Chemiczne procesy biotechnologiczne

Transkrypt

1 Chemiczne procesy biotechnologiczne PODSTAWY BIOTECHNOLOGII Sala 2.64 wtorek godz Prof. dr hab. Marek Łaniecki Zakład Kinetyki i Katalizy

2

3

4 krówka 1410? 1605?

5 Program wykładów 1. Komórka (bakterie, drożdże) 2. Enzymy katalizatory biologiczne 3. Metabolizm komórkowy i sposoby pozyskiwania energii 4. Wytwarzanie wina i piwa 5. Biologiczne oczyszczanie ścieków 6. Biopaliwa 7. Związki biologicznie czynne (aminokwasy, antybiotyki)

6 BIOTECHNOLOGIA dyscyplina nauk technicznych wykorzystująca procesy biologiczne na skalę przemysłową BIOTECHNOLOGIA interdyscyplinarna dziedzina nauki wykorzystująca systemy biologiczne, komórki mikroorganizmów, części komórki lub ich molekularne analogi dla uzyskania określonych produktów BIOTECHNOLOGIA zastosowanie technologiczne systemów biologicznych, organizmów żywych lub ich składników do wytwarzania lub modyfikowania produktów lub procesów do określonego zastosowania

7 Podział Biała biotechnologia systemy biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska (np. fermentacja, bioleaching, bioremediacja, broń biologiczna) Zielona biotechnologia rolnictwo (transgeniczne rośliny i zwierzęta) Czerwona biotechnologia ochrona zdrowia (biofarmaceutyki, diagnostyka genetyczna, genoterapia, transplantologia, GMO) Fioletowa biotechnologia - ustawodawstwo Biotechnologia zwierząt Biotechnologia roślin Biotechnologia żywności Tradycyjna naturalne enzymy i organizmy bez obcego materiału genetycznego Nowoczesna organizmy, enzymy, białka zmodyfikowane genetycznie EuropaBio

8 A. Chmiel, Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa, 1998.

9 Stanley Miller exp.1954 Nobel Prebiotyczna zupa 4.5 mld Ziemia 3.7 mld- sub.org. 3.0 mld-fotosynteza CH 4 CO 2 NH 3 H 2 H 2 O UV Q CH 3 COOH CH 3 CH 2 OHCOOH NH 2 -CO-NH 2 NH 2 CH 2 COOH NH 2 CH 2 (CH 3 )COOH NH 2 -CH 2 (CH 2 COOH)COOH kwas octowy kwas mlekowy mocznik glicyna alanina kwas asparaginowy

10 Panspermia

11 Komórka najprostsza forma życia

12 Schemat komórki bakterii Rozmiar do kilkudziesięciu mikrometrów Rozpowszchnienie 1g gleby= 40mln 1 ml H 2 O = 1mln Ziemia 5x10 30 = pięć kwintylionów P. Singleton, Bakterie w biologii, biotechnologii i medycynie, PWN, 2000, Warszawa.

13 Eukariota (jądro) Prokariota (brak jądra)

14 Przybliżony skład chemiczny typowej komórki bakterii i komórki ssaka Składnik Procent całkowitej wagi komórki Bakteria E. coli Komórka ssaka H 2 O Jony nieorganiczne (Na +, K +, Mg 2+, Ca 2+, Cl - ) Małe metabolity Białka RNA DNA Fosfolipidy Inne lipidy Polisacharydy Całkowita objętość komórki Względna objętość komórki x cm x cm 3 B. Alberts, D. Bray, J.Lewis, M. Raff, K. Roberts, J.D.Watson, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing Inc. 1983, NY/London

15 1 nm = 0,001 μm Gronkowiec złocisty (Staphylococcus aureus)

16 Formy bakterii gronkowce pakietowce paciorkowce dwoinki pałeczki laseczki średnia wielkość : µm przecinkowce śrubowce krętki srednia wielkość : 0.2(1.0) do µm

17

18 Podział bakterii ze względu na źródła energii i węgla Chemoorganotrofy (heterotrofy) źródło węgla i energii: substraty organiczne np. cukry, kwasy tłuszczowe, alkohole Chemolitotrofy (autotrofy) źródło energii: substraty nieorganiczne np. S 2-, S o, H 2, Fe 2+, NH 3 źródło węgla: utlenione związki węgla np. CO 2, węglany Fototrofy (autotrofy lub heterotrofy) źródło energii: światło źródło węgla CO 2 lub substraty organiczne

