Biochemia stresu oksydacyjnego. Wykład 8 Słów kilka o witaminach i nie tylko

Transkrypt

1 Biochemia stresu oksydacyjnego Wykład 8 Słów kilka o witaminach i nie tylko

2 Witamina C - Witamina C (kwas askorbinowy, w fizjologicznym ph występujący jako askorbinian) działa w komórkach jako: * przeciwutleniacz * kofaktor enzymów (zwłaszcza hydroksylaz) * naczelne (i świnki morskie) nie mogą syntetyzować witaminy C z powodu braku oksydazy gulonolaktonowej (GLO) GLO

3 Witamina C u naczelnych Hipotezy tłumaczące zanik GLO (wynikające prawdopodobnie z retrowirusowej insercji sekwencji Alu) u naczelnych: * środowisko życia i dieta naczelnych były bogate w askorbinian (głównie owoce) - brak presji selekcyjnej * niedobór witaminy C prowadził do wcześniejszej śmierci osobników starych, poprawiając warunki życia osobników młodych w okresach niedoboru pokarmu * syntezie askorbinianu towarzyszy produkcja H 2 O 2 ; pobieranie askorbinianu z pokarmu nie jest związane z produkcją H 2 O 2. Wilson JX. Biofactors 2009

4 Witamina C środek przeciwdziałający szkorbutowi Szkorbut (gnilec, cynga) choroba wielonarządowa, wywołana niedoborem kwasu askorbinowego w pożywieniu. Główne objawy dotyczą tkanki łącznej, ponieważ witamina C jest koenzymem hydroksylazy prolinowej i lizynowej, które katalizują powstanie poprzecznych wiązań kowalencyjnych między cząstkami kolagenu. brak kwasu askorbinowego = brak dojrzewania kolagenu Stężenia wit. C osocze krwi 40 µmol/l wątroba, nerki, śledziona, trzustka µmol/l Soczewka oka ponad 1 mmol/l (gromadzenie wit. C w płynie wodnistym oka chroni przed szkodliwymi skutkami wzmożonej produkcji RFT wywołanej przez światło) takiej akumulacji nie obserwuje się u zwierząt prowadzących nocny tryb życia

5 Transport witaminy C do komórek Asc do komórek dostaje się na zasadzie dyfuzji ułatwionej, w formie utlenionej jako dehydroaskorbinian i wewnątrz komórki ulega redukcji do askorbinianu Askorbinian jest pobierany przez komórki przez zależny od sodu transporter witaminy C (SVCT2), a dehydroaskorbinian przez transporter glukozy (GLUT1).

6 Witamina C - Bardzo niskie stężenia witaminy C w surowicy i leukocytach stwierdza się u chorych w stadiach terminalnych (zwłaszcza karmionych pozajelitowo), oraz u pacjentów z posocznicą. Może to wynikać z: * niewystarczającego dostarczania witaminy C w przypadku żywienia pozajelitowego (łatwo rozkłada się podczas przygotowywania i przechowywania roztworu). * zwiększenia zapotrzebowania na askorbinian wynikającego z nasilonego stresu oksydacyjnego. APX: peroksydaza askorbinianowa; ASC: askorbinian; MDHAR: reduktaza monodehydroaskorbinianu; DHAR: reduktaza dehydroaskorbinianu; MDHA: monodehydroaskorbinian, DHA: dehydroaskorbinian Wilson JX. Biofactors 2009

7 Witamina C - Dostarczanie odpowiedniej ilości witaminy C w diecie może nieco zmniejszać ryzyko raka macicy. - Wbrew powszechnym oczekiwaniom próby kliniczne wykazały, że suplementacja witaminą C nie wpływa na ryzyko nowotworów układu pokarmowego.

