MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: 65-78

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2014, 66: Występowanie i charakterystyka jednofazowych pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- izolowanych w Polsce w latach * Occurrence and characterization of monophasic Salmonella enterica subsp. enterica with antigenic formula 1,4, [5], 12: i: - isolated in Poland in Grzegorz Madajczak 1, Tomasz Wołkowicz 1, Bożena Dera-Tomaszewska 2, Monika Wasiak 1, Anna Chróst, 1 Jolanta Szych 1 ** 1 Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny 2 Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Katedra Mikrobiologii Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego Pałeczki Salmonella nadal stanowią tak w naszym kraju, jak i w innych krajach Unii Europejskiej istotny etiologiczny czynnik bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego u ludzi. Od końca lat 90-tych obserwuje się coraz częstsze występowanie jednofazowych pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, charakteryzujących się opornością na antybiotyki o wzorze ASSuT. W wielu krajach europejskich drobnoustroje te stały się jednym z najczęściej izolowanych typów serologicznych. Celem badań była charakterystyka szczepów pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, izolowanych w Polsce. Wśród 110 zbadanych szczepów najczęściej obserwowano pałeczki Salmonella o fagotypie DT193 lub RDNC/DT193, charakteryzujące się wzorem oporności na antybiotyki ASSuT. Szczepy te były zróżnicowane pod względem profilu PFGE. Słowa kluczowe: Salmonella, jednofazowe, 1,4,[5],12:i:-, antybiotykooporność, PFGE, fagotypowanie, mikromacierz * Badania zostały zrealizowane w ramach projektu badawczego własnego NN sfinansowanego przez Narodowe Centrum Nauki ** Autor korespondencyjny: jszych@pzh.gov.pl, Zakład Bakteriologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego Państwowego Zakładu Higieny, ul. Chocimska 24, Warszawa

2 66 G. Madajczak i inni Nr 2 ABSTRACT Introduction: Salmonella is significant etiological agent of bacterial intestinal infections in Poland and other European Union countries. Since the 90 s increasing incidence of monophasic Salmonella antigenic formula 1,4,[5],12:i: - has been observed, which are divided into two lineages: Spanish and European. More common European lineage are characterized by antimicrobial resistance ASSuT and DT193 phagetype. In many European countries, these organisms have become one of the most commonly isolated serovars. The aim of this study was to analyze strains of Salmonella enterica subsp. enterica strains with antigenic formula 1,4,[5],12: i:-, isolated in Poland in years. Material and Methods: The material for the study was 146 Salmonella strains initially identified as Salmonella antigenic formula 1,4,[5],12:i,-, isolated in from clinical, food and animal samples. All strains has been reidentified according to the methodology routinely used in the laboratory. Serovar has been identified using classical method slide agglutination for somatic and flagellar antigens and using Check&Trace Salmonella microarray. The fljb gene, flib-flia intergenic region, selected Salmonella Pathogenicity Islands (SPIs) genes and spvc has been detected using PCR. For all strains PFGE typing with HindIII enzyme has been performed and phagetyping also. Moreover antimicrobial resistance has been evaluated by establishing of MIC according EUCAST recommendation. Results: 110 (75%) strains were S. enterica 1,4,[5],12:i,-. In this group for 17 strains in Check&Trace Salmonella microarray result of identification Salmonella Typhimurium have been obtained. All 110 strains have 1000 bp size DNA fragment with IS200 sequence, characteristic for S. Typhimurium. Only in case of 4 strains fljb gene has been detected. All strains harbor avra, ssaq, mgtc and siid genes. For 6 strains spvc gene has been not detected. 92 strains (83,6 %) have been typed as DT193, but in case of 40 strains additional reaction with phage no 18 has been observed. For 104 (94,5%) strains resistance for at least one antimicrobial have been detected. Most frequent (44 strains 40%) resistance pattern was ASSuT. Among all strains 11 pulsotypes, which group two or more strains have been recognized, which contain 37 strains. The rest of strains have unique REA-PFGE patterns. Conclusions: To this time epidemiological situation of S. enterisa 1,4,[5],12:i:- isolated from human cases in Poland has been not recognized. Results of current studies show, that studied strains belong to european non-spanish lineage of monophasic S. Typhimurium and problem of infection caused by those strains is unrecognized and probably increase. Keywords: Salmonella, monophasic, 1,4,[5],12:i:-, antimicrobial resistance, PFGE, phage typing, microarray WSTĘP Pałeczki Salmonella pomimo obserwowanej w ostatnich latach, tak w Polsce jak i innych krajach europejskich, tendencji spadkowej nadal stanowią istotny etiologiczny czynnik bakteryjnych zakażeń przewodu pokarmowego u ludzi. Zgodnie z danymi opublikowanymi przez Zakład Epidemiologii NIZP-PZH w raporcie Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce, w 2013 roku odnotowano 7577 przypadków salmonelozy (27). Wśród wykrywanych u ludzi w Polsce

