liwości drobnoustrojów. Szczepy wielolekooporne. rednia- serologiczna powodowanych przez bakterie, wirusy i grzyby.

Transkrypt

1 Badanie lekowrażliwo liwości drobnoustrojów. Szczepy wielolekooporne. Diagnostyka pośrednia rednia- serologiczna diagnostyka zakażeń i chorób b zakaźnych powodowanych przez bakterie, wirusy i grzyby. Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM Kornelia Dobrzaniecka Lekowrażliwość Antybiotyki -naturalne związki organiczne wytwarzane przez drobnoustroje; także syntetyczne lub półsyntetyczne, stosowane jako leki przeciwdziałające infekcjom wywoływanym przez drobnoustroje chorobotwórcze (najczęściej bakterie, ale także grzyby i pierwotniaki).

2 Chemioterapeutyki są to związki stworzone w sposób czysto chemiczny, brak ich odpowiedników w naturze. Linezolid, fluorochinolony, sulfonamidy, trimetoprim Mechanizm działania ania Blokowanie syntezy DNA ( fluorochinolony, metronidazol) Blokowanie polimerazy RNA (rifampicyna) Blokowanie biosyntezy białka (makrolidy, chloramfenikol, aminoglikozydy) Blokowanie biosyntezy ściany komórkowej (wankomycyna, antybiotyki beta-laktamowe) Uszkodzenie błony protoplazmatycznej (polimyksyny, polieny) Konkurencyjne wnikanie w łańcuch metaboliczny (sulfonamidy)

3 Zakres działania Wąskie spektrum- ograniczone np. do ziarenkowców, pałeczek Gram-ujemnych, beztlenowców. Szerokie spektrum- bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne oraz beztlenowce. Spektrum- zakres aktywności antybiotyku wobec jednego lub większej liczby gatunków bakterii. Nabycie przez drobnoustrój mechanizmu oporności może zmienić wzór jego wrażliwości na dany antybiotyk, a niekiedy także na inne i w związku z tym zmienić zakres aktywności antybiotyku. Działanie Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu w taki sposób na jej metabolizm, aby ograniczyć jej możliwości rozmnażania się (działanie bakteriostatyczne).

4 Główne grupy antybiotyków i chemioterapeutyków 1 B-laktamy penicyliny, penicyliny z inhibitorem, cefalosporyny/cefamycyny, monobaktamy, trójbaktamy, karbapenemy, penemy 2 Aminoglikozydy streptomycyna, neomycyna, kanamycyna, gentamycyna, tobramycyna, netylmycyna, isepamycyna, amikacyna 3 Tetracykliny doksycyklina, tetracyklina, minocyklina 4 Makrolidy/ketolidy stare: nowe: ketolidy: erytromycyna, spiramycyna, josamycyna cykliczny węglan erytromycyny (Dawercin), roksytromycyna, klarytromycyna, azytromycyna, dirytromycyna trolitromycyna 5 Linkozamidy linkomycyna, klindamycyna 6 Streptograminy pristinamycyna, chinupristina, dalfopristina 7 Oksazolidynony linezolid 8 Glikopeptydy wankomycyna, teikoplanina 9 Chloramfenikol detreomycyna 10 Polimiksyny kolistyna 11 Ansamycyny rifampicyna 12 Sulfonamidy kotrimoksazol 13 Nitroimidazole metronidazol, ornidazol 14 Nitrofurany nitrofurantoina, furagin, nifuroksazyd 15 Chinolony kwas pipemidynowy, norfloksacyna, pefloksacyna, ciprofloksacyna, ofloksacyna, lewofloksacyna, sparfloksacyna, moksifloksacyna, gemifloksacyna 16 Kwas fusydowy 17 Glicylcykliny tygecyklina 18 Fosfomycyna trometamol fosfomycyny Leki przeciwgrzybicze polieny: nystatyna, amfoterycyna B azole: flukonazot, itrakonazol, ketokonazol, ekonazol, worikonazol antymetabolity: 5-fluorocytozyna Leki przeciwwirusowe acyklowir, didanozyna, famcyklowir, gancyklowir, indinawir, lamiwudyna, nalfinawir, ritonawir, sakwinawir, stawudyna, zalcytabina, zydowudyna