19 Budowa komórki drożdży CYTOLOGIA Badania morfologii i działania strukturalnych składników komórki. 1. Błona komórkowa 2. Cytoplazma z organellami 3. Jądro 4. Membrana z chromosomami

20

21 Drożdże Saccharomyces rodzaj z rodziny drożdżowatych - grzyby jednokomórkowe o komórkach kulistych, jajowatych lub walcowatych. Wielkość od 1 do 10 mikrometrów Rozmnażanie przez pączkowanie ( w niesprzyjających warunkach rozmnażanie płciowe) Około 200 gatunków z dużą liczbą odmian. Fermentacja dolna Fermentacja górna a. Piwowarskie b. Winiarskie c. Piekarnicze d. Gorzelnicze Królestwo grzyby Typ - woreczniaki Rodzaj - drożdże Spożywcze i paszowe

22 Elementy komórki Cytoplazma - ciecz, w której zawieszone są wszystkie struktury komórki oraz składniki pokarmowe, jony, enzymy, produkty przemiany materii. Nukleoid (chromosom) - zwinięta w ścisłą strukturę nić DNA o długości około 1mm, połączona z cząsteczkami RNA i białkami. Zawiera komplet informacji genetycznej. Plazmid pozachromosomowy fragment DNA, zazwyczaj o kształcie kolistym, zdolny do niezależnej replikacji. Koduje różne przydatne komórce funkcje jak np. oporność na antybiotyki. Rybosom zbudowany jest z dwóch podjednostek: dużej (50S) i małej (30S). Zawiera rrna (70%) i białka (30%). Jego rolą jest odczytanie kodu genetycznego i kontrola syntezy białek.

23 Substancje zapasowe poli-β-hydroksymaślan (PHB), glikogen, polifosforany. Synteza oraz magazynowanie PHB i glikogenu zachodzi, gdy obecne jest źródło węgla przy jednoczesnym deficycie azotu, siarki. Synteza polifosforanów ma miejsce w warunkach aerobowych przy nadmiarze fosforanów w środowisku. Chromatofory organelle komórkowe zawierające chlorofil i karotenoidy. U cyjanobakterii i bakterii fotosyntetyzujących zwane są tylakoidami. Mają formę pęcherzyków lub spłaszczonych, warstwowo ułożonych błon i połączone są z błoną cytoplazmatyczną. Biorą udział w fotosyntezie. Wakuole gazowe występują u niektórych prokariotów np. cyjanobakterii. Składają się z drobnych, wypełnionych gazem pęcherzyków. Wpływają na gęstość komórek i pozwalają zwiększyć dostęp światła.

24 Karboksysomy wewnątrzkomórkowe struktury błonowe u bakterii autotroficznych. Zawierają enzym RuBisCo biorący udział w wiązaniu atmosferycznego CO 2. Osłony komórkowe - błona cytoplazmatyczna, ściana komórkowa, błona zewnętrzna, warstwy zewnątrzkomórkowe (otoczki lub śluz). Narządy ruchu - rzęski lub wici, umożliwiają poruszanie się w kierunku substancji odżywczych i ucieczkę przed substancjami toksycznymi. Autotrofy bakterie samożywne Heterotrofy org. cudzożywne

25 Funkcje ściany komórkowej i błony komórkowej nadają kształt i zabezpieczają przed ciśnieniem osmotycznym, są miejscem, w którym przebiega wiele reakcji, uczestniczą w przekazywaniu sygnałów do wnętrza komórki, są głównymi elementami systemu transportu i magazynowania energii, regulują przemieszczanie się substancji między komórką, a środowiskiem zewnętrznym: są przepuszczalne dla cząstek hydrofobowych ( N 2, O 2, węglowodorów) i małych cząstek polarnych (H 2 O, CO 2, gliceryny, mocznika), a nieprzepuszczalne dla aminokwasów, HCO 3-, Ca 2+, K +, Cl -, Mg 2+.

26 Budowa osłon komórkowych nm 2-10 nm E.P.Solomon, L.R.Berg, D.W.Martin,C.A.Villee, Biologia, Multico Oficyna Wydawnicza, 1996, Warszawa.

27 lipidy-tłuszcze Poryny kanały ( 2-3 nm średnicy) Liposacharydy G-ujemne Metoda Grama fiolet krystaliczny

28 Błona cytoplazmatyczna B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J.Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Podstawy biologii komórki, cz 1-2, PWN, 2007, Warszawa.