3 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 67 pałeczek Salmonella, od wielu lat najczęściej izolowane są pałeczki S. Enteritidis i S. Typhimurium. Według danych EFSA/ECDC podobną sytuację obserwuje się również w innych krajach europejskich, jednak o ile do końca ubiegłego wieku pałeczki należące do typu serologicznego S. Enteritidis były odpowiedzialne za około 80% przypadków salmonelozy, o tyle od 2000 roku obserwowany jest systematyczny spadek częstości izolacji pałeczek tego serotypu. Jednocześnie widoczny jest, szczególnie w ostatnich latach wzrost udziału pałeczek S. Typhimurium w zakażeniach ludzi (6). Jest to o tyle niepokojące zjawisko, iż w przeciwieństwie do szczepów pałeczek S. Enteritidis, które w większości pozostają wrażliwe na antybiotyki i chemioterapeutyki, wśród pałeczek S. Typhimurium około 60% szczepów izolowanych od ludzi charakteryzuje się zwiększoną lekoopornością, głównie w odniesieniu do ampicyliny, tetracykliny i sulfonamidów (7). Ponadto w końcu lat 90-tych ubiegłego wieku, w kilku krajach europejskich oraz w USA zaobserwowano wystąpienie ognisk zatrucia pokarmowego wywołanych przez pałeczki Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, które dopiero po wykonaniu badań genetycznych udało się zidentyfikować jako jednofazowe S. Typhimurium (5). Drobnoustroje te, między innymi ze względu na podobieństwo w strukturze antygenowej nazywane są niekiedy Salmonella Typhimurium like. Od tego czasu daje się zaobserwować systematyczny wzrost liczby przypadków zakażeń wywołanych tymi drobnoustrojami. Według danych EFSA/ ECDC w 2011 roku pałeczki Salmonella o tym wzorze antygenowym stanowiły już trzeci co do częstości serotyp Salmonella izolowanych od ludzi, przy czym szczepy te wykazywały aż w około 90% oporność na ampicylinę, streptomycynę, tetracyklinę i sulfonamidy (18). W Polsce również obserwuje się wzrastającą liczbę szczepów pałeczek Salmonella należących do grupy O:4 posiadających w pierwszej fazie antygen rzęskowy i, które nie aglutynują z żadną surowicą dla antygenów rzęskowych drugiej fazy. Dotychczas nie było jednak wiadomo, które z nich reprezentują jednofazowy wariant pochodzący od serotypu Typhimurium a które stanowią warianty pozostałych serotypów posiadających w I fazie antygen i czyli: Lagos, Agama, Farsta, Tsevie, Glocester czy Tumodi (11). W związku z tym Zakład Bakteriologii NIZP-PZH zwrócił się do Państwowych Wojewódzkich Inspektorów Sanitarnych z prośbą o nadsyłanie wszystkich szczepów pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica izolowanych lub reidentyfikowanych w laboratoriach stacji sanitarno-epidemiologicznych, spełniających jednocześnie następujące warunki: należących do grupy serologicznej B (O:4), posiadających w pierwszej fazie antygen rzęskowy i oraz niereagujących z surowicami dla antygenów rzęskowych drugiej fazy. Celem planowanych badań była ocena występowania oraz analiza budowy antygenowej, cech chorobotwórczości oraz lekooporności szczepów pałeczek Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, izolowanych od ludzi, z żywności i od zwierząt, z wykorzystaniem technik biologii molekularnej, a w szczególności techniki hybrydyzacji na mikromacierzach w odmianie ArrayTube. Ponadto dla oceny klonalnego zróżnicowania badanych szczepów wykonano typowanie bakteriofagowe przy użyciu fagów swoistych dla pałeczek S. Typhimurium oraz rozdział genomowego DNA badanych szczepów w zmiennym polu elektrycznym (REA-PFGE). MATERIAŁ I METODY Materiałem do badań było 146 szczepów pałeczek Salmonella wstępnie rozpoznanych jako pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i,-, izolowanych w latach

4 68 G. Madajczak i inni Nr z próbek materiału klinicznego, próbek żywności oraz próbek pobranych od zwierząt, przesyłanych do laboratorium Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH z powiatowych i wojewódzkich stacji sanitarno-epidemiologicznych, z laboratorium Silliker oddział w Warszawie wykonującego komercyjnie mikrobiologiczne badania żywności oraz Państwowego Instytutu Weterynaryjnego w Puławach. Badane szczepy były niepowiązane epidemicznie. Reidentyfikacja biochemiczna i serologiczna szczepów. Szczepy reidentyfikowano zgodnie z metodyką rutynowo stosowaną w laboratorium na podstawie określenia cech biochemicznych klasycznymi testami probówkowymi oraz identyfikacji typu serologicznego na podstawie wyników aglutynacji szkiełkowej z surowicami odpornościowymi dla antygenów somatycznych i rzęskowych wg schematu White-Kauffmanna-LeMinora (11, 22). Ponadto przeprowadzono procedurę inwersji faz, tj. próbę zahamowania ekspresji antygenu rzęskowego pierwszej fazy i w celu uzyskania ekspresji antygenów rzęskowych drugiej fazy. Procedurę przeprowadzono zgodnie z metodyką rutynowo stosowaną w laboratorium, tj. szczep posiewano na półpłynne podłoże agarowe tzw. Garda, z dodatkiem surowicy monowalentnej dla antygenu H:i przy czym przed posiewem w probówce umieszczano rurkę Craiga. Po przejściu szczepu przez rurkę i uzyskaniu jego wzrostu na zewnątrz rurki dokonywano przesiewu na podłoże Garda i po inkubacji wykonywano test aglutynacji szkiełkowej z surowicami dla antygenów rzęskowych. W przypadku stwierdzenia reakcji z surowicą i świadczącej o braku zahamowania antygenu pierwszej fazy, czynność powtarzano, zwiększając koncentrację surowicy. Identyfikacja typu serologicznego Salmonella metodą hybrydyzacji na mikromacierzy w odmianie ArrayTube. Badanie wykonano przy użyciu komercyjnego zestawu Check&Trace Salmonella (CTS) (Check-Points, Holandia), zgodnie z instrukcją producenta. Identyfikacja jednofazowych szczepów Salmonella Typhimurium. Do wykrywania fragmentu międzygenowego flib-flia charakterystycznego dla Salmonella Typhimurium oraz fragmentu genu fljb zastosowano technikę PCR, zgodnie z procedurą opisaną przez Tennant i wsp. (23). Oznaczanie obecności genów chorobotwórczości. Do wykrywania fragmentów genów charakterystycznych dla pięciu wysp patogenności Salmonella (SPI 1-5) oraz plazmidowego zgrupowania genów spv zastosowano technikę PCR. Wykrywano sekwencję nukleotydową fragmentów chromosomalnych genów avra (SPI-1), ssaq (SPI-2), mgtc (SPI- 3), siid (SPI-4), sopb (SPI-5), oraz genu spvc zlokalizowanego na plazmidzie wirulencji pslt z wykorzystaniem starterów o sekwencji opublikowanej przez Huehn i wsp. (17). Analiza pokrewieństwa metodą REA-PFGE. Przeprowadzono analizę pokrewieństwa badanych szczepów poprzez oznaczanie profili restrykcyjnych genomowego DNA przy zastosowaniu elektroforezy w zmiennym polu elektrycznym (REA-PFGE). Badanie przeprowadzono zgodnie z procedurą opublikowaną przez międzynarodową sieć PulseNet (4). Profile PFGE analizowano z użyciem oprogramowania BioNumerics 6.6 (Belgia). Pokrewieństwo szczepów określano z użyciem metody Dice a oraz UPGMA. Typowanie fagowe. Typ fagowy badanych szczepów określono z zastosowaniem preparatów fagów aktywnych wobec S. Typhimurium, zgodnie z procedurą opisaną przez Anderson i wsp. (1). Izolacja DNA plazmidowego. W przypadku szczepów charakteryzujących się typem fagowym DT193/RDNC przeprowadzono procedurę izolacji DNA plazmidowego metodą minilizy. Plazmidy rozdzielano w 0,5% żelu agarozowym przy napięciu 2,5 V/cm

