liwości drobnoustrojów. Szczepy wielolekooporne. rednia- serologiczna powodowanych przez bakterie, wirusy i grzyby.

Transkrypt

1 Badanie lekowrażliwo liwości drobnoustrojów. Szczepy wielolekooporne. Diagnostyka pośrednia rednia- serologiczna diagnostyka zakażeń i chorób b zakaźnych powodowanych przez bakterie, wirusy i grzyby. Katedra i Zakład Mikrobiologii Lekarskiej WUM Kornelia Jasińska Lekowrażliwość Antybiotyki (z greki anti - przeciw, bios -życie) - naturalne związki organiczne wytwarzane przez drobnoustroje; także syntetyczne lub półsyntetyczne, stosowane jako leki przeciwdziałające infekcjom wywoływanym przez drobnoustroje chorobotwórcze (najczęściej bakterie, ale także grzyby i pierwotniaki).

2 Chemioterapeutyki są to związki stworzone w sposób czysto chemiczny, brak ich odpowiedników w naturze. Linezolid, fluorochinolony, sulfonamidy, trimetoprim Mechanizm działania ania Blokowanie syntezy DNA ( fluorochinolony, metronidazol) Blokowanie polimerazy RNA (rifampicyna) Blokowanie biosyntezy białka (makrolidy, chloramfenikol, aminoglikozydy) Blokowanie biosyntezy ściany komórkowej (wankomycyna, antybiotyki beta-laktamowe) akterie,372.html Uszkodzenie błony protoplazmatycznej (polimyksyny, polieny) Konkurencyjne wnikanie w łańcuch metaboliczny (sulfonamidy)

3 Zakres działania Wąskie spektrum- ograniczone np. do ziarenkowców, pałeczek Gram-ujemnych, beztlenowców. Szerokie spektrum- bakterie Gram-dodatnie i Gram-ujemne oraz beztlenowce. Spektrum- zakres aktywności antybiotyku wobec jednego lub większej liczby gatunków bakterii. Nabycie przez drobnoustrój mechanizmu oporności może zmienić wzór jego wrażliwości na dany antybiotyk, a niekiedy także na inne i w związku z tym zmienić zakres aktywności antybiotyku. Działanie antybiotyków polega na powodowaniu śmierci komórki bakteryjnej (działanie bakteriobójcze) lub wpływaniu w taki sposób na jej metabolizm, aby ograniczyć jej możliwości rozmnażania się (działanie bakteriostatyczne). Główne grupy antybiotyków i chemioterapeutyków 1 B-laktamy penicyliny, penicyliny z inhibitorem, cefalosporyny/cefamycyny, monobaktamy, trójbaktamy, karbapenemy, penemy 2 Aminoglikozydy streptomycyna, neomycyna, kanamycyna, gentamycyna, tobramycyna, netylmycyna, isepamycyna, amikacyna 3 Tetracykliny doksycyklina, tetracyklina, minocyklina 4 Makrolidy/ketolidy stare: nowe: ketolidy: erytromycyna, spiramycyna, josamycyna cykliczny węglan erytromycyny (Dawercin), roksytromycyna, klarytromycyna, azytromycyna, dirytromycyna trolitromycyna 5 Linkozamidy linkomycyna, klindamycyna 6 Streptograminy pristinamycyna, chinupristina, dalfopristina 7 Oksazolidynony linezolid 8 Glikopeptydy wankomycyna, teikoplanina

4 9 Chloramfenikol detreomycyna 10 Polimiksyny kolistyna 11 Ansamycyny rifampicyna 12 Sulfonamidy kotrimoksazol 13 Nitroimidazole metronidazol, ornidazol 14 Nitrofurany nitrofurantoina, furagin, nifuroksazyd 15 Chinolony kwas pipemidynowy, norfloksacyna, pefloksacyna, ciprofloksacyna, ofloksacyna, lewofloksacyna, sparfloksacyna, moksifloksacyna, gemifloksacyna 16 Kwas fusydowy 17 Glicylcykliny tygecyklina 18 Fosfomycyna trometamol fosfomycyny Leki przeciwgrzybicze polieny: nystatyna, amfoterycyna B azole: flukonazot, itrakonazol, ketokonazol, ekonazol, worikonazol antymetabolity: 5-fluorocytozyna Leki przeciwwirusowe acyklowir, didanozyna, famcyklowir, gancyklowir, indinawir, lamiwudyna, nalfinawir, ritonawir, sakwinawir, stawudyna, zalcytabina, zydowudyna 1. Błona zewnętrzna bakterii Gram-ujemnych mutacje poryn 2. Enzymatyczna inaktywacja antybiotyków Mechanizmy oporności 3. Aktywne wypompowywanie antybiotyków z cytoplazmy- EFLUKS 4. Modyfikacja celów działania antybiotyków 5. Regulacja ekspresji genów oporności 6. Transfer genów oporności