5 1. Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych mutacje poryn 2. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyków Mechanizmy oporności 3. Aktywny transport antybiotyków: bakterie pobierają aktywnie antybiotyki hamujące syntezę białka - wzrost stężenia wewnątrzkomórkowego efekt: aktywne wypompowywanie antybiotyków z cytoplazmy- EFLUKS 4. Modyfikacja celów działania antybiotyków 5. Regulacja ekspresji genów oporności 6. Transfer genów oporności Mutacje istniejących genów Nabycie nowych genów (w obrębie jednego gatunku) - tansdukcja (bakteriofagi) - transformacja (np. S. pneumoniae - oporność na pencylinę) Międzygatunkowy i międzyrodzajowy transfer genów oporności - plazmidy - koniugacyjne transpozony Oznaczanie lekowrażliwo liwości: 1. Metoda jakościowa: Metoda dyfuzyjno-krążkowa- nasączone antybiotykiem krążki bibuły, 2. Metoda ilościowa: Metoda dyfuzyjna- pasek nasączony gradientem stężeń (E-test) Metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym lub płynnym Systemy automatyczne np. Vitek

6 Metoda seryjnych rozcieńczeń w probówkach Ryc. D. Dzierżanowska Antybiotykoterapia praktyczna ; alfa-medica press, 2009 Wartość MIC wynosi 2 mg/l EUCAST ang. European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing Jest profesjonalnym, naukowym komitetem, agendą Europejskiego Centrum Profilaktyki i Kontroli Zakażeń- ECDC, zajmującym się opracowywaniem jednolitych, zharmonizowanych wytycznych interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów, obowiązujących we wszystkich krajach Unii Europejskiej. Zadaniem Zespołu ds. oznaczania lekowrażliwości zgodnie z zaleceniami EUCAST jest koordynacja wprowadzania w Polsce zaleceń EUCAST, dotyczących metodyki i interpretacji wyników oznaczania lekowrażliwości drobnoustrojów.

7 Antybiogram- badanie laboratoryjne, mające na celu określenie wrażliwości obecnych w próbce bakterii na antybiotyki. Bakterie z pobranych wydzielin, np. z plwociny, hoduje się na specjalnych pożywkach i bada się ich wzrost w obecności różnych antybiotyków. Antybiogramy wykonuje się przy ciężkich lub nawracających infekcjach. Coraz więcej szczepów bakterii jest odpornych na niektóre antybiotyki, wskutek często niepotrzebnego ich stosowania. Skala McFarlanda- zastosowanie do przygotowania zawiesiny drobnoustrojów. Zawiesina może być użyta do identyfikacji biochemicznej z zastosowaniem komercyjnych testów biochemicznych Oznaczanie lekowrażliwości szczepów Antybiogram- metoda dyfuzyjno-krążkowa Podłoże MHA (MHF), zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-24h, w temp. 35 C± 2 C, w atmosferze tlenowej Dyfuzja antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście. Im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa.

8 Pasek nasączony gradientem stężeń (E- test)- metoda służąca do ustalenia najmniejszego stężenia antybiotyku hamującego wzrost drobnoustroju. MIC- jest to najmniejsze stężenie środka hamującego wzrost drobnoustrojów, wyrażone w mg/l, (odnosi się zazwyczaj do bakterii i grzybów). MIC jest parametrem charakteryzującym leki przeciwbakteryjne. MBC- minimalne stężenie bakteriobójcze. Jest to najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów.

