Czy diagnostyka molekularna zakażeń grzybiczych ma znaczenie praktyczne? Anita Hryncewicz-Gwóźdź

Transkrypt

1 Czy diagnostyka molekularna zakażeń grzybiczych ma znaczenie praktyczne? Anita Hryncewicz-Gwóźdź

2 Diagnostyka mikologiczna klasyczna

3 Badanie bezpośrednie Zeskrobiny ze zmian skórnych Zeskrobiny z materiału pod płytką paznokciową Widoczne nici grzybni Włosy Widoczne zarodniki o układzie endothrix lub ectothrix. Fluorescencja w lampie Wood a (UV 366nm)

4 Lampa Wooda (UV 366nm) M. canis zielona fluorescencja Możliwy nieprawidłowy odczyt: nie myć głowy przed badaniem, prawidłowe zaciemnienie pomieszczenia w którym przeprowadza się badanie. Inne substancje mogą powodować fluorescencję: dezodoranty, mydła, maści z petrolum Obecność Malassezia żółta fluorescencja

5 Badanie bezpośrednie

6 Badanie bezpośrednie - włos Układ zarodników ectothrix Układ zarodników endothrix

7 Hodowla Podłoże podstawowe- Sabourauda (pepton, glukoza, agar, chloramfenikol, aktidion) obserwacja 14 do 28 dni. Podłoże DTM (dermatophyt test medium) 1. Cechy makroskopowe hodowli 2. Cechy mikroskopowe 3. Dodatkowe testy umożliwiające różnicowanie gatunków

8 Test ureazowy na podłożu Chritensena T mentagrophytes zmienia barwę podłoża na czerwoną T rubrum nie zmienia barwy podłoża (uwaga: zanieczyszczenia bakterie zmieniają barwę podłoża)

9 Test włosowy T mentagrophyes - wynik dodatni T rubrum wynik ujemny

10 Podłoże płynne Sabourauda T. rubrum rośnie na dnie T. mentagrophytes rośnie na powierzchni (zanieczyszczenie pleśniowe rosną na powierzchni)

11 Podłoże ziemniaczane intensywniejsze zabarwienie podłoża przez T. rubrum

12 Czas niezbędny do wykonania badania mikologicznego metodą klasyczną Hodowla do 4 tygodni Testy dodatkowe ok. 1 tydzień Długi okres oczekiwania na wynik badania Możliwość kontaminacji przez grzyby środowiskowe w trakcie hodowli i wykonywania testów dodatkowych

13 Diagnostyka mikologiczna molekularna Krótki czas trwania badania - kilka godzin. Wysoka specyficzność i czułość.

14 Metody molekularne Określanie gatunku grzyba uzyskanego w hodowli na podłożach laboratoryjnych Wykrycie obecności grzyba w materiale uzyskanym od pacjenta Typowanie genetyczne szczepów np. T. rubrum w celach epidemiologicznych

15 Metody molekularne w diagnostyce dermatofitów Sekwencjonowanie DNA ustalenie gatunku grzyba z hodowli PCR amplifikacja fragmentów DNA wykrycie obecności grzyba w materiale biologicznym, ustalenie gatunku grzyba z hodowli Inne metody jak RFLP, RAPD typowanie genetyczne szczepów w obrębie gatunku

16 Sekwencjonowanie DNA Umożliwia ustalenie gatunku grzyba z hodowli (w przypadku trudności identyfikacji gatunku metodami klasycznymi brak charakterystycznych struktur grzybni, brak zarodników) Sekwencjonowanie fragmenu 28S rybosomalnego DNA GenBank database MicroSeq D2 Fungal database

17 PCR amplifikacja fragmentów DNA Powielanie wybranego fragmentu łańcucha DNA przy użyciu specyficznych starterów. Możliwe jest wykrycie obecności w badanym materiale minimalnych ilości poszukiwanego odcinka DNA. Detekcja produktu amplifikacji: elektroforeza produktu amplifikacji w żelu agarozowym i określenie jego wielkości na podstawie wysokości położenia prążka w żelu.