5 Oznaczanie lekowrażliwo liwości: 1. Metoda jakościowa: Metoda dyfuzyjno-krążkowa- nasączone antybiotykiem krążki bibuły, 2. Metoda ilościowa: Metoda dyfuzyjna- pasek nasączony gradientem stężeń (E-test) Metoda seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w podłożu stałym lub płynnym Systemy automatyczne np. Vitek Oznaczanie lekowrażliwości szczepów Antybiogram- metoda dyfuzyjno-krążkowa Podłoże MHA (MHF), zawiesina bakteryjna o gęstości 0,5 McFarlanda, inkubacja 16-24h, w temp. 35 C± 2 C, w atmosferze tlenowej Dyfuzja antybiotyku zawartego w krążku do podłoża. Antybiotyk dyfunduje promieniście. Im większa jest strefa zahamowania, tym bakteria jest bardziej wrażliwa. Na podstawie wielkości strefy drobnoustroje określa się jako: Wrażliwe (S) Średnio-wrażliwe (I) Oporne (R) Na podstawie przyjętych standardów- rekomendacji.

6 Pasek nasączony gradientem stężeń (E- test)- metoda służąca do ustalenia najmniejszego stężenia antybiotyku hamującego wzrost drobnoustroju. MIC- jest to najmniejsze stężenie środka hamującego wzrost drobnoustrojów (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, (odnosi się zazwyczaj do bakterii i grzybów). MIC jest parametrem charakteryzującym leki przeciwbakteryjne. MBC- minimalne stężenie bakteriobójcze. Jest to najmniejsze stężenie środka bakteriobójczego (antybiotyku lub chemioterapeutyku), wyrażone w mg/l, oznaczone w warunkach in vitro, przy którym ginie 99,9% drobnoustrojów.

7 Szczepy alarmowe W trakcie pobytu pacjenta w szpitalu może dojść do rozwinięcia zakażenia, które jest bezpośrednim wynikiem hospitalizacji. Może się ono ujawnić po opuszczeniu szpitala oraz dotyczyć personelu medycznego bądź osób odwiedzających. Czynnikami etiologicznymi zakażeń szpitalnych mogą być zarówno bakterie, jak i wirusy, a także grzyby i pasożyty. Lista czynników alarmowych stanowiąca załącznik nr 1 do Rozporządzenia Ministra Zdrowia z dn. 23 grudnia 2011r. w sprawie listy czynników alarmowych, rejestrów zakażeń szpitalnych i czynników alarmowych oraz raportów o bieżącej sytuacji epidemiologicznej szpitala (Dz. U nr 294 poz. 1741) 1. Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus) oporny na metycylinę (MRSA) lub glikopeptydy (VISA lub VRSA) lub oksazolidynony. 2. Enterokoki (Enterococcus spp.) oporne na glikopeptydy (VRE) lub oksazolidynony. 3. Pałeczki Gram-ujemne Enterobacteriaceae spp. wytwarzające betalaktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (np. ESBL,AMPc,KPC) lub oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 4. Pałeczka ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) oporna na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 5. Pałeczki niefermentujące z rodzaju Acinetobacter spp. oporne na karbapenemy lub inne dwie grupy leków lub polimyksyny. 6. Szczepy chorobotwórcze laseczki beztlenowej Clostridium difficile oraz wytwarzane przez nie toksyny A i B.