9 Szczepy alarmowe W trakcie pobytu pacjenta w szpitalu może dojść do rozwinięcia zakażenia, które jest bezpośrednim wynikiem hospitalizacji. Może się ono ujawnić po opuszczeniu szpitala oraz dotyczyć personelu medycznego bądź osób odwiedzających. Czynnikami etiologicznymi zakażeń szpitalnych mogą być zarówno bakterie, jak i wirusy, a także grzyby i pasożyty. Testy specjalne- wykrywanie mechanizmów oporności: Pałeczki Gram-ujemne ESBL ( extended spectrum β-lactamase) Enzymy zdolne do hydrolizy penicylin, cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn) i monobaktamów ESBL są hamowane przez inhibitory Beta-laktamaz Beta-laktamazy typu ESBL są najczęściej kodowane przez duże plazmidy, co ułatwia ich szybkie rozprzestrzenianie się

10 MBL (metalo-β-lactamase) Charakteryzują się obecnością jonu cynku (Zn2+ ) w centrum aktywnym. Inhibitorem jest EDTA (związek chelatujący), który wiąże metal powodując zmianę wrażliwości szczepu na β-laktamy. Cechą charakterystyczną jest zdolność do rozkładu karbapenemów. Geny kodujące te enzymy znajdują się na chromosomie, lub rzadziej, na plazmidzie KPC- wykrywanie karbapenemaz serynowych, klasy A Interpretacja: wynik dodatni KPC (+) - różnica stref wokół krążka z meropenemem (MEM) i kwasem boronowym oraz samym MEM wynosi 4mm lub więcej (Enterobacteriaceae) lub 7mm lub więcej (w przypadku pałeczek niefermentujących) MEM 10 + kwas boronowy MEM 10

11 KPC Karbapenemazy typu KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemasae) hydrolizują wszystkie karbapenemy i wszystkie pozostałe antybiotyki β-laktamowe. Występować mogą najczęściej u szczepów Klebsiella pneumoniae, oxytoca ale także pałeczek Enterobacteriacae i Pseudomonas (aeruginosa, putida). Szczepy Klebsiella pnemoniae KPC+ są zazwyczaj wrażliwe jedynie na kolistynę, tygecyklinę, gentamycynę i czasem amikacynę. Karbapenemazy klasy D, czyli CHDL, OXA-48 Zdolne do hydrolizy karbapenemów. Występują głównie u pałeczek Acinetobacter, ale również zostały wykryte u Enterobacteriaceae. CHDL mają stosunkowo słabą aktywność wobec karbapenemów, a poza nimi hydrolizują jeszcze tylko penicyliny i cefalosporyny I generacji. Temocylina TEM 30µg Szczep podejrzany o wytwarzanie OXA-48: Strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z TEM wynosi 10mm lub mniej

12 Enterococcus spp. VRE ( vancomycin resistant enterococci) Mechanizm oporności na wankomycynę wykształcony u Enterococcus Staphylococcus spp. Gronkowce oporne na metycylinę: MRSA (methicillin resistant S. aureus), MRCNS (methicillin resistant coagulase-negative staphylococci) W metodzie dyfuzji antybiotyku z krążka wykorzystuje się krążki zawierające cefoksytynę (30 µg). Stosowanie krążków z cefoksytyną ma na celu odróżnienie typowych szczepów MRSA od szczepów wskazujących oporność na metycylinę, ale wrażliwych na cefalosporyny. Przyjęto odrębne kryteria do oceny metycylinooporności u szczepów S. aureus i u gronkowców koagulazo-ujemnych (CNS).

13 Charakterystyczne typy oporności bakterii na antybiotyki. Charakterystyczne typy oporności bakterii na antybiotyki.

14 Diagnostyka pośrednia Mikrobiologia dała początek immunologiimłodej, dynamicznie rozwijającej się nauce. Immunologia zajmuje się poznaniem budowy i funkcjonowaniem układu odpornościowego. Nauka zajmująca się reakcjami zachodzącymi między antygenami a przeciwciałami to serologia. Miano przeciwciał- pomiar ilości przeciwciał w badanej surowicy odpornościowej; Miano przeciwciał wyznacza dodatnia reakcja antygenu z przeciwciałem, uzyskana przy największym rozcieńczeniu surowicy; Jeżeli np. reakcja obserwowana jest w rozcieńczeniu surowicy 1 : 256, miano wynosi 256 jednostek.