8 Witamina C w stanach patologicznych - Askorbinian wpływa na komórki śródbłonka w posocznicy. W posocznicy dochodzi kolejno do: * aktywacji NOX i inos, * wzrostu produkcji ROS i ONOO-, * upośledzenia funkcji naczyń: # zmniejszenia przepływu # zwiększenia przepuszczalności - Askorbinian jest pobierany przez komórki przez zależny od sodu transporter witaminy C (SVCT2), a dehydroaskorbinian przez transporter glukozy (GLUT1). DHA jest redukowany do Asc. - Wewnątrzkomórkowy Asc zmiata ROS i ONOO-, zwiększając przy tym dostępność BH4 i aktywność enos. Hamuje natomiast indukcję NOX i inos. Wilson JX. Biofactors 2009

9 Wykład 3 - NOS

10 Witamina C w mitochondriach - DHA (utleniona forma witaminy C, kwas dehydroaskorbinowy) jest transportowany do mitochondriów poprzez GLUT-1. - W mitochondriach jest redukowany do askorbinianu (AA) w kompleksie III i przez reduktazę DHA (z wykorzystaniem glutationu, redukowanego następnie dzieki NADPH). cytoplazma przestrzeń międzybłonowa matriks mitochondrialna W mitochondriach AA jest zmiataczem ROS. Może być transportowany do cytoplazmy. Mandl et al. Br J Pharmacol 2009

11 Rola w zapobieganiu uszkodzeniom DNA Badania in vivo Porównanie poziomu 8-OH-dG (8-hydroxy-2-deoxyguanozyny w nasieniu mężczyzn spożywających różne ilości wit. C Dawka Asc w diecie 250 mg Asc/doba 5 mg Asc/doba Poziom Asc we krwi 399 µmol/l Asc 203 µmol/l Asc Poziom 8-OH-dG 34 pmol/mg DNA 67 pg/ml DNA Sies et al., 1992

12 Zawartość witaminy C w pożywieniu zawartość witaminy C [mg] /100 g produktu

13 Witamina C a NFkB - Wzrost poziomu Asc ma działanie przeciwzapalne poprzez hamowanie NFkB - Asc powoduje obniżenie ekspresji COX-2, której promotor ma miejsce wiązania dla NF-kB - przeciwnowotworowa aktywność witaminy C może być związana z hamowaniem aktywności NF-kB i ekspresji COX-2 DHA - dehydroaskorbinian Guz et al. Post Hig Med. Dosw 2007

14 Witamina C a niedotlenienie - HIF-1a i HIF-1b są transkrybowane konstytutywnie. - W normoksji (w obecności tlenu i askorbinianu) 2 reszty prolinowe i 1 asparaginianowa są hydroksylowane przez hydroksylazy zależne od żelaza Fe 2+ i 2- oksoglutaranu. - Prowadzi to do przyłączenia białka von Hippel-Lindau (część kompleksu ligazy ubikwityny E3) i degradacji proteasomalnej. askorbinian jest niezbędny do aktywności hydroksylaz prolinowych i hydroksylazy asparaginianowej znakujących HIF-1 do degradacji w proteasomach w warunkach normoksji

15 Witamina C pro-oksydant? Askorbinian może również działać prooksydacyjnie, zwłaszcza w obecności wolnych jonów metali przejściowych, szczególnie jeśli występuje w małych stężeniach, stymuluje reakcje wolnorodnikowe Układ askorbinian + jony żelaza stosowany jest jako modelowy układ do inicjacji peroksydacji lipidów askorbinian może faworyzować reakcję Fentona Wyniki badań in vitro, konieczna obecność jonów metali przejściowych Role dehydroaskorbinianu również dwojaka