29 Rodzaje białek błonowych Białka transportujące - przenoszą określone substancje odżywcze, metabolity i jony przez dwuwarstwę lipidową. Białka kotwiczące - łączą błonę komórkową z makrocząsteczkami po obu stronach błony. Receptory wykrywają sygnały chemiczne w otoczeniu komórki i przekazują informacje do wnętrza komórki. Enzymy katalizują określone reakcje biochemiczne.

30 Sposoby wiązania białek błonowych z błoną cytoplazmatyczną B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J.Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Podstawy biologii komórki, cz 1-2, PWN, 2007, Warszawa.

31 Rodzaje transportu przez błony komórkowe dyfuzja bierna zachodzi zgodnie z gradientem stężenia, bez udziału energii (transport CO 2, O 2 ), dyfuzja ułatwiona - zachodzi zgodnie z gradientem stężenia, bez zużycia energii, ale z udziałem swoistych białek błonowych, np. transport wody przez akwaporyny, transport aktywny przebiega wbrew gradientowi stężeń; prowadzony jest z nakładem energii z udziałem białek transportowych, pierwotny transport aktywny wyrzucenie protonów na zewnątrz błony cytoplazmatycznej przy użyciu energii uzyskanej z hydrolizy ATP, absorpcji fotonu lub przepływu elektronów w procesach oddechowych (wytworzenie siły protonomotorycznej), wtórny transport czynny siła protonomotoryczna napędza transport różnych cząsteczek lub jonów przez błonę, przy udziale białek (permeaz).

32 Sposoby transportu cząsteczek i jonów B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J.Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Podstawy biologii komórki, cz 1-2, PWN, 2007, Warszawa.

33 Klasy białek transportujących Nośniki wiążą rozpuszczoną substancję po jednej stronie błony i przenoszą ją na drugą stronę towarzyszy temu zmiana konformacji nośnika. Są bardzo selektywne. Pompy białka transportujące daną substancję przez błonę z jednoczesnym wykorzystaniem energii (pompa protonowa). Kanały jonowe małe hydrofilowe pory, przez które substancja może przechodzić na drodze dyfuzji. Rozpoznanie cząsteczki transportowanej następuje na podstawie jej wielkości i ładunku elektrycznego. Przepływ jonów zmienia napięcie w po obu stronach błony (potencjał błonowy).

34 Pompa protonowa Energia konformacji białka NASTĘPNY CYKL B. Alberts, D. Bray, K. Hopkin, A. Johnson, J.Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter, Podstawy biologii komórki, cz 1-2, PWN, 2007, Warszawa.

35 Wzrost bakterii Komórki bakterii mogą rosnąć i dzielić się, żyjąc pojedynczo lub w koloniach. Czas podwojenia liczby komórek (generacji) - czas konieczny do przebiegu pełnego cyklu komórkowego. Jego długość waha się od kilku minut do kilku tygodni. Podłoża (pożywki) do hodowli bakterii: stałe (żel agarowy), płynne. Rodzaje hodowli: okresowe po pewnym czasie następuje wyczerpanie substancji odżywczych i nagromadzenie toksycznych produktów, ciągłe systemy przepływowe, do których w sposób ciągły wprowadza się świeże podłoże i usuwa jednocześnie jego nadmiar, utrzymując stały poziom płynu hodowlanego. Po pewnym czasie układ osiąga homeostazę.

36 Typowa krzywa wzrostu okresowej hodowli bakterii

37 Warunki wzrostu bakterii substraty odżywcze: CO 2, NH 3, alkohole, węglowodory, węglowodany, sole nieorganiczne, ( źródło C, N, P, S, H, O ), woda energia temperatura: 0-15 o C psychrofile, o C mezofile, o C termofile ph: tlen: acydofile, ok. 7.0 większość bakterii, alkalofile - tlenowce tlen jest niezbędny do ich wzrostu, - beztlenowce rosną tylko w warunkach, w których nie ma tlenu - względne beztlenowce - mogą rosnąć w obecności tlenu lub w warunkach beztlenowych