8 7. Laseczka beztlenowa Clostridium perfringens. 8. Dwoinka zapalenie płuc (Streptococcus pneumoniae) oporna na cefalosporyny III generacji lub penicylinę. 9. Grzyby Candida oporne na flukonazol lub inne leki z grupy azoli lub kandyn. 10. Grzyby Aspergillus. 11. Rotawirus (rotavirus). 12. Norowirus (norovirus). 13. Wirus syncytialny (RSV) 14. Wirus zapalenia wątroby typu B 15. Wirus zapalenia wątroby typu C. 16. Wirus nabytego niedoboru odporności u ludzi (HIV). 17. Biologiczne czynniki chorobotwórcze izolowane z krwi lub płynu mózgowo-rdzeniowego, odpowiedzialne za uogólnione lub inwazyjne zakażenia.

9 Testy specjalne- wykrywanie mechanizmów oporności: Pałeczki Gram-ujemne ESBL ( extended spectrum β-lactamase) Metoda dwóch krążków- DDST ( Double Disc Synergy Test) Enzymy zdolne do hydrolizy penicylin, cefalosporyn (z wyjątkiem cefamycyn) i monobaktamów ESBL są hamowane przez inhibitory Beta-laktamaz Beta-laktamazy typu ESBL są najczęściej kodowane przez duże plazmidy, co ułatwia ich szybkie rozprzestrzenianie się MBL (metalo-β-lactamase) Charakteryzują się obecnością jonu cynku (Zn2+ ) w centrum aktywnym. Inhibitorem jest EDTA (związek chelatujący), który wiąże metal powodując zmianę wrażliwości szczepu na β-laktamy. Cechą charakterystyczną jest zdolność do rozkładu karbapenemów. Geny kodujące te enzymy znajdują się na chromosomie, lub rzadziej, na plazmidzie

10 KPC- wykrywanie karbapenemaz serynowych, klasy A Interpretacja: wynik dodatni KPC (+) - różnica stref wokół krążka z meropenemem (MEM) i kwasem boronowym oraz samym MEM wynosi 4mm lub więcej (Enterobacteriaceae) lub 7mm lub więcej (w przypadku pałeczek niefermentujących) MEM 10 + kwas boronowy MEM 10 KPC Karbapenemazy typu KPC (Klebsiella Pneumoniae Carbapenemasae) hydrolizują wszystkie karbapenemy i wszystkie pozostałe antybiotyki β-laktamowe. Występować mogą najczęściej u szczepów Klebsiella pneumoniae, oxytoca ale także pałeczek Enterobacteriacae i Pseudomonas (aeruginosa, putida). Szczepy Klebsiella pnemoniae KPC+ są zazwyczaj wrażliwe jedynie na kolistynę, tygecyklinę, gentamycynę i czasem amikacynę.

11 Karbapenemazy klasy D, czyli CHDL, OXA-48 Zdolne do hydrolizy karbapenemów. Występują głównie u pałeczek Acinetobacter, ale również zostały wykryte u Enterobacteriaceae. CHDL mają stosunkowo słabą aktywność wobec karbapenemów, a poza nimi hydrolizują jeszcze tylko penicyliny i cefalosporyny I generacji. Temocylina TEM 30µg Szczep podejrzany o wytwarzanie OXA-48: Strefa zahamowania wzrostu wokół krążka z TEM wynosi 10mm lub mniej Enterococcus spp. VRE ( vancomycin resistant enterococci) Mechanizm oporności na wankomycynę wykształcony u Enterococcus

12 Wytwarzanie przez bakterie zmienionych cząsteczek dipeptydów: D-alanino-D-mleczanu oraz D-alanino-D-seryny Włączane są zamiast D-alanylo-D-alaniny w łańcuch prekursora biorącego udział w budowie ściany komórkowej Wankomycyna nie jest już w stanie zablokować syntezy peptytdoglikanu Staphylococcus spp. Gronkowce oporne na metycylinę: MRSA (methicillin resistant S. aureus), MRCNS (methicillin resistant coagulase-negative staphylococci) W metodzie dyfuzji antybiotyku z krążka wykorzystuje się krążki zawierające cefoksytynę (30 µg). Stosowanie krążków z cefoksytyną ma na celu odróżnienie typowych szczepów MRSA od szczepów wskazujących oporność na metycylinę, ale wrażliwych na cefalosporyny. Przyjęto odrębne kryteria do oceny metycylinooporności u szczepów S. aureus i u gronkowców koagulazo-ujemnych (CNS).