16 - Witamina E początkowo była uważana za żeński czynnik płodności, zapobiegający resorpcji płodu u ciężarnych samic szczura - Nie jest koenzymem żadnego enzymu Witamina E - Różne tkanki organizmu charakteryzują się odmiennym stopniem wrażliwości na jej niedobór - U człowieka brak wit. E - rzadko, gdyż jest bardzo szeroko rozpowszechniona w przyrodzie np. osoby cierpiące na zaburzenia przyjmowania tłuszczu (np. chorujący na mukowiscydozę, niewydolność trzustki czy choroby wątroby), noworodki z niedowagą oraz wcześniaki) wywołuje wiele objawów degeneracyjnych z różnych narządów, w szczególności zaś narządów płciowych, układu krwionośnego i wątroby. Ogólny spadek odporności organizmu, anemię, która powstaje na skutek uszkodzeń czerwonych krwinek wynikających z utlenienia. niedobór witaminy E może prowadzić do rozwoju chorób spowodowanych generalnym spadkiem poziomu TAS (total antioxidant system)

17 Witamina E - Witamina E stanowi grupę 8 hydrofobowych (rozpuszczalnych w tłuszczach) kompleksów, różniących się biodostępnością: * a-, b-, g-, i d-tokoferoli * a-, b-, g-, i d-tokotrienoli. - Komercyjnie dostępne formy witaminy E zawierają naturalne lub syntetyczne a-tokoferole. - a-tokoferol - najbardziej rozpowszechniony aż 88 % calej puli wit. E w osoczu, jest transportowany przez białko transportujące a-tokoferol (a-ttp, a-tocopherol transfer protein) do lipoprotein HDL i LDL, chroniąc lipoproteiny przed peroksydacją przez wolne rodniki. - Witamina E chroni lipidy przed peroksydacją, gdyż jest donorem wodorów dla wolnych rodników. - Efektem działania witaminy E jest mniejsza podatność LDL na oksydację (i formowanie oxldl), a przez to mniejsza szkodliwość oxldl dla komórek śródbłonka. Kirmiziz & Catzidimitriou. Vasc Health Risck Manag 2009

18 Witamina E Główny antyoksydant rozpuszczalny w lipidach Powszechnie obecna jest w błonach komórkowych i lipoproteinach osocza krwi Różnice w poziomie w różnych błonach leukocyty jednojądrzaste zawierają 10-krotnie więcej wit. E niż krwinki czerwone i płytki krwi Działanie antyoksydacyjne polega głównie na uczestnictwie w drugiej linii obrony przed RFT zmiataniu wtórnych wolnych rodników organicznych i terminacji peroksydacji lipidów Dobrze zmiata również tlen singletowy

19 Skutki działania witaminy E Kirmiziz & Catzidimitriou. Vasc Health Risck Manag 2009

20 Skutki podawania witaminy E - Badania na zwierzętach i analizy danych klinicznych sugerowały protekcyjny wpływ suplementacji witaminą E na zapobieganie chorobom układu krążenia. - Niektóre badania sugerowały, że dieta bogata w witaminę E może zmniejszać ryzyko nowotworów. - Duże próby kliniczne wykazały, że suplementacja witaminą E: * nie wpływa na ryzyko rozwoju chorób układu krążenia * nieco zwiększa ogólne ryzyko śmierci * nie wpływa na ryzyko rozwoju nowotworu prostaty Byers T. Am J Epidem 2010

21 Witamina A - Witamina A pochodne beta-jononowe o strukturze podobnej do transretinolu - Prowitaminy A karotenoidy o aktywności biologicznej podobnej do witaminy A (związków takich jest ponad 50 najważniejszy β-karoten) - W pożywieniu głownie witamina A (w postaci estrów retinolu) i prowitaminy (głównie β-karoten) - W osoczu krwi 95% - trans-retinol Karotenoidy likopen, α-karoten, β-karoten,, γ-karoten, Ksantofile (oksykarotenoidy) zeaksantyna, luteina, astaksantyna

22 Witamina A Najważniejsze funkcje: - Podtrzymywanie wzrostu, reprodukcji, procesu widzenia, róznicowania nabłonka, procesów odpornościowych - Przeciwnowotworowe właściwości karotenoidów - Działanie antyoksydacyjne efektywne wygaszacze tlenu singletowego, reaguja z organicznymi wolnymi rodnikami, powstającymi w procesie peroksydacji lipidów (podobnie jak tokoferol) Karotenoidy likopen, α-karoten,, β-karoten,, γ-karoten, Ksantofile (oksykarotenoidy) zeaksantyna, luteina*, astaksantyna * Szczególnie dużo w siatkówce oka