5 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 69 długości żelu przez 6-8 godz. Do kontroli użyto wzorcowego szczepu S. Typhimurium ATCC Oznaczanie lekowrażliwości drobnoustrojów. Lekowrażliwość badanych szczepów na wybrane leki przeciwbakteryjne określono metodą kolejnych rozcieńczeń antybiotyków w podłożu stałym Mueller-Hinton zgodnie z zaleceniami CLSI (CLSI 2012). Określono najmniejsze stężenie hamujące ich wzrost (MIC) dla ampicyliny, cefotaksymu, gentamycyny, streptomycyny, chloramfenikolu, tetracykliny, kwasu nalidyksowego, ciprofloksacyny, sulfametoksazolu i trimetoprimu. Do kontroli testu użyto referencyjnego szczepu E. coli ATCC Hodowle inkubowano przez 18 godz. w temp. 35 ºC. Interpretację wyników przeprowadzano zgodnie z zaleceniami EUCAST, oraz przy ich braku, zgodnie z wytycznymi WHO Collaborating Centre for Antimicrobial Resistance Among Foodborne Pathogens (26). Szczep uznawano za oporny jeżeli wartość MIC wynosiła dla ampicyliny > 8 mg/l, cefotaksymu >1 mg/l, gentamycyny > 4 mg/l, streptomycyny 32 mg/l, chloramfenikolu > 8 mg/l, kwasu nalidyksowego > 16 mg/l, ciprofloksacyny > 0,06 mg/l, tetracykliny >4 mg/l, sulfonamidów 512 mg/l oraz trimetoprimu >8 mg/l Wykrywanie mechanizmów lekooporności. Do wykrywania wybranych genetycznych determinantów lekooporności zastosowano technikę hybrydyzacji DNA-DNA na mikromacierzy w systemie ArrayTube AT03 (Alere). Badanie to przeprowadzono zgodnie z wytycznymi wytwórcy dla wybranych szczepów, reprezentujących odmienne profile lekowrażliwości. Geny warunkujące oporność na antybiotyki, dla których oznaczano wrażliwość metodą fenotypową przedstawiono tabeli I. Tabela I. Antybiotyki dla których określono MIC i obecne w zastosowanej mikromacierzy ArrayTube AT03 sekwencje właściwe dla genów kodujących oporność na te antybiotyki. Antybiotyk Grupa Wykrywane geny lekooporności Gentamycyna Aminoglikozydy ant2, aac3ia, aac3iva, aac6ib Streptomycyna Aminoglikozydy aada1, aada2, aada4, stra, strb Ampicilina Antybiotyki beta-laktamowe bla CTX-M-1, bla CTX-M-2, bla CTX-M-8, bla CTX-M-26, bla CTX-M-9, bla DHA, bla ACC1, bla ACC2, bla ACT1, bla FOX, bla MOX, bla MOX CMY9,bla OXA-1, bla OXA-2, bla OXA-7, bla OXA-9, bla SHV, bla CMY, bla PER-2, bla PSE-1, bla TEM, bla DHA-1, bla LEN-1 Cefotaksym Antybiotyki beta-laktamowe bla CTX-M-1, bla CTX-M-2, bla CTX-M-8, bla CTX-M-26, bla CTX-M-9, bla DHA, bla ACC1, bla ACC2, bla ACT1, bla FOX, bla MOX, bla MOX CMY9,bla OXA-1, bla OXA-2, bla OXA-7, bla OXA-9, bla SHV, bla CMY, bla PER-2, bla PSE-1, bla TEM, bla DHA-1, bla LEN-1 Chloramfenikol Chloramfenikol cata1, catb3, catb8, cat3, cmla1, flor Ciprofloksacyna Fluorochinolony qnra1, qnrb, qnrs Kwas nalidyksowy Chinolony qnra1, qnrb, qnrs Sulfametoksazol Sulfonamidy sul1, sul2, sul3 Tetracyklina Tetracykliny teta_11, tetb_11, tetc_11, tetd_1, tete_11, tetg_11 Trimetoprim Trimetoprim dfra1_21, dfra07_11, dfra12_11, dfra13_11, dfra14_21, dfra15_1, dfra17_11, dfra19_1, dfrv_21

6 70 G. Madajczak i inni Nr 2 WYNIKI Ty p o w a n i e s e r o l o g i c z n e. Do Pracowni Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Przewodu Pokarmowego Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH nadesłano 146 szczepów pałeczek Salmonella enterica, wstępnie w laboratoriah terenowych określonych jako Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-. Spośród nadesłanych szczepów do dalszych badań użyto 110 izolatów. Szczegóły dotyczące pochodzenia szczepów przedstawiono na rycinie 1. Próbki żywności 10% Próbki materiału od zwierząt 5% Próbki materiału klinicznego 85% Rycina 1. Rodzaj materiału, z którego wyizolowano szczepy Salmonella enterica subsp. enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i,-. Spośród 110 szczepów przebadanych z użyciem mikromacierzy Check&Trace, dla 17 uzyskano wynik identyfikacji Salmonella Typhimurium, dla jednego szczepu wynik Salmonella, genovar Dla pozostałych szczepów uzyskano wynik Salmonella enterica 1,4,[5],12:i:-. Dla wybranych szczepów, u których metodą agutynacji szkiełkowej uzyskano wynik S. enterica 1,4,[5],12:i:-, natomiast w metodzie hybrydyzacji na mikromacierzy uzyskano wynik Salmonella Typhimurium, przeprowadzono proces inwersji faz z zastosowaniem stężonej surowicy dla antygenu H:i. Próbę inwersji faz przeprowadzono do objętości surowicy 0,5 ml / 10 ml podłoża. U jednego szczepu stwierdzono obecność antygenu rzęskowego II-fazy H:1,2. Dla trzech kolejnych nie udało się uzyskać zahamowania ekspresji antygenu rzęskowego I-fazy H:i. Identyfikacja jednofazowych szczepów Salmonella Typhimurium. Wszystkie przebadane szczepy wykazywały obecność fragmentu o wielkości 1000 bp odpowiadającemu regionowi międzygenowemu flib-flia z sekwencją insercyjną IS200, której obecność jest charakterystyczna dla jednofazowych szczepów Salmonella Typhimurium. Jedynie 4 szczepy spośród badanych wykazywały dodatkowo obecności genu fljb kodującego antygen rzęskowy drugiej fazy. Dla jednego z nich, w wyniku wielokrotnie powtarzanego przeprowadzania procesu inwersji faz, stwierdzono obecność antygenu rzęskowego drugiej fazy H:1,2.