13 Charakterystyczne typy oporności bakterii na antybiotyki. Charakterystyczne typy oporności bakterii na antybiotyki.

14 Miano przeciwciał- pomiar ilości przeciwciał w badanej surowicy odpornościowej; Miano przeciwciał wyznacza dodatnia reakcja antygenu z przeciwciałem, uzyskana przy największym rozcieńczeniu surowicy; Jeżeli np. reakcja obserwowana jest w rozcieńczeniu surowicy 1 : 256, miano wynosi 256 jednostek. Metoda immunoenzymatyczna Oparta na znakowaniu, czyli związaniu antygenu lub przeciwciała z enzymem. Powstający kompleks antygenprzeciwciało-enzym jest wykrywany po dodaniu bezbarwnego substratu, który trawiony enzymem daje barwny produkt. Reakcja barwna jest odczytywana wizualnie lub w spektrofotometrze.

15 ELISA Unieruchomiony antygen i specyficzne przeciwciało tworzą kompleks immunologiczny, dzięki któremu przeciwciało zostaje trwale związane z podłożem. Po przepłukaniu środowiska reakcji i dodaniu enzymu związanego ze specyficznym przeciwciałem katalizowana jest reakcja, której produkt (najczęściej barwny) można oznaczyć spektrofotometrycznie. Metoda jakościowa i ilościowa. Metoda immunofluorescencji Jest metodą wykrywania przeciwciał w surowicy przy pomocy przeciwciał lub antygenów znakowanych barwnikiem fluoryzującym-izotiocyjanian fluoresceinyktóry absorbuje światło o określonej długości fali i emituje energię w postaci światła widzialnego (zielone).

16 Zastosowanie Diagnostyka pośrednia- wykrycie przeciwciał swoistych (monoklonalnych) Diagnostyka wirusologiczna Drobnoustroje wewnątrzkomórkowe Drobnoustroje nie rosnące na podłożach sztucznych lub długi czas generacji Diagnozowanie Choroby kociego pazura (B. henselae) przeciwciała klasy IgM, IgG Chlamydia pneumoniae- przeciwciała IgA, IgM, IgG Chlamydia psittaci- przeciwciała IgM Chlamydia trachomatis- przeciwciała IgM Gorączki Q (zakażenia Coxiella burnetti)- przeciwciała klasy IgM I i II fazy Dur wysypkowy/gorączka plamista (Rickettsia rickettsi/rickettsia typhi)- przeciwciała klasy IgM, IgG

17 FTA (Flurescent Treponemal Antibody test) Od 3-4 tygodnia od zakażenia Antygen- utrwalone na szkiełku podstawowym krętki szczepu Nicholsa (antygen białkowy grupowy- wspólny dla krętków patogennych i saprofitycznych) Antygeny łączą się z przeciwciałami zawartymi w surowicy chorych na kiłę lub krętkowice Dodanie znakowanej izotiocjanianem fluoresceiny surowicy antygammaglobulinowej (poliwalentna: IgG, IgM, IgA) Aglutynacja Reakcja zachodząca pomiędzy Ig a antygenem w formie komórkowej (bakterie, drożdże, erytrocyty, leukocyty itp.). Polega ona na zlepianiu się komórek pod wpływem swoistych Ig i wypadaniu ich z roztworu pod wpływem elektrolitów. Testy aglutynacji lateksowej Testem tym można wykrywać zarówno antygeny wirusów czy bakterii, jak również przeciwciała. Kuleczki lateksu mogą być opłaszczone przeciwciałami swoistymi wobec wykrywanego antygenu bądź antygenami swoistymi wobec poszukiwanych przeciwciał. Wynik pozytywny- aglutynacja lateksu.