23 Witamina A w chemoprewencji - Badania na zwierzętach zgodnie wskazywały na protekcyjny wpływ witaminy A w zapobieganiu rozwojowi nowotworów - Dwie duże próby kliniczne rozpoczęte w 1985 roku w Finlandii i USA wykazały: * 18% wzrost ryzyka nowotworów płuc po suplementacji wysokimi dawkami b- karotenu * 28% wzrost ryzyka nowotworów płuc po suplementacji b-karotenem i retinolem Byers T. Am J Epidem 2010

24 - Końcowy produkt przemian puryn Kwas moczowy

25 Szlak degradacji puryn - powstawanie kwasu moczowego George & Struthers. Vasc Health Risck Manag 2009

26 Synteza kwasu moczowego - Kwas moczowy jest końcowym produktem degradacji puryn u ludzi i małp człekokształtnych. * linia filogenetyczna człowiekowatych utraciła aktywność oksydazy moczanowej (urykazy), enzymu przekształcającego kwas moczowy do alantoiny. * u pozostałych ssaków końcowym produktem metabolizmu puryn wydzielanym z moczem jest alantoina * inne kręgowce (np. ryby) rozkładają alantoinę do kwasu alantoinowego, glioksylowego i mocznika - Stężenie kwasu moczowego we krwi ludzi jest wysokie ( mm), (powyżej ryzyko dny moczanowej) Sautin & Johnson. Nucleosid Nucleotid Nucleic Acid 2008

27 Kwas moczowy - alantoina Powstaje na drodze nieenzymatycznej reakcji kwasu moczowego z oksydantami

28 Synteza kwasu moczowego Hiperurykemia zwiększone stężenie kwasu moczowego we krwi. Górna granica normy wynosi: kobiety 360 μmol/l (6 mg/dl), mężczyzni 400 μmol/l (6,8 mg/dl). Hiperurykozuria jest to zwiększone wydalanie kwasu moczowego z moczem So & Torens. J Clin Invest. 2010

29 Poziom kwasu moczowego we krwi

30 Kwas moczowy jako antyoksydant - Korzyścią ewolucyjną pozwalająca na utrwalenie wysokiego poziomu kwasu moczowego mogą być jego właściwości antyoksydacyjne: * kwas moczowy jest zmiataczem tlenu singletowego, rodnika peroxylowego (RO 2 ') i rodnika hydroksylowego (HO') oraz nadtlenoazotynu, ale nie anionorodnika ponadtlenkowego, * sugerowano znaczenie antyoksydacyjnego działania kwasu moczowego dla wydłużenia życia i zmniejszenia ryzyka nowotworów. So & Torens. J Clin Invest. 2010

31 Ważne badania wskazujące na antyoksydacyjne działanie kwasu moczowego Mutanty rosy Drosophila melanogaster Mutacja rosy mutacja w genie kodującym dehydrogenazę ksantynową (enzym wytwarzający kwas moczowy) Mutanty rosy są nadwrażliwe na działanie promieniowania jonizujacego, hiperoksji (podwyższonego ciśnienia tlenu) oraz parakwatu (herbicyd) Akumulacja dwóch mutacji, prowadzących do braku dehydrogenazy ksantynowej i SOD jest letalna

32 Brak kwasu moczowego u D. melanogaster Ry+5 kontrola Ry506 mutacja Promieniowanie jonizujace hiperoksja Hilliker et al., PNAS 1992

