym emulgator. Aby uzyskać możliwie najbardziej jednorodną i stabilną mieszaninę, wskazane jest wstępne mieszanie olejku z samym emulgatorem (np. 1:1) i późniejsze dokonywanie rozcieńczeń w podłożu hodowlanym. Takie postępowanie jest jednak limitowane koniecznością dalszego rozcieńczenia uzyskanego w ten sposób 50% olejku, co najmniej 25- krotnie, aby osiągnąć poziom dopuszczalnego maksymalnego stężenia rozpuszczalnika, nie wpływającego na wzrost drobnoustrojów testowych (najczęściej <2%). W związku z tym, taka procedura wstępnego rozcieńczania olejku jest przydatna do badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej metodą mikrorozcieńczeń w bulionie lub równoważnych metodach (ale raczej nie w metodach dyfuzji w agarze) i to pod warunkiem, że badane olejki lub ich składniki będą aktywne w stężeniach poniżej 1% v/v. Przegląd piśmiennictwa tematu wskazuje, że do badania aktywności przeciwdrobnoustrojowej olejków najczęściej wybierane są metody dyfuzji z krążka, dyfuzji ze studzie-

5 Nr 3 Przeciwbakteryjna aktywność olejków eterycznych 285 nek, działanie frakcji lotnych olejków, rozcieńczeń w agarze oraz test mikrorozcieńczeń w bulionie. Większość z nich bierze swój wzór w zaleceniach powszechnie akceptowanej instytucji, jaką w przypadku badania aktywności antybiotyków, jest CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), dawniej NCLS (The National Committee on Clinical Laboratory Standards) (10). Z analizy parametrów metodycznych stosowanych technik wynika jednak, że w przypadku badania aktywności olejków i innych nierozpuszczalnych w wodzie fitozwiązków, nie wszystkie zalecenia CLSI, uzasadnione wieloletnimi badaniami, są respektowane. Zwykle dotyczy to zbyt dowolnego doboru organizmów testowych, gęstości inokulum i zestawu produktów referencyjnych oraz sposobu oceny (często nie numerycznej) efektu końcowego. Zastosowana w prezentowanej pracy metoda dyfuzji z krążka jest metodą półilościową, którą należy ocenić jako skryningową, przydatną w badaniu dużej liczby preparatów czy drobnoustrojów docelowych. Pozwala na wyselekcjonowanie olejków lub ich składników o potencjalnym działaniu przeciwdrobnoustrojowym i skierowanie ich do dalszych dokładniejszych badań. Na wyniki w metodach dyfuzyjnych największy wpływ ma rodzaj emulgatora, objętość naniesionej próby oraz sama konsystencja olejku i jego właściwości dyfuzyjne. Na podstawie wyników własnych badań zauważono pozornie różną czułość metod dyfuzyjnych w agarze, na niekorzyść dyfuzji z krążka. Wynika to np. z różnej objętości olejku nanoszonego na krążek bibułowy (10 µl) i do studzienki w agarze (50 µl). Próba zastosowania takiej samej ilości produktu w obu metodach wykazała, że olejki naniesione w objętości 10µl/studzienkę wykazywały niską aktywność hamującą wzrost bakterii (dane nie pokazane). W tych warunkach np. olejek lawendowy hamował wzrost S. aureus w stężeniu 12,5%, podczas gdy 50 µl tego samego olejku dawało efekt hamujący już w stężeniu 3,125%. Olejek cytrynowy naniesiony w objętości 10 µl/studzienkę nie hamował wzrostu bakterii, a użyty w objętości 50 µl/studzienkę był efektywny w stężeniu 25%. Z kolei olejek drzewa herbacianego naniesiony w objętości 50 µl/studzienkę był aktywny przy stężeniu 12,5%, podczas gdy 10 µl/studzienkę, prawdopodobnie z uwagi na słabą dyfuzję, było nieefektywne. Podobne zależności, jak opisane w odniesieniu do S. aureus, zaobserwowano w badaniach z użyciem E. coli (dane nie pokazane). Wydaje się również, iż stosunkowo słaba aktywność badanych olejków wykazana wyżej opisanymi metodami dyfuzji w agarze, wynikać może w części z różnej lotności aktywnych składników olejku w czasie 24 godzinnej inkubacji. Znaną odmianą technik dyfuzyjnych, uwzględniających ten fakt są techniki badawcze oceniające jedynie aktywność frakcji lotnych danego olejku (6, 7). Metody mikrorozcieńczeń w bulionie okazały się być bardziej czułe, niż opisane powyżej metody dyfuzyjne. Dały możliwość wyznaczenia minimalnego stężenia hamującego wzrost mikroorganizmów testowych (MIC), w dość wąskim i precyzyjnym zakresie stężeń. Warto je przeprowadzać dwustopniowo: wyznaczając w pierwszym etapie zakres aktywnych stężeń badanego produktu, w drugim zaś etapie ustalając dokładne stężenie aktywne. Stosując wersję badawczą z zastosowaniem mikropłytek 96-studzienkowych, odczyt wyników może polegać na wizualnej ocenie stopnia zmętnienia w danej studzience, albo na ocenie spektrofotometrycznej (OD 600 ). Przy badaniu produktów trudno rozpuszczalnych w wodzie, których niepełny stopień rozproszenia może interferować z odczytem absorbancji, wskazane jest zastosowanie barwnych indykatorów wzrostu drobnoustrojów (9). W prezentowanej pracy, jako miernik obecności żywych drobnoustrojów obecnych w próbach poddanych działaniu olejków, zastosowano wskaźnik redox - rezazurynę. Ten związek podlega w wa-