15 Reakcje antygen przeciwciało 1. Reakcja precypitacji 2. Reakcja flokulacji 3. Reakcja aglutynacji (hemaglutynacji) 4. Odczyn hamowania hemaglutynacji 5. Reakcja immunofluorescencji- IF 6. Reakcje immunoenzymatyczne 7. Reakcje radioimmunologiczne Metoda immunoenzymatyczna Oparta na znakowaniu, czyli związaniu antygenu lub przeciwciała z enzymem. Powstający kompleks antygenprzeciwciało-enzym jest wykrywany po dodaniu bezbarwnego substratu, który trawiony enzymem daje barwny produkt. Reakcja barwna jest odczytywana wizualnie lub w spektrofotometrze.

16 ELISA Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu enzymu związanego ze specyficznym przeciwciałem katalizowana jest reakcja, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie. Metoda jakościowa i ilościowa. Metoda immunofluorescencji Jest metodą wykrywania przeciwciał w surowicy przy pomocy przeciwciał lub antygenów znakowanych barwnikiem fluoryzującym-izotiocyjanian fluoresceinyktóry absorbuje światło o określonej długości fali i emituje energię w postaci światła widzialnego (zielone).

17 Zastosowanie Diagnostyka pośrednia- wykrycie przeciwciał swoistych (monoklonalnych) Diagnostyka wirusologiczna Drobnoustroje wewnątrzkomórkowe Drobnoustroje nie rosnące na podłożach sztucznych lub długi czas generacji Diagnozowanie Choroby kociego pazura (B. henselae) przeciwciała klasy IgM, IgG Chlamydia pneumoniae- przeciwciała IgA, IgM, IgG Chlamydia psittaci- przeciwciała IgM Chlamydia trachomatis- przeciwciała IgM Gorączki Q (zakażenia Coxiella burnetti)- przeciwciała klasy IgM I i II fazy Dur wysypkowy/gorączka plamista (Rickettsia rickettsi/rickettsia typhi)- przeciwciała klasy IgM, IgG

18 FTA (Flurescent Treponemal Antibody test) Od 3-4 tygodnia od zakażenia Antygen- utrwalone na szkiełku podstawowym krętki szczepu Nicholsa (antygen białkowy grupowy- wspólny dla krętków patogennych i saprofitycznych) Antygeny łączą się z przeciwciałami zawartymi w surowicy chorych na kiłę lub krętkowice Dodanie znakowanej izotiocjanianem fluoresceiny surowicy antygammaglobulinowej (poliwalentna: IgG, IgM, IgA) FTA ABS (FTA-Absorption Test) Modyfikacja absorbcyjna odczynu immunofluorescencji krętków. 3-4 tydzień Wstępna absorbcja badanej surowicy antygenami uzyskiwanymi z krętków hodowlanych- ultrasonat T. phagedenis, biotyp Reiter Usunięcie przeciwciał skierowanych przeciwko krętkom saprofitycznym Test wykazuje wysoką czułość i swoistość diagnostyczną. Jest reaktywny w 85% kiły pierwszorzędowej, % przypadków kiły drugorzędowej oraz w 95% kiły utajonej bądź późnej utajonej.

19 Aglutynacja Reakcja zachodząca pomiędzy Ig a antygenem w formie komórkowej (bakterie, drożdże, erytrocyty, leukocyty itp.). Polega ona na zlepianiu się komórek pod wpływem swoistych Ig i wypadaniu ich z roztworu pod wpływem elektrolitów. Testy aglutynacji lateksowej Testem tym można wykrywać zarówno antygeny wirusów czy bakterii, jak również przeciwciała. Kuleczki lateksu mogą być opłaszczone przeciwciałami swoistymi wobec wykrywanego antygenu bądź antygenami swoistymi wobec poszukiwanych przeciwciał. Wynik pozytywny- aglutynacja lateksu. Precypitacja Reakcja zachodząca pomiędzy przeciwciałem i rozpuszczalnym antygenem, przejawiająca się powstawaniem strontów. Odczyn flokulacyjny Odczyn jakościowo-ilościowy, stosowany w diagnostyce kiły. Próba polega na przeprowadzeniu reakcji surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym.