18 PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Cel molekularny amplifikacji: Rybosomalne DNA Gen kodujący syntazę chityny Gen kodujący topoizmerazę II Sekwencje mikrosatelitarne Real time PCR

19 PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Rybosomalne DNA Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol Apr;45(4): Trichophyton rubrum Turenne CY, Sanche SE, Hoban DJ, Karlowsky JA, Kabani AM. Rapid identification of fungi by using the ITS2 genetic region and an automated fluorescent capillary electrophoresis system. J Clin Microbiol Jun;37(6):

20 PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Gen kodujący syntazę chityny Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol Apr;45(4): Dermatofity Kano R, Hirai A, Muramatsu M, Watari T, Hasegawa A. Direct detection of dermatophytes in skin samples based on sequences of the chitin synthase 1 (CHS1) gene. J Vet Med Sci Feb;65(2):

21 PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Gen kodujący topoizmerazę II Kanbe T, Suzuki Y, Kamiya A, Mochizuki T, Fujihiro M, Kikuchi A. PCR-based identification of common dermatophyte species using primer sets specific for the DNA topoisomerase II genes. J Dermatol Sci Aug;32(2):

22 PCR łańcuchowa reakcja polimerazy Sekwencje mikrosatelitarne (tandemowe powtórzenia składające się z dwu-, trzy- lub czteronukleotydowych sekwencji zwanych motywami) Kardjeva V, Summerbell R, Kantardjiev T, Devliotou-Panagiotidou D, Sotiriou E, Gräser Y. Forty-eight-hour diagnosis of onychomycosis with subtyping of Trichophyton rubrum strains. J Clin Microbiol Apr;44(4): Brasch J, Beck-Jendroschek V, Gläser R. Fast and sensitive detection of Trichophyton rubrum in superficial tinea and onychomycosis by use of a direct polymerase chain reaction assay. Mycoses Sep;54(5):e313-7.

23 Opracowanie metody wykrywania dermatofitów w materiale od pacjenta, dla rutynowej diagnostyki labolatoryjnej Mała ilość etapów procedury ograniczenia ryzyka kontaminacji Prostota wykonania możliwość wdrożenia do laboratorium

24 Dostępne zestawy do wykrywania grzybów w materiale klinicznym Statens Serum Institut (Dania) Biotype Diagnostic GmbH (Niemcy)

25 Statens Serum Zestaw zawiera odczynniki wystarczające na przeprowadzenie 100 multipleksowych reakcji PCR. Institut

26 Duplex PCR Wykrywa: Dermatofity (pan-dermatophytes) Trichophyton rubrum. Przeznaczony do badania zakażenia paznokci stóp

27 Zastosowanie testu umożliwia wykrycie w materiale biologicznym DNA dermatofitów i Trichophyton rubrum w ciągu 5 godzin. Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol Apr;45(4):

28 Mieszanina starterów zawiera dwie pary starterów które zapoczątkowują amplifikację genów: syntetazy 1 chityny w celu wykrycia obecności dermatofitów ITS1 (internal transcribed spacer) w celu wykrycia T. rubrum

29 Wewnętrzna kontrola(~660 bp) Pan-dermatophytes (366 bp) T. rubrum (203 bp) studzienka 1: Marker molekularny DNA100 bp 2: DNA genomowe dermatofitów (Kontrola 1) 3: DNA genomowe dla T. rubrum (Kontrola 2) 4: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów 5: materiał z paznokcia dodatni w kierunku dermatofitów 6: materiał z paznokcia dodatni w kierunku T. rubrum 7: materiał z paznokcia ujemny. Badana próbka paznokcia pozytywna w kierunku T. rubrum daje najczęściej silny sygnał na wysokości 203 par zasad i słabszy (bądź zerowy) sygnał na wysokości 366 par zasad z powodu wysokiej liczby kopii regionu ITS1 w porównaniu z regionem chs1.