7 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 71 Oznaczanie obecności genów chorobotwórczości. U wszystkich spośród 110 badanych szczepów stwierdzono obecność genów avra, ssaq, mgtc, siid oraz sopb, wchodzących w skład wysp patogenności odpowiednio od SPI-1 do SPI-5. Plazmidowy gen spvc stwierdzono u 104 (92%) z tych szczepów. Analiza lekooporności. Wśród 110 badanych szczepów pałeczek Salmonella enterica o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- metodą określenia MIC u 104 szczepów (94,5%) stwierdzono oporność na jedną lub więcej substancji przeciwbakteryjnych. Określone na tej podstawie profile lekooporności przedstawiono w tabeli II. Najliczniejsza grupa 44 szczepów charakteryzowała się opornością o profilu ASSuT (40%). Drugi co do częstości profil o wzorze AST stwierdzono w przypadku 20 szczepów (18,2%), 11 szczepów charakteryzowało się opornością o wzorze ASSu (10%). Pozostałe profile były reprezentowane przez pojedyncze szczepy. Na uwagę zasługuje fakt, że 5 szczepów wykazywało oporność typu ASSuTTm, i po jednym szczepie typu ACNaCipSSuT, ACNaSSuT oraz ACGSSuTTm. Wśród badanych szczepów nie stwierdzono natomiast oporności na cefotaksym. Ogółem aż 87% spośród badanych szczepów było opornych na trzy lub więcej grup antybiotyków, czyli należało do wielolekoopornych tzw. MDR. Określenie mechanizmów lekooporności W celu określenia mechanizmów warunkujących lekooporność badanych szczepów zastosowano metodę hybrydyzacji na mikromacierzy umożliwiającą m.in. wykrywanie sekwencji nukleotydowych właściwych dla genów kodujących oporność na te antybiotyki dla których określono MIC (tabela 1). Badaniu poddano DNA uzyskane z 60 spośród 110 badanych szczepów (54,5 %). W doborze szczepów kierowano się wynikami MIC, wybierając po kilka szczepów reprezentujących każdy z profili lekooporności oraz szczep wrażliwy. Wśród badanych tą metodą szczepów 53 było na podstawie wartości MIC uznanych za oporne na ampicylinę, u 51 z nich wykryto geny bla-tem kodujące beta-laktamazy klasy A, u pojedynczych szczepów obserwowano dodatkowo obecność w genomie genów bla-mox lub bla-shv. Oporność na streptomycynę była głównie skorelowana z obecnością genów stra, strb, tylko u pojedynczych szczepów z obecnością aada1, aada2 lub aada4. Wśród 45 szczepów z fenotypowo wyrażoną opornością na tetracyklinę u 43 wykryto obecność genu tetb a u dwóch z tych szczepów stwierdzono także dodatkowo obecność genu tetg albo tete, natomiast u pozostałych nie wykryto sekwencji homologicznych dla genów oporności na tetracyklinę obecnych w mikromacierzy. Podobnie spośród 45 szczepów opornych na sulfonamidy (MIC 512 mg/l) u 38 szczepów oporność była związana z obecnością genu sul2 a u 4 z nich dodatkowo genu sul1, a u pozostałych 7 szczepów nie wykryto genów oporności. Oporność na trimetoprim była głównie skorelowana z obecnością genu dfra rzadziej dfrv, dfr12 lub dfra17 zaś szczepy oporne na chloramfenikol posiadały gen flor albo cmla1. Natomiast w DNA szczepów opornych na kwas nalidyksowy i szczepu opornego na ciprofloksacynę nie wykryto sekwecji genów qnr kodujących plazmidową oporność na fluorochinolony. Typowanie fagowe. W wyniku typowania bakteriofagowego wszystkie badane szczepy przypisano do jednego z siedmiu typów fagowych. Dominującym był typ fagowy DT193 (92 szczepy 83,6 %). Zaobserwowano jednak pewne zróżnicowanie w otrzymanych wynikach reakcji litycznych. Pięćdziesiąt dwa spośród tych 92 szczepów nie reagowało z żadnym spośród 35 fagów podstawowych, a typ fagowy (DT193) jednoznacznie określono na podstawie reakcji z fagami dodatkowymi. Pozostałe czterdzieści z nich, oprócz reakcji litycznych, charakterystycznych dla typu DT193, dodatkowo prezentowały reakcję

8 72 G. Madajczak i inni Nr 2 Tabela II. Porównanie typu fagowego i profilu oporności Profil oporności ACNaCipSSuT ACNaSSuT ASSuTTm CSSuTTm Typ fagowy (l. szczepów) ACGSSuTTm CSuTTm ASSuT ASSu STTm AST ACT NaS SuT AS AT T DT 193 (52) RDNC/DT (40) DT 120 (8) RDNC (6) DT8 (1) DT59 (1) 1 DT104L (1) 1 PTU302 (1) PTU311(1) 1 Razem z żywności: od zwierząt: W tym A- Ampicylina, C- Chloramfenikol, Cip- ciprofloksacyna,s- Streptomycyna, T- Tetracyklina, G- Gentamycyna, Na- Kwas nalidyksowy, Su- Sulfonamidy, Tm- Trimetoprim.