20 Testy przesiewowe USR (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą nie inaktywowaną) VDRL (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą inaktywowaną) Testy potwierdzenia Odczyn immunofluorescencji krętków FTA, FTA- ABS, Odczyn hemaglutynacji biernej krętków- TPHA Wykrywanie przeciwciał IgM (kiła wrodzona) Odpowiedź immunologiczna Przeciwciała nie-krętkowe (p/kardiolipinie; wykazuje reaktywność krzyżową z antygenami krętków) Przeciwciała krętkowe: IgM- koniec drugiego tygodnia zakażenia IgG- czwarty tydzień Miano przeciwciał niekrętkowych i IgM szybko spada wskutek leczenia IgG utrzymują się przez długi czas

21 Testy przesiewowe Tanie, krótki czas oczekiwania na wynik Poborowi, kobiety w ciąży, pracownicy ochrony zdrowia, dawcy krwi Test nieswoisty, antygeny zastępcze Kardiolipina- frakcja lipidowa z serca wołu Wyniki fałszywie dodatnie Test potwierdzenia z antygenem krętkowym Każdy dodatni odczyn nieswoisty musi być potwierdzony odczynem swoistym USR ( Unheated Serum Reagin-test ) Test przesiewowy- jakościowy. Szybka jakościowa diagnostyka kiły. Surowica nie wymaga inaktywacji termicznej. Kardiolipina zawiera substancję (chlorek choliny) inaktywującą dopełniacz.

22 VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory ) Test przesiewowy. Szybka jakościowa i ilościowa diagnostyka kiły. Tani, szybki, niespecyficzny test. Rutynowo u dawców krwi. Obserwacja postępów leczenia. Diagnozowanie neroinfekcji. Odczyn precypitacji. Antygen- alkoholowy roztwór zawierający 0,03% kardiolipiny, 0,21% lecytyny, 0,9% cholesterolu. Stosuje sięświeżo przygotowany antygen kardiolipinowy oraz surowicę badaną, którą ogrzewa się w 56 C przez 30 min. w celu unieczynnienia dopełniacza. Antygen kardiolipidowy w zetknięciu z surowicą zawierającą przeciwciała strąca się w postaci widocznych kłaczków.

23 TPHA ( Treponema pallidum hemagglutination assay ) Test hemaglutynacji biernej. Swoisty. Krwinki opłaszczone antygenami T. pallidum pochodzącymi ze szczepu Nicholsa. Wykrywa przeciwciała IgM, IgG. Krwinki baranie opłaszczone są szczepem chorobotwórczym T. pallidum. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy czy płynu mózgowo-rdzeniowego i dodaje do zawiesiny krwinek baranich. Miana 1:80 dla surowicy i 1:40 dla płynu mózgowo-rdzeniowego potwierdzają zakażenie.

24 Technika Western Blot Wykorzystywana jest do detekcji i identyfikacji białek. Odczyn immunoenzymatyczny pośredniwykrywanie przeciwciał przeciwko specyficznym białkom drobnoustrojów rozdzielanym elektroforetycznie (np. w diagnostyce zakażeń powodowanych przez HIV, w diagnostyce boreliozy). Odczyn antystreptolizynowy ASO to przeciwciała blokujące działanie jednego z enzymów paciorkowcowych (streptolizyny O- hemolizyna, wrażliwa na tlen). Badanie ASO to analiza surowicy krwi, ma na celu wykrycie przebytego zakażenia paciorkowcami (angina paciorkowcowa) oraz w diagnostyce choroby reumatycznej.

25 Kiedy wykonuje się badania: - Aby ustalić czy mamy do czynienia ze świeżym zakażeniem paciorkowcowym grupy A (Streptococcus pyogenes) - Aby rozpoznać powikłania takie jak np. choroba reumatyczna czy zapalenie kłębuszków nerkowych po przebytej infekcji paciorkowcem typu A ASO pojawiają się w surowicy krwi w czasie infekcji paciorkowcami. Streptolizyna O jest dość silnym antygenem wyzwalającym u zakażonego człowieka tworzenie antystreptolizyn. Krew do badania pobiera się z żyły łokciowej. Dziękuję za uwagę!