33 Kwas moczowy - Kwas moczowy jest głównym przeciwutleniaczem w ludzkiej surowicy. Paradoksalnie, jego podwyższony poziom koreluje z: * otyłością, * insulinoopornością, * nadciśnieniem, choroby związane z nasilonym stresem oksydacyjnym * chorobami serca, * udarami mózgu. - Być może wzrost stężenia kwasu moczowego jest niewystarczającą reakcją protekcyjną. Możliwe również że: *?-kwas moczowy ma głównie właściwości antyoksydacyjne w surowicy *?-kwas moczowy ma głównie właściwości prooksydacyjne w komórkach - Poziom kwasu moczowego jest zwykle niższy u kobiet, z powodu hamującego działania estrogenów. kwas moczowy Sautin & Johnson. Nucleosid Nucleotid Nucleic Acid 2008

34 Kwas moczowy jako pro-oksydant - W obecności ROS lub ONOO- kwas moczowy jest bardzo szybko degradowany, a produkty jego rozkładu mogą być cytotoksyczne. W wysokich stężeniach lub w obecności jonów Cu + /Cu 2+ kwas moczowy (lub jego pochodne) może nasilać peroksydację lipidów. Sautin & Johnson. Nucleosid Nucleotid Nucleic Acid 2008

35 Kwas moczowy jako pro-oksydant - Inkubacja adipocytów in vitro w obecności kwasu moczowego prowadzi do indukcji produkcji ROS, prawdopodobnie poprzez indukcję ekspresji NOX. Produkcja ROS (fluorescencja H2DCFDA) MnTMPyP - odpowiednik SOD, transportowany przez błonę komórkową (działanie kwasu moczowego związane jest z generacją anionorodnika ponadtlenkowego). Takie same efekty dawała inhibicja NOX. Sautin & Johnson. Nucleosid Nucleotid Nucleic Acid 2008

36

37 Stężenia glutationu - Stężenie glutationu jest znacznie wyższe w komórkach (w cytozolu i macierzy organelli) niż w płynach ustrojowych. - Stosunek GSH:GSSG jest różny w poszczególnych kompartmentach komórki Dalle-Donne et al. Antioxidant Redox Signal 2008

38 Glutation w komórce - GSH syntetyzowany jest w cytoplaźmie, w dwustopniowej reakcji przebiegającej z udziałem zależnych od ATP enzymów: syntetazy γ-glutamylocysteinylowej [γsgc] oraz syntetazy glutationowej [SG]. - GSH jest transportowany do mitochondriów i retikulum (przez nośniki oksoglutarowe i dikarboksylowe) oraz do jądra (pasywnie przez pory); - Degradacja GSH zachodzi zewnątrzkomórkowo przy udziale GGT (g-glutamylotranspeptydazy) g-glutamylotranspeptydazy [g-gt] Lu CS. Mol Aspcts Med 2009.

39 Synteza glutationu Dalle-Donne et al. Antioxidant Redox Signal 2008

40 Synteza glutationu 98% Ballatori et al. Biol Chem 2009.

41 Syntetazy glutationowe - Synteza glutationu obejmuje 2 etapy: * Synteza g-glutamylo-l-cysteiny jest katalizowana przez syntetazy γ- glutamylocysteinylowej [γsgc] i stanowi etap regulujący szybkość procesu. * Przyłączenie glicyny do g-glutamylocysteiny jest katalizowane przez syntetazę GSH - Wydajność syntezy GSH zależy od: * dostępności cysteiny (zależna od wydajności transportu przez błonę komórkową cysteiny, cystyny i metioniny) * aktywności γsgc * w wątrobie - od wydajności metabolizmu metioniny, stanowiącej prekursor cysteiny Suplementacja N-acetylocysteiną zwiększa poziom syntezy GSH w erytrocytach niedożywionych dzieci Badaloo et al. Am J Clin Nutr 2002

42 Syntetazy glutationowe syntetaza γ-glutamylocysteinylowa [γsgc] = Ligaza γ glutamylo-cysteinowa Glutamate cysteine ligase (GCL)