30 Reakcji multipleks-pcr, w skład której wchodzi mieszanina starterów zaprojektowanych dla genów specyficznych dla różnych gatunków lub rodzajów grzybów. Dermatofity, drożdże i grzyby pleśniowe

31 Epidermophyton floccosum Microsporum canis Microsporum gypseum T. rubrum T. interdigitale T. spp. Arthroderma benhamiae Candida spp. C. albicans C. tropicalis C. glabrata C. krusei C. guilliermondii C. parapsilosis Trichosporon cutaneum Scopulariopsis brevicaulis Aspergillus spp. A. fumigatus A. flavus A. niger A. Versicolor

32 Mieszanina wielu par starterów

33

34 Porównanie metod klasycznej i molekularnej

35 Porównanie PCR i metody klasycznej 118 pacjentów z onychomykozą Duplex PCR Pan-dermatophytes T. rubrum KOH 38.1 % 22.9 % hodowla PCR 42.4 % 41.5 % Wzrost wykrywalności 4.3 % 18.6 % Brillowska-Dabrowska A, Saunte DM, Arendrup MC. Five-hour diagnosis of dermatophyte nail infections with specific detection of Trichophyton rubrum. J Clin Microbiol Apr;45(4):

36 Porównanie PCR i metody klasycznej PCR + Hodowla + Duplex PCR 107 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy 77 (72%) 63 T.rubrum 14 pan-dermatophytes 57 (53%) 38 (35%) dermatofity 19 niedermatofity Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 37% Chandran NS, Pan JY, Pramono ZA, Tan HH, Seow CS. Complementary role of a polymerase chain reaction test in the diagnosis of onychomycosis. Australas J Dermatol May;54(2): Singapore

37 Porównanie PCR i metody klasycznej Duplex PCR 177 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy Hodowla 59 (34%) PCR 78 (44%) Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 10% Kondori N, Abrahamsson AL, Ataollahy N, Wennerås C. Comparison of a new commercial test, Dermatophyte-PCR kit, with conventional methods for rapid detection and identification of Trichophyton rubrum in nail specimens. Med Mycol Nov;48(7): Göteborg,Sweden

38 Porównanie PCR i metody klasycznej 120 próbek z paznokci Kliniczne podejrzenie grzybicy KOH Hodowla PCR 35 (29,2%) 12 (10%) PCR pan-dermatophyt Gen topoizomerazy II 48 (40%) Wzrost wykrywalności dermatofitów w PCR w porównaniu z hodowlą wynosi 30% Luk NM, Hui M, Cheng TS, Tang LS, Ho KM. Evaluation of PCR for the diagnosis of dermatophytes in nail specimens from patients with suspected onychomycosis. Clin Exp Dermatol Apr;37(3): Hong Kong

39 Porównanie PCR i metody klasycznej Nested PCR Sekwencjonowanie fragmentu 28S rdna Hodowla+ Hodowla + PCR+ Hodowla PCR+ Hodowla- Głowa Skóra Paznokcie W 7 przypadkach przy pomocy PCR zweryfikowano błedne rozpoznanie gatunku ocenianego na podstawie hodowli Verrier J, Krähenbühl L, Bontems O, Fratti M, Salamin K, Monod M. Dermatophyte identification in skin and hair samples using a simple and reliable nested polymerase chain reaction assay. Br J Dermatol Feb;168(2): Lausanne, Switzerland

40 Porównanie PCR i metody klasycznej PCR pan-dermatophyt PCR gatunek Multiplex PCR Przebadano 107 próbek ze skóry gładkiej, głowy, paznokci z podejrzeniem grzybicy KOH Hodowla PCR Pan- dermatophyt PCR gatunek Multiplex PCR Pandermatophyt Multiplex PCR gatunek Wrocław Praca doktorska Katarzyna Kalinowska

41 Możliwości diagnostyczne z użyciem dostępnych komercyjnie testów PCR Materiał biologiczny dermatofity. Dermatophyte PCR KIT, MycoDermQS PCR Amplification KIT T. rubrum Dermatophyte PCR KIT. Wysoka przydatność w rozpoznaniu grzybicy paznokci stóp (T. rubrum jest najczęstszym patogenem), MycoDermQS PCR Amplification KIT E. floccosum, M. canis M. gypseum T. rubrum, T. interdigitale, Trichophyton spp. MycoDermQS PCR Amplification KIT. Znaczna ilość gatunków dermatofitów brak możliwość detekcji przy zastosowaniu dostępnych komercyjnie testów opartych na metodzie PCR

42 Opracowywanie dalszych testów PCR Diagnostyka grzybicy skóry owłosionej głowy większa wrażliwość Trichophyton niż Microsporum na terbinafinę. Brillowska-Dabrowska A, Swierkowska A, Lindhardt Saunte DM, Arendrup MC. Diagnostic PCR tests for Microsporum audouinii, M. canis and Trichophyton infections. Med Mycol May;48(3): Brillowska-Dabrowska A, Michałek E, Saunte DM, Nielsen SS, Arendrup MC. PCR test for Microsporum canis identification. Med Mycol Aug;51(6):576-9.