38 Warunki wzrostu bakterii substraty odżywcze: CO 2, NH 3, alkohole, węglowodory, węglowodany, sole nieorganiczne, ( źródło C, N, P, S, H, O ), woda energia temperatura: 0-15 o C psychrofile, o C mezofile, o C termofile ph: tlen: acydofile, ok. 7.0 większość bakterii, alkalofile - tlenowce tlen jest niezbędny do ich wzrostu, - beztlenowce rosną tylko w warunkach, w których nie ma tlenu - względne beztlenowce - mogą rosnąć w obecności tlenu lub w warunkach beztlenowych

39

40 Enzymy katalizatory biologiczne

41 Kataliza zjawisko polegające na obniżeniu energii aktywacji reakcji i zwiększeniu szybkości reakcji chemicznej i/lub skierowaniu reakcji na jedną z termodynamicznie możliwych dróg prowadzące do różnych produktów, w obecności niewielkich ilości substancji zwanych katalizatorami. KATALIZA heterogeniczna homogeniczna enzymatyczna Katalizator substancja obniżająca energię aktywacji reakcji, oddziaływuje chemicznie z substratami reakcji, tworzy nietrwałe połączenia przejściowe, nie jest zużywana w reakcji i nie występuje w równaniu stechiometrycznym

42 Enzymy- wielkocząsteczkowe, w większości białkowe, biokatalizatory przyspieszające specyficzne reakcje chemiczne Enzymy nie zmieniają końcowego składu mieszaniny reagującej ani stałej równowagi Jedynie przyspieszają osiągnięcie stałej równowagi w reakcjach termodynamicznie możliwych H 2 O 2 +H 2 O 2 O 2 + 2H 2 O katalaza

43 ROLA ENZMÓW Zwiększenie lokalnego stężenia substratów Tworzenie kompleksów multienzymatycznych Zabezpieczenie odpowiedniej orientacji przestrzennej substratom Stabilizacja stanów przejściowych, czyli obniżenie energii swobodnej aktywacji

44 Rys. obniżenie energii aktywacji

45 Rys porównania szybkości zdarzeń

46 Budowa enzymu jon metalu białko apoenzym kofaktor koenzym Jony metali Zn 2+ - anhydraza węglanowa Mg 2+ - fosfatazy Mn 2+ - fosfotransferazy Cu +/2+, Mo 2+ - oksydoreduktazy Fe 2+/3+, Ca 2+ - amylazy Koenzymy alifatyczne - glutation aromatyczne - ubichinony heterocykliczne - pochodne witaminy B 1 nukleotydy i nukleozydy - NAD +, NADP + żelazowo-porfirynowe cytochromy

47 Struktura enzymu na przykładzie plastocyjaniny Jon miedzi związany koordynacyjnie poprzez atomy azotu

48 lizozym

49

50 Zamek-klucz

51

52

53

54

55

56

57 Inhibicja emzymatyczna

58

59

60 Acetylocholinosteraza procesy w układach nerwowych

61

62 Rodzaje inhibicji enzymów kompetycyjna inhibitor reaguje z wolną formą enzymu, w wyniku czego nie jest możliwe przyłączenie substratu do enzymu związanego z inhibitorem (rys. a), niekompetycyjna inhibitor reaguje z kompleksem enzym-substrat (ES), zmieniając jego aktywność, ale nie zmieniając powinowactwa enzymu do substratu (rys. b), mieszana (połączona kompetycyjna i niekompetycyjna) inhibitor może wiązać się zarówno z wolnym enzymem, jak i z kompleksem ES (rys. c). a) b) c) W.Bednarski, J.Fiedurek, Podstawy biotechnologii przemysłowej, WNT, Warszawa, 2007.

63

64

65 Klasyfikacja enzymów 1. OKSYDOREDUKTAZY - reakcje red-ox 2. TRANSFERAZY - przenoszenie grup funkcyjnych 3. HYDROLAZY - reakcje hydrolizy 4. LIAZY - przyłączanie do podwójnych wiązań 5. IZOMERAZY - reakcje izomeryzacji 6. LIGAZY (SYNTETAZY)- tworzenie wiązań z równoczesnym oderwaniem grup fosforanowych z ATP

66 Oznaczanie enzymów (na przykładzie dehydrogenazy alkoholowej: i lipazy: ) Dehydrogenaza alkoholowa (nazwa potoczna) Oksydoreduktaza alkoholu:nad + (nazwa systematyczna) 1. (pierwsza cyfra) oznacza oksydoreduktazę 1. (druga cyfra) oznacza enzym działający na ugrupowanie CH-OH 1. (trzecia cyfra) oznacza, że przenośnikiem elektronów jest NAD + : 1. (czwarta cyfra) oznacza pierwszy enzym w tej grupie CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + NADH + H +