43 Syntetazy glutationowe - GCL wymaga obecności Mg 2+ lub Mn 2+. Jest heterodimerem składającym się z dwóch podjednostek kodowanych przez odrębne geny: * katalitycznej (łańcuch ciężki, GCLC, ~73 kda) - Glutamate cysteine ligase catalytic subunit * regulatorowej (łańcuch lekki, GCLM ~31 kda) - Glutamate cysteine ligase modifier subunit - Regulacja aktywności GCL odbywa się na kilku poziomach: * transkrypcji (np. indukcja przez Nrf2, HGF; hamowanie przez GSH) * stabilności mrna (np. stabilizacja przez 4-hydroksy-nonenal) * proteolizy (hydroliza do krótszej, mniej aktywnej formy, indukowana np. przez TGFb) 4-hydroksynonenal (produkt i marker peroksydacji lipidów) Lu CS. Mol Aspcts Med 2009.

44 Glutation i Nrf2 W 2002 roku odkryto, że Nrf2, główny regulator genów zaangażowanych w odtruwanie organizmu bierze udział w regulacji ekspresji również przeciwutleniaczy, oraz związków przeciwzapalnych i odtruwających. Glutation znalazł się wśród związków, których produkcja najbardziej wzrastała pod wpływem stymulacji ścieżki Nrf2.

45 Nrf2 kluczowy czynnik antyoksydacyjny Gorrini et al., 2013

46 Transport GSH w obrębie komórki MRP: multidrug resistance-asociated protein; Oatp: organic anion transporting polypeptide Ballatori et al. Biol Chem 2009.

47 GSH w mitochondriach - GSH przemieszcza się łatwo przez zewnętrzną błonę mitochondrialną (MOM), ale przez błonę wewnętrzną (MIM) musi być przenoszony aktywnie przez nośniki: * DCc (nośnik dwukarboksylowy) * OGC (nośnik oksoglutaranowy) - Zmniejszenie płynności błony (wzrost stosunku cholesterol/fosfolipidy) np. wywołanej nadmiernym poziomem alkoholu utrudnia transport GSH przez nośnik oksoglutarowy i zmniejsza poziom mitochondrialnego GSH Mari et al. Antioxid Redox Signal 2009

48 GSH i apoptoza Szlak wewnętrzny programowanej śmierci komórek przebiega za pośrednictwem mitochondrium. Do aktywacji tego szlaku dochodzi w wyniku wzrostu stężenia jonów Ca2+ w cytoplazmie podwyższenia poziomu ROS w wyniku stresu oksydacyjnego, zaburzeń transportu elektrolitów oraz uszkodzeń DNA Mari et al., ARS 2009

49 GSH w mitochondriach - Spadek poziomu mitochondrialnego GSH prowadzi do utlenienia kardiolipiny i w konsekwencji indukuje apoptozę. - Kardiolipina jest fosfolipidem występującym wyłącznie w mitochondriach, kluczowym dla utrzymania właściwości błon mitochondrialnych (zwłaszcza MIM). W wewnętrznej błonie mitochondrium występuje obok fosfatydylocholiny i fosfatydyloetanoloaminy w stosunku odpowiednio 2:3:4. Zmniejsza przepuszczalność tej błony, przyczyniając się do większej wydajności energetycznej oddychania komórkowego. W błonie połączona jest z cytochromem c. Utlenienie kardiolipiny prowadzi do uwolnienia cytochromu c. Mari et al. Antioxid Redox Signal 2009

50 Rola kardiolipiny w permeabilizacji błony mitochondrialnej Mari et al. Antioxid Redox Signal 2009

51 GSH i apoptoza Ballatori et al. Biol Chem 2009.

52 Komórki nowotworowe i ROS - w komórkach nowotworowych dominuje niedotlenienie - główny czynnik regulujący odpowiedź komórek na niedotlenienie HIF-1 czynnik indukowany przez nieodtlenienie - HIF-1 może być indukowany przez ROS (nawet w warunkach normoksji)

53 Obniżenie poziomu GSH uwrażliwia komórki na niedotlenienie Terapia obniżenie GSH w mitochondriach lub wzrost ROS Mari et al. Antioxid Redox Signal 2009