43 Schemat diagnostyki mikologicznej z wykorzystaniem metod klasycznych i molekularnych opracowany przez Brillowską-Dabrowską A.

44 Znaczenie metod molekularnych Metody molekularne łącznie z metodami klasycznymi powinny być wykorzystywane w laboratoriach mikologicznych Wykorzystanie metod molekularnych może prowadzić do zmniejszenia ilości próbek badanych metodami klasycznymi. W przyszłości laboratorium mikologiczne które będzie wykonywało badania bezpośrednie, hodowle i będzie korzystało z metod molekularnych umożliwi szybką i poprawną identyfikacje gatunkową.

45 Przypadki kliniczne, w których dla oznaczenia gatunku dermatofita zastosowano metodę molekularną

46 Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo-krostkowymi Przypadek kliniczny 5 letnia dziwczynka W krótkim czasie rozwinął się kerion Celsi w okolicy ciemieniowo skroniowej W wywiadzie nie podawano kontaktu z dziećmi lub zwierzętami z zakażeniem grzybiczym

47 Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny Po miesiącu utrzymywania się zmian na skórze owłosionej głowy pojawiły się wykwity rumieniowe, grudkowe i krostkowe na twarzy

48 Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny następnie na tułowiu i kończynach

49 Grzybica głowy z towarzyszącymi rozsianymi zmianami grudkowo krostkowymi Przypadek kliniczny Badanie mikologiczne ze zmiany w skórze owłosionej głowy dodatnie Bezpośrednie: zarodniki o układzie endothrix T. tonsurans (hodowla, metoda PCR) Dermatofit antropofilny Wywołuje grzybicę głowy PCR for T. tonsurans (173 bp) J. Brasch (najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w USA i Wielkiej Brytanii) Leczenie Terbinafina 125 mg/dobę przez 12 tygodni

50 Tinea incognito Przypadek Tinea Gladiatorum 23 letni pacjent Skierowany do Kliniki Dermatologicznej z podejrzeniem Erythema gyratum repens Trenował zapasy Pierwsze zmiany rumieniowo złuszczające w okolicy skroniowej pojawiły się rok wcześniej. Leczone miejscowo preparatami przeciwgrzybiczymi (bez diagnostyki mikologicznej). Nawrót zmian zlokalizowanych na skórze owłosionej głowy i ramionach.

51 Tinea incognito Przypadek Podejrzewano podłoże alergiczne zmian skórnych. Pacjentowi ordynowano leczenia kortykosteroidam miejscowe i ogólne. Stopniowo zmiany uległy dalszemu rozsiewowi, zajmowały tułów, twarz i kończyny.

52 Tinea incognito Przypadek Badanie mikologiczne: dodatnie T. tonsurans. Dermatofit antropofilny Wywołuje zakażenie skóry owłosionej głowy (najczęstszy czynnik etiologiczny grzybicy głowy w USA i Wielkiej Brytanii) W Polsce stanowi 4,6% dermatofitów (w Europie 1%) Zakażenia wśród sportowców trenujących zapasy. Terapia: terbinafina 4 tygodni, miejscowo preparaty azolowe. PCR dla T. tonsurans (173 bp)

53 Podsumowanie Zastosowanie procedur wykorzystujących metody klasyczne i molekularne w laboratoriach mikologiczych skrócą czas oczekiwania na wynik badania i zwiększą ich czułość. Metody molekularne są pomocne w oznaczeniu gatunku grzyba uzyskanego w hodowli (w przypadkach wątpliwych - pleomorfizm). Typowanie genetyczne szczepów dermatofitów umożliwi prowadzenie dokładniejszych badan epidemiologicznych.