6 286 A. Budzyńska i inni Nr 3 runkach doświadczenia redukcji przez aktywne metaboliczne drobnoustroje zmieniając barwę z niebieskiej (rezazuryna) na różową (rezorufina) a intensywność barwy koreluje z liczebnością populacji. Stwierdzono w tej i innych pracach, że zastosowanie rezazuryny, jako wskaźnika aktywności metabolicznej bakterii, podnosi czułość detekcji (9). Porównując wyniki otrzymane w niniejszej pracy z zastosowaniem metody mikrorozcieńczeń w bulionie MHB/0,5% Tween, bez lub z dodatkowym odczytem stopnia redukcji rezazuryny, wykazano bowiem przewagę tej ostatniej wersji. Dyspersja badanego olejku w podłożu hodowlanym z dodatkiem 0,15% agaru powodowała dodatkowe podniesienie czułości testu (Tabela II, Tabela III). Tabela II. Wartości MIC olejków dla S. aureus 29213, wyznaczone w metodach dyfuzyjnych i mikrorozcieńczeń w bulionie. MIC (% v/v) dyfuzja w agarze rozcieńczenia w bulionie olejek MHB/T20 MHB/ MHB/ krążki studzienki MHB/T20 + R * 0,15% agar 0,15% agar + R * OL 6,25 3,125 0,78 0,39 0,39 0,195 OC 75,0 25,0 3,125 1,56 1,56 1,56 OH 12,5 1,56 0,39 0,195 0,39 0,097 OL - olejek lawendowy, OC- olejek cytrynowy, OH - olejek z drzewa herbacianego; rozcieńczenia w podłożu MHB/0,5% Tween 20 * ponowna ocena - po 2 godz inkubacji z rezazuryną Tabela III. Wartości MIC olejków dla E.coli NCTC 8196, wyznaczone w metodach dyfuzyjnych i mikrorozcieńczeń w bulionie. MIC (% v/v) dyfuzja w agarze rozcieńczenia w bulionie olejek MHB/T20 MHB/ MHB/ krążki studzienki MHB/T20 + R * 0,15% agar 0,15% agar + R * OL 25 6,25 0,195 0,195 0,097 0,097 OC ,56 1,56 1,56 1,56 OH 50 6,25 0,195 0,195 0,097 0,097 OL - olejek lawendowy, OC- olejek cytrynowy, OH - olejek z drzewa herbacianego; rozcieńczenia w podłożu MHB/0,5% Tween 20 * ponowna ocena - po 2 godz inkubacji z rezazuryną. Analiza wyników niniejszych badań sugeruje konieczność wykonania wielu badań wstępnych, mających na celu ustalenie optymalnych parametrów metodycznych doświadczeń, zapewniających otrzymanie wiarygodnego i powtarzalnego rezultatu.

7 Nr 3 Przeciwbakteryjna aktywność olejków eterycznych 287 A. Budzyńska, M. Więckowska-Szakiel, D. Kalemba, B. Sadowska, B. Różalska. THE OPTIMIZATION OF METHODS UTILIZED FOR TESTING THE ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ESSENTIAL OILS SUMMARY The antibacterial activity of essential oils: Lavandulae aetherleum, Limonis aetherleum and Melaleucae aetherleum was determined against Staphylococcus aureus Gram (+) and Escherichia coli Gram (-) bacteria, using four methods: agar diffusion (paper disk and agar wells) and broth dilution (turbidimetric and rezazurin reduction assay). This study revealed that the sensitivity of the agar diffusion techniques was much lower than the broth dilution methods. This was mainly due to partitioning of the oil components in the agar according to their affinity with water. This limitation could be lessened by the selection of suitable oil emulsifier/solvent, which itself not influence the bacterial growth. By initial oil solubilization with 96% ethanol (1:1), the increase of agar dilution methods sensitivity could be achieved. The broth microdilution methods, using 0.5% Tween 20 or 0.15% agar to emulsify the oils, were optimized and shown to be most accurate for testing their antimicrobial activity. By introducing resazurin, as an MIC endpoint indicator, the sensitivity of these methods was further enhanced. PIŚMIENNICTWO 1. Carson C F, Hammer K A, Riley TV. Melaleuca alternifolia (Tea Tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clin Microbiol Rev 2006; 19: Cavanagh HMA, Wilkinson JM. Biological activities of lavender essential oil. Phytotherapy Res 2002: 16: Fisher K, Phillips CA. The effect of lemon, orange and bergamot essential oils and their components on the survival of Campylobacter jejuni, Escherichia coli O157, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Staphylococcus aureus in vitro and in food system. J Appl Microbiol 2006; 101: Hammer K.A., Carson CF, Riley T V. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extract. J Appl Microbiol 1999; 86: Hood JR., Wilkinson JN, Cavanagh HMA. Evaluation of common antibacterial screening methods utilized in essential oil research. J Essent Oil Res Nov/Dec Inouye S. Comparative study of antimicrobial and cytotoxic effects of selected essential oils by gaseous and solution contacts. Int J Aromather 2003; 1: Kalemba D, Kunicka A. Antibacterial and antifungal properties of essential oils Curr Med Chem 2003; 10: Lahlou M. Methods to study the phytochemistry and bioactivity of essential oils. Phytother. Res. 2004; 18: Mann C.M, Markham JL. A new metod for determining the minimum inhibitory concentration of essential oils. J Appl Microbiol 1998; 84: National Commitee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Approved standard fifth edition. M7-A5 2000; Otrzymano: 22 VI 2009 r. Adres Autora: Łodź, ul. Banacha 12/16, Instytut Mikrobiologii, Biotechnologii i Immunologii UŁ

8