9 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 73 z fagiem podstawowym 18. Intensywność lizy wywołanej tym fagiem była zróżnicowana. W zależności od szczepu oceniano ją od ± do <CL. Uwzględniając jedynie reakcję lityczną z fagiem 18 szczepy te należałoby identyfikować jako RDNC (Reacted with typing phages but Did Not Confirm to any of current recognized patterns). Jednak uzyskane dla nich równocześnie reakcje z fagami dodatkowymi wskazują na typ DT193. Stąd ostatecznie na potrzeby niniejszej pracy określono je jako szczepy RDNC/DT193. Osiem spośród przebadanych szczepów (7,2%) prezentowało typ DT120, a pojedyncze szczepy odpowiednio typ DT8, DT59, DT104L, PT U302 i PT U311. Sześć szczepów (6,2%) reagowało w sposób nietypowy z fagami typującymi. Otrzymane wzory reakcji litycznych nie pozwoliły na określenie ostatecznego typu fagowego zgodnie ze schematem Andersona i wsp. (1). W związku z czym szczepy te określono mianem RDNC. I z o l a c j a D N A p l a z m i d o w e g o. Dla szczepów DT193 wrażliwych na faga 18 (fagotyp RDNC/DT193) izolowano DNA plazmidowe. U wszystkich tych szczepów stwierdzono obecność dużego plazmidu wirulencji o wielkości odpowiadającej wielkości plazmidu pslt wyizolowanego ze szczepu wzorcowego S. Typhimurium ATCC Analiza profili REA-PFGE. W przypadku 37 spośród wszystkich przebadanych tą metodą szczepów, wyróżniono 11 pulsotypów, z których każdy gromadził 2 lub więcej szczepów o takim samym profilu rozdziału fragmentów DNA metodą REA-PFGE. Najliczniej reprezentowany był pulsotyp STYMXB.0006-PL, charakterystyczny dla 7 szczepów i pulsotyp STYMXB.0004-PL typowy dla 6 spośród badanych szczepów. Pozostałe profile były reprezentowane przez pojedyncze izolaty. W przypadku niektórych spośród badanych szczepów stwierdzono korelację pomiędzy pulsotypem oraz fagotypem. Z wyjątkiem dwóch szczepów zaliczonych do pulsotypu STYMXB.0010-PL, o typach fagowych DT120 oraz RDNC pozostałe wyróżnione pulsotypy były charakterystyczne dla szczepów określonych jako DT193 lub RDNC/DT193. Szczepy reprezentujące pozostałe typy fagowe (DT8, DT59, DT104L, PT U302 i PT U311) nie należały do żadnego z wyróżnionych pulsotypów. DYSKUSJA Pierwsze doniesienia z terenu Europy o występowaniu jednofazowych pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- pochodzą z 1999 roku, z Hiszpanii (5). W następnych latach pojawiały się dalsze doniesienia o występowaniu tych drobnoustrojów w kolejnych krajach (3, 8, 16, 19, 20). Obecnie jednofazowe pałeczki S. Typhimurium, o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, stały się w większości krajów europejskich jednymi z najczęściej izolowanych od ludzi i zwierząt pałeczek Salmonella. Stanowią one tym większe zagrożenie dla zdrowia publicznego, iż w większości są w wysokim stopniu oporne na antybiotyki. Pomimo tych niepokojących danych, w Polsce do niedawna nie rozpoznawano sytuacji epidemiologicznej i epizootiologicznej związanej z występowaniem tych drobnoustrojów, aż do czasu gdy tematykę występowania w naszym kraju jednofazowych pałeczek S. Typhimurium, o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- podjęły równolegle dwa zespoły - autorzy niniejszej publikacji oraz Hoszowski i wsp. (15, 16, 25), przy czym badania drugiego z wymienionych zespołów dotyczyły występowania jednofazowych pałeczkami S. Typhimurium w próbkach pochodzących od zwierząt, paszy i środowiska. Ze względu na istniejący w Polsce system raportowania zakażeń ludzi pałeczkami Salmonella w naszym kraju brak jest informacji dotyczących liczby zakażeń wywołanych

10 74 G. Madajczak i inni Nr 2 przez pałeczki Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- (21). Jedyne dane pochodzą z elektronicznego systemu sprawozdawania wyników badań laboratoryjnych w kierunku zakażeń wywołanych przez pałeczki Salmonella, Shigella, Yersinia i Campylobacter opracowanego przez autorów obecnej pracy. Gromadzone dane ograniczają się jedynie do wyników badań wykonywanych w powiatowych i wojewódzkich stacjach sanitarno-epidemiologicznych. Biorąc więc pod uwagę, iż pałeczki Salmonella są serotypowane głównie w tychże laboratoriach, można byłoby przypuszczać, iż dane te są wiarygodne. Jednak dane gromadzone od 2011 roku, gdy autorzy niniejszej pracy wprowadzili możliwość raportowania wyhodowań szczepów pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:-, wykazują pewne rozbieżności pomiędzy liczbą przypadków raportowanych, a liczbą szczepów nadsyłanych ze stacji do NIZP-PZH, w ramach realizowanego projektu naukowego. Na przykład w 2011 roku odnotowano 16 przypadków zakażeń tymi drobnoustrojami, przy 26 izolatach nadesłanych do laboratorium jednostki realizującej projekt, a w 2012 roku 19 przypadków, przy 26 izolatach nadesłanych do badań. Charakterystyka szczepów jednofazowych pałeczek S. Typhimurium o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- izolowanych od ludzi, zwierząt i z żywności w różnych krajach wykazała, że szczepy te, należą zwykle, w zależności od regionu występowania, do jednej z dwóch linii tzw. hiszpańskiej lub europejskiej. I