18 Precypitacja Reakcja zachodząca pomiędzy przeciwciałem i rozpuszczalnym antygenem, przejawiająca się powstawaniem strontów. Odczyn flokulacyjny Odczyn jakościowo-ilościowy, stosowany w diagnostyce kiły. Próba polega na przeprowadzeniu reakcji surowicy chorego z antygenem kardiolipinowym. Testy przesiewowe USR (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą nie inaktywowaną) VDRL (odczyn mikroflokulacyjny z surowicą inaktywowaną) Testy potwierdzenia Odczyn immunofluorescencji krętków FTA, FTA- ABS, Odczyn hemaglutynacji biernej krętków- TPHA

19 Testy przesiewowe Tanie, krótki czas oczekiwania na wynik Poborowi, kobiety w ciąży, pracownicy ochrony zdrowia, dawcy krwi Test nieswoisty, antygeny zastępcze Kardiolipina- frakcja lipidowa z serca wołu Wyniki fałszywie dodatnie Test potwierdzenia z antygenem krętkowym Każdy dodatni odczyn nieswoisty musi być potwierdzony odczynem swoistym USR ( Unheated Serum Reagin-test ) Test przesiewowy- jakościowy. Szybka jakościowa diagnostyka kiły. Surowica nie wymaga inaktywacji termicznej. Kardiolipina zawiera substancję (chlorek choliny) inaktywującą dopełniacz.

20 VDRL ( Venereal Disease Research Laboratory ) Test przesiewowy. Szybka jakościowa i ilościowa diagnostyka kiły. Tani, szybki, niespecyficzny test. Rutynowo u dawców krwi. Obserwacja postępów leczenia. Diagnozowanie neroinfekcji. Odczyn precypitacji. Antygen- alkoholowy roztwór zawierający 0,03% kardiolipiny, 0,21% lecytyny, 0,9% cholesterolu. Stosuje sięświeżo przygotowany antygen kardiolipinowy oraz surowicę badaną, którą ogrzewa się w 56 C przez 30 min. w celu unieczynnienia dopełniacza. Testy potwierdzenia Odczyny swoiste. Wykonywane z antygenami T. pallidum. Wykrywają przeciwciała (immobilizynyunieruchamiające krętki). Odczyn immunofluorescencji krętków FTA, FTA- ABS, FTA-ABS-IgM, Odczyn hemaglutynacji biernej krętków- TPHA

21 Krwinki baranie opłaszczone są szczepem chorobotwórczym T. pallidum. Wykonuje się kolejne rozcieńczenia surowicy czy płynu mózgowo-rdzeniowego i dodaje do zawiesiny krwinek baranich. Interpretacja badań Odczyny klasyczne Odczyny krętkowe Interpretacja VDRL FTA TPHA kiła wykluczona kiła w okresie wylęgania kiła u zakażonych HIV całkowita negatywizacja odczynów po przebytej kile wyniki fałszywie dodatnie wczesny okres zakażenia wyniki fałszywie dodatnie aktywna kiła kiła przebyta u niemowląt (biernie przeniesione p/c od matki) kiła przebyta

22 Technika Western Blot Wykorzystywana jest do detekcji i identyfikacji białek. Odczyn immunoenzymatyczny pośredniwykrywanie przeciwciał przeciwko specyficznym białkom drobnoustrojów rozdzielanym elektroforetycznie (np. w diagnostyce zakażeń powodowanych przez HIV, w diagnostyce boreliozy). Odczyn antystreptolizynowy ASO to przeciwciała blokujące działanie jednego z enzymów paciorkowcowych (streptolizyny O- hemolizyna, wrażliwa na tlen). Badanie ASO to analiza surowicy krwi, ma na celu wykrycie przebytego zakażenia paciorkowcami (angina paciorkowcowa) oraz w diagnostyce choroby reumatycznej.

23 Kiedy wykonuje się badania: - Aby ustalić czy mamy do czynienia ze świeżym zakażeniem paciorkowcowym grupy A (Streptococcus pyogenes) - Aby rozpoznać powikłania takie jak choroba reumatyczna czy zapalenie kłębuszków nerkowych po przebytej infekcji paciorkowcem typu A ASO pojawiają się w surowicy krwi w czasie infekcji paciorkowcami. Streptolizyna O jest dość silnym antygenem wyzwalającym u zakażonego człowieka tworzenie antystreptolizyn. Krew do badania pobiera się z żyły łokciowej. Za znamienny uważa się poziom antystreptolizyny O we krwi powyżej 200j.