tak szczepy pochodzące z Hiszpanii charakteryzują się profilem oporności ACGSSuTTm i należą najczęściej do typu fagowego U302, rzadziej od innych fagotypów (5, 10), natomiast szczepy izolowane w Anglii i Walii, Francji, Niemczech, Luksemburgu należą najczęściej do typu DT 193, rzadziej DT 120 lub innych typów fagowych i posiadają wzór oporności ASSuT (1, 20, 13, 14, 24). Mechanizmy oporności na antybiotyki badanych szczepów określano z użyciem metody hybrydyzacji na mikromacierzy typu ArrayTube. W przypadku większości szczepów wykryto geny warunkujące oporność na substancje przeciwbakteryjne, stwierdzoną metodami fenotypowymi. Jednak w przypadku niektórych leków przeciwbakteryjnych nie udało się określić genów kodujących mechanizmy oporności. Tak na przykład dla streptomycyny w przypadku 17 szczepów nie stwierdzono dodatnich wyników reakcji hybrydyzacji dla genów aac, aada, ant, stra oraz strb kodujących mechanizmy warunkujące oporność na ten lek. Jest mało prawdopodobne, aby badane szczepy posiadały inne geny kodujące oporność na ten antybiotyk. Zjawisko niezgodności opisane powyżej, jednak w znacznie niższym stopniu, zaobserwowano również dla sulfonamidów, a w przypadku dwóch szczepów dla tetracykliny. Zdaniem autorów brak pełnej korelacji między wynikami badania metodą MIC a badaniem metodą hybrydyzacji mogło być spowodowane niedoskonałością samej mikromacierzy. W toku badań zaobserwowano na przykład rozbieżności pomiędzy zaleceniami producenta dotyczącymi interpretacji uzyskiwanych wyników hybrydyzacji, a uzyskiwanymi wynikami. Zgodnie z załączoną do zestawu instrukcją, a także zaleceniami Batchelor i wsp. (2) za wynik dodatni należało traktować sygnał w zakresie 0,3 0,4. Wartości poniżej 0,3 powinny być traktowane, jako ujemne. Jednak wyniki uzyskiwane przez autorów niniejszej publikacji wykazały, iż niejednokrotnie dla genów kodujących mechanizmy oporności na antybiotyki, dla których stwierdzono wartość MIC wskazującą na oporność danego szczepu, uzyskiwano sygnał hybrydyzacji o wartości zbliżonej do 0,2. Jednocześnie, w przypadku tych samych szczepów dla innych genów, kodujących oporność na leki, na które metodą fenotypową nie stwierdzono oporności, stwierdzano sygnał hybrydyzacyjny o wartości niższej niż 0,001. Obniżony zakres sygnału hybrydyzacyjnego stwierdzono także dla sond kontrolnych. Dla wykluczenia technicznego błędu badania takich szczepów powtórzono uzyskując ponownie

11 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 75 opisane zaniżone wyniki. Najbardziej prawdopodobnym wytłumaczeniem tego zjawiska mogła być zróżnicowana ilość/jakość DNA (w ramach dopuszczalnego zakresu), w którym wykrywano geny kodujące oporność na antybiotyki. Na uwagę zasługuje fakt, iż zdecydowana większość opornych na tetracyklinę szczepów badanych w niniejszej pracy posiadała gen tetb. Jedynie u dwóch szczepów stwierdzono inne geny (tete, tetg). Natomiast Batchelor i wsp. w swej publikacji prezentującej wyniki walidacji mikromacierzy, zastosowanej także w naszych badaniach, wśród badanych szczepów pałeczek Salmonella najczęściej oporność na tetracyklinę wiązali z obecnością genu tetd, podczas gdy obecność genu tetb była raczej charakterystyczna dla pałeczek E. coli (2). Z kolei Geurra i wsp. stwierdzili, iż przebadane przez nich szczepy pałeczek Salmonella 4,5,12:i:-, należące do hiszpańskiej linii jednofazowych pałeczek Salmonella, charakteryzowały się występowaniem genu teta, zlokalizowanego w DNA dużego plazmidu o wielkości 140 lub 120 kbp (12). Dla odmiany García i wsp. stwierdzili w szczepach S. enterica 1,4,[5],12:i:- obecność genu teta występującego na małym plazmidzie R o wielkości 20 kbp (9). Jednak choć jak stwierdzono w badaniach własnych wszystkie szczepy fagotypu RDNC/DT193 posiadały duży plazmid o wielkości zbliżonej do plazmidu szczepu wzorcowego S. Typhimurium ATCC , to żaden z opornych na tetracyklinę szczepów nie posiadał genu teta. Natomiast Heuhn i wsp. wśród przebadanych szczepów pałeczek Salmonella Typhimurium stwierdzili występowanie genów tetb, sul2, strab i bla-tem, podobnie jak autorzy w bieżących badaniach (17). W tej samej pracy Heuhn i wsp. opisali również występowanie w badanych szczepach genów charakterystycznych dla pięciu wysp patogenności pałeczek Salmonella. W badaniach własnych, wykorzystując w metodzie PCR startery o sekwencji zaproponowanej przez tych autorów, stwierdzono, iż badane szczepy izolowane w naszym kraju posiadały geny chorobotwórczości charakterystyczne dla wysp patogenności pałeczek Salmonella, co świadczy o ich pełnej chorobotwórczości. Wyniki te są zbieżne z wynikami uzyskanymi przez Heuhn i wsp (17), jednak autorzy ci, nie podali, czy wśród przebadanych szczepów S. Typhimurium znajdowały się szczepy jednofazowe. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że szczepy izolowane w Polsce podobnie jak inne szczepy tzw. linii europejskiej reprezentują głównie typ fagowy DT193 lub DT120, oraz najczęściej charakteryzują się opornością na ampicylinę, streptomycynę, tetracyklinę i sulfonamidy. Ten sam wzór oporności na leki przeciwbakteryjne stwierdził Hoszowski i wsp. wśród większości szczepów izolowanych od zwierząt, z paszy i z próbek środowiskowych. W pracy tych autorów nie określono fagowych typów badanych szczepów (15). Jak wcześniej wspomniano, najczęściej występującym wśród badanych w obecnej pracy szczepów typem fagowym był DT193 oraz RDNC/DT193 (tabela II). Drugi z wymienionych fagotypów różnił się od klasycznego DT193 jedynie wrażliwością na faga 18. Choć oznaczanie wrażliwości na fagi dodatkowe w przypadku wystąpienia reakcji na jeden z fagów podstawowych jest niezgodne z metodyką Andersona i wsp. (1), to w toku badań własnych z powodu braku możliwości określenia typu fagowego na podstawie reakcji litycznej występującej tylko w przypadku faga 18, co powinno skutkować określeniem takich szczepów jako RDNC, pokuszono się o wykonanie ich typowania zestawem fagów dodatkowych. Takie niestandardowe postępowanie pozwoliło na wykrycie nowego, dotychczas nieopisanego zjawiska. Analiza innych cech szczepów reprezentujących te dwa typy fagowe, w tym profile wrażliwości na antybiotyki, czy profile PFGE nie pozwalają na rozróżnienie obu grup szczepów - DT193 oraz RDNC/DT193. Wydaje się więc, że zaobserwowane zjawisko wrażliwości na faga 18 w obrębie szczepów

12 76 G. Madajczak i inni Nr 2 o fagotypie DT193 wymaga dalszych badań, które ze względu na harmonogram realizacji projektu badawczego na nie mogły być przeprowadzone w ramach niniejszych badań. Przeprowadzona analiza profili REA-PFGE wykazała znaczne zróżnicowanie badanych szczepów. Podobne wyniki były obserwowane także przez innych badaczy, np. Mandilarę i wsp. wśród szczepów jednofazowych pałeczek S. Typhimurium izolowanych w Grecji, jak i Gallati i wsp. wśród szczepów izolowanych w Szwajcarii (3, 26). Natomiast Hoszowski i wsp. wśród badanych przez siebie jednofazowych pałeczek Salmonella o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- wyodrębnili dwa pulsotypy gromadzące 95% badanych izolatów (22 izolaty) (15). Różnice pomiędzy wynikami własnymi, a wynikami uzyskanymi przez Hoszowskiego i wsp. związane są prawdopodobnie z pochodzeniem próbek. W badaniach własnych próbki pochodziły głównie ze sporadycznych przypadków zakażeń przewodu pokarmowego u ludzi, niepowiązanych epidemicznie, natomiast izolaty w badaniach Hoszowskiego i wsp. pochodziły od zwierząt, z próbek paszy i środowiska (15). Większe zróżnicowanie szczepów w badaniach własnych może także wynikać z dwukrotnie większej liczby przebadanych szczepów jak i dłuższego okresu zbierania próbek do badań. W badaniach własnych stwierdzono pewne rozbieżności pomiędzy wynikami badań fenotypowych aglutynacji szkiełkowej z surowicami dla antygenu rzęskowego 2H, a wynikami serotypowania uzyskiwanymi na mikromacierzy Check&Trace Salmonella (CTS), oraz wykrywaniem genu fljb metodą PCR. Rozbieżności te, wynikają ze sposobu, w jaki mikromacierz ta różnicuje jednofazowe pałeczki S. Typhimurium z typowymi dwufazowymi pałeczkami tego serotypu. W mikromacierzy CTS identyfikacja opiera się nie na braku lub obecności genu fljb, lecz na podstawie zróżnicowania profili fragmentów wielu różnych wybranych przez twórców mikromacierzy sekwencji genomowych. Z tego też powodu szczep o profilu charakterystycznym dla typowych pałeczek S. Typhimurium mógł być w rzeczywistości szczepem jednofazowym, który ze względu na występowanie mutacji w obrębie genu fljb lub innego genu biorącego udział w biosyntezie białek antygenu rzęskowego drugiej fazy, a niewykrywanej przez tę mikromacierz, był rozpoznawany jako S. Typhimurium. Z powyższego względu szczepy o delecji w obrębie operonu zawierającego geny antygenu rzęskowego drugiej fazy mogły być błędnie rozpoznane jako S. Typhimurium. Siedemnaście szczepów wykazujących takie rozbieżności było zróżnicowanych zarówno pod względem fagotypu, pulsotypu, jak i wzorów oporności na antybiotyki. Cztery z nich wykazywały obecność genu fljb, pozostałe zaś jego brak. Brak genu fljb zaobserwowany także przez wielu innych badaczy skutkuje trwałą niezdolnością do wytworzenia antygenu rzęskowego drugiej fazy (10, 14). Przeprowadzone badania wykazały, że zarówno klasyczna metoda aglutynacji szkiełkowej jak i zastosowanie mikromacierzy CTS do identyfikacji jednofazowych pałeczek S. Typhimurium, o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- mają ograniczoną przydatność, wydaje się, że znacznie skuteczniejszą metodą identyfikacji takich szczepów jest zastosowanie PCR do wykrywania fragmentu międzygenowego fljb-flia. Na podstawie uzyskanych wyników badań własnych, a także wyników badań Hoszowskiego i wsp. (25) w zakresie oporności na antybiotyki należy przypuszczać, iż jednofazowe pałeczki o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- izolowane w Polsce należą do linii europejskiej. Jeden ze szczepów badanych przez autorów charakteryzował się typem fagowym U302, podobnie jak jednofazowe pałeczki S. Typhimurium linii hiszpańskiej. Szczep ten jednak był wrażliwy na wszystkie antybiotyki, co wyklucza jego przynależność do wspomnianej linii.

13 Nr 2 Występowanie i charakterystyka jednofazowych Salmonella enterica 77 Jak wykazano w Polsce, podobnie jak innych krajach europejskich, występowanie wielolekoopornych jednofazowych pałeczek S. Typhimurium, o wzorze antygenowym 1,4,[5],12:i:- a zakażeniach ludzi jest istotnym problemem, który w naszym kraju powinien także znaleźć swoje odzwierciedlenie w oficjalnych raportach epidemiologicznych. Ma to szczególne znaczenie wobec narastania tego niepokojącego zjawiska, co widać w europejskich statystykach zakażeń pałeczkami Salmonella. Prawdopodobnie również w Polsce systematycznie wzrasta liczba zakażeń ludzi jednofazowymi pałeczkami S. Typhimurium, co ma choćby odzwierciedlenie w liczbie szczepów nadesłanych do Pracowni Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Przewodu Pokarmowego Zakładu Bakteriologii NIZP-PZH od momentu zakończenia zbierania szczepów w ramach realizowanego projektu tj. od stycznia 2013 roku do końca czerwca br nadesłano 40 takich szczepów. PODZIĘKOWANIA Autorzy pracy składają podziękowania wszystkim pracownikom laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych za przekazanie szczepów do badań a także dr n. wet Andrzejowi Hoszowskiemu i dr n. wet. Dariuszowi Wasylowi z Państwowego Instytutu Weterynaryjnego za udostępnienie szczepów wyizolowanych od zwierząt. PIŚMIENNICTWO 1. Anderson ES, Ward LR, de Saxe MJ, de Sa JDH. Bacteriophage-typing designations of Salmonella typhimurium J Hygiene. 1977; 78: Batchelor M, Hopkins KL, Liebana E, Slickers P i inni. Development of a miniaturised microarraybased assay for the rapid identification of antimicrobial resistance genes in Gram-negative bacteria. Int J Antimicrob Agents. 2008; 31: Bone A, Noel H, Le Hello S, Pihier N i inni. Nationwide outbreak of Salmonella enterica serotype 4,12:i:- infections in France, linked to dried pork sausage, March-May Eurosurveillance. 2010; 15: Centers for Disease Control and Prevention PulseNet. Standard Operating Procedure for PulseNet PFGE of Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli non-o157 (STEC), Salmonella serotypes, Shigella sonnei and Shigella flexneri. Dostępne na: -shigella-salmonella-pfge-protocol-508c.pdf. 5. Echeita MA. Emergence and Spread of an Atypical Salmonella enterica subsp. enterica Serotype 4,5,12:i:2 Strain in Spain. J Clin Microbiol. 1999; 37: European Food Safety Authority, European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union Summary Report on Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Food-borne Outbreaks in EFSA J 2014; 12: European Food Safety Authority. Trends and Sources of Zoonoses, Zoonotic Agents and Foodborne Outbreaks in EFSA J. 2012;10(3): Gallati C, Stephan R, Hächler H, Malorny B i inni. Characterization of Salmonella enterica subsp. enterica serovar 4,[5],12:i:- clones isolated from human and other sources in Switzerland between 2007 and Foodborne Pathog Dis. 2013; 10: García P, Hopkins KL, García V, Beutlich J i inni. Diversity of Plasmids Encoding Virulence and Resistance Functions in Salmonella enterica subsp. enterica Serovar Typhimurium Monophasic Variant 4,[5],12:i:- Strains Circulating in Europe. PLoS One. 2014; 9: e89635.

14 78 G. Madajczak i inni Nr García P, Malorny B, Hauser E, Mendoza MC, Rodicio MR. Genetic types, gene repertoire, and evolution of isolates of the Salmonella enterica serovar 4,5,12:i:- Spanish clone assigned to different phage types. J Clin Microbiol. 2013; 51: Grimont PAD, Weill FX. Antigenic formulae of the Salmonella serovars. 9th ed. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur, Paris, France. Paris: WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Institut Pasteur; Guerra B, Soto SM, Argüelles JM, Mendoza MC. Multidrug resistance is mediated by large plasmids carrying a class 1 integron in the emergent Salmonella enterica serotype 1,4,5,12:i:-. Antimicrob Agents Chemother. 2001; 45: Hopkins KL, de Pinna E, Wain J. Prevalence of Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in England and Wales, Eurosurveillance. 2012; 17: Hopkins KL, Kirchner M, Guerra B, Granier SA i inni. Multiresistant Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Europe: a new pandemic strain? Eurosurveillance. 2010; 15: Hoszowski A, Samcik I, Lalak A, Skarżyńska M i inni. Charakterystyka jednofazowych izolatów Salmonella enterica serowar Typhimurium (1,4,[5],12:i :-). Med Wet. 2014; 70: Hoszowski A, Wasyl D. Znaczenie epidemiologiczne oraz identyfikacja jednofazowych szczepów. Med Wet. 2011; 67: Huehn S, La Ragione RM, Anjum M, Saunders M i inni. Virulotyping and antimicrobial resistance typing of Salmonella enterica serovars relevant to human health in Europe. Foodborne Pathog Dis. 2010; 7: Hugas M, Beloeil P. Controlling Salmonella along the food chain in the European Union - progress over the last ten years. Eurosurveillance. 2014; 19: Mandilara G, Lambiri M, Polemis M, Passiotou M, Vatopoulos A. Phenotypic and molecular characterisation of multiresistant monophasic Salmonella Typhimurium. Eurosurveillance. 2013; 18: Mossong J, Marques P, Ragimbeau C, Huberty-Krau P i inni. Outbreaks of monophasic Salmonella enterica serovar 4,[5],12:i:- in Luxembourg, Eurosurveillance ; 12: Sadkowska-Todys M, Czarkowski MP. Salmonelozy w Polsce w 2011 roku. Przegl Epidemiol. 2013; 67: Szych J, Madajczak G. Zakażenia i zatrucia wywołane przez bakterie rosnące w warunkach tlenowych. In: Jagielski M, editor. Etiologia, obraz kliniczny i diagnostyka ostrych zakażeń przewodu pokarmowego oraz zatruć pokarmowych. I. Warszawa: Fundacja Pro Pharmacia Futura; str Tennant SM, Diallo S, Levy H, Livio S i inni. Identification by PCR of non-typhoidal Salmonella enterica serovars associated with invasive infections among febrile patients in Mali. PLoS Negl Trop Dis. 2010; 4:e Trüpschuch S, Laverde Gomez J, Ediberidze I, Flieger A, Rabsch W. Characterisation of multidrugresistant Salmonella Typhimurium 4,[5],12:i:- DT193 strains carrying a novel genomic island adjacent to the thrw trna locus. Int J Med Microbiol. 2010; 300: Wasyl D, Hoszowski A. Occurrence and characterization of monophasic Salmonella enterica serovar typhimurium (1,4,[5],12:i:-) of non-human origin in Poland. Foodborne Pathog Dis. 2012; 9: WHO Collaborating Centre for Antimicrobial Resistance Among Foodborne Pathogens PROTO- COL for - serotyping and antimicrobial susceptibility testing of Salmonella. Dostępne na: Zakład Epidemiologii NIZP-PZH. Choroby zakaźne i zatrucia w Polsce. Dostępne na: Otrzymano: 4 VII 2014 r Adres Autora: Warszawa, ul. Chocimska 24, Zakład Bakteriologii NIZP-PZH