67 Lipaza 3. (pierwsza cyfra) - oznacza hydrolazę 1. (druga cyfra) - oznacza, że enzym działa na wiązanie estrowe, czyli katalizuje hydrolizę tłuszczów, podczas której tworzą się kwasy tłuszczowe 1. (trzecia cyfra) - oznacza, że enzym działa na estry kwasów karboksylowych 3. (czwarta cyfra) - oznacza trzeci enzym w tej grupie

68 Rola enzymu obniżenie energii aktywacji i przyspieszenie procesu biochemicznego H 2 O + CO 2 HCO 3- + H cząsteczek CO 2 / s (10 7 razy szybciej niż reakcja nie katalizowana)

69 Właściwości enzymu Enzym obniża energię aktywacji reakcji i zwiększa jej prędkość: np. reakcja H 2 O + CO 2 HCO 3- + H + katalizowana przez karboksylazę zachodzi z prędkością 10 5 cząsteczek / sek, czyli 10 7 razy szybciej niż reakcja nie katalizowana. Enzymy charakteryzują się wysoką specyficznością względem substratu (czasami absolutną) i względem katalizowanej reakcji chemicznej. Reakcja katalizowana zachodzi w miejscu zwanym miejscem aktywnym enzymu czyli w obszarze, który wiąże substrat. Oddziaływanie enzymu i substratu sprzyja tworzeniu stanu przejściowego o obniżonej energii swobodnej.

70 Ogólna charakterystyka miejsca aktywnego enzymu miejsce aktywne to szczelina lub zagłębienie utworzone przez grupy pochodzące z różnych części łańcucha aminokwasowego, miejsce aktywne zajmuje stosunkowo małą część całkowitej objętości cząsteczki enzymu, wiązanie substratu z enzymem zachodzi dzięki wielu słabym oddziaływaniom takim jak wiązanie elektrostatyczne, wodorowe, siły van der Waalsa, interakcje hydrofobowe, specyficzność wiązania zależy od precyzyjnego, określonego ułożenia atomów w miejscu aktywnym - substrat musi mieć odpowiedni kształt, pasujący do miejsca aktywnego: model klucza i zamka, model indukowanego dopasowania enzymu z substratem.

71 Wielopoziomowa regulacja działania enzymów regulacja ekspresji genu kodującego dany enzym, kontrola aktywności enzymatycznej poprzez umiejscowienie grup współpracujących ze sobą enzymów w określonych miejscach komórki, regulacja zmiany aktywności enzymu przez pewne cząsteczki, (cząsteczka inna niż substrat wiąże się w specjalnym miejscu regulatorowym, odmiennym od miejsca aktywnego, zmieniając szybkość przekształcania substratu w produkt).

72 Sprzężenie zwrotne: inhibicja pierwszego enzymu w szlaku metabolicznym przez odwracalne wiązanie produktu końcowego

73 Schemat allosterycznych oddziaływań między enzymem i substratem Przyłączenie cząsteczki w jednym miejscu enzymu prowadzi do zmian konformacyjnych przenoszonych w odległe miejsca cząsteczki enzymu. Konformacje te różnią się aktywnością.

74 Funkcje enzymu stwarzają odpowiednie warunki reakcji: wiążą w sposób specyficzny substraty, zwiększają ich lokalne stężenie, zabezpieczają ich odpowiednią orientację, tworzą kompleksy multienzymatyczne, przyspieszają reakcje stabilizując stany przejściowe przez obniżenie energii swobodnej aktywacji, enzymy allosteryczne biorą udział w przekazywaniu informacji i pełnią funkcje regulatorowe, przekształcają jeden rodzaj energii w drugi (np.atpaza).

75 Zastosowanie enzymów syntezy antybiotyków, leków steroidowych, aminokwasów, biotransformacje: przemysł spożywczy (procesy fermentacyjne), przemysł chemiczny, przemysł włókienniczy (półprodukty do produkcji tworzyw sztucznych), analityka medyczna, rolnictwo (pasze, środki ochrony roślin).

76 Kinetyka reakcji enzymatycznych Równanie Michaelisa - Menten E S k1 k2 ES k3 E P V k3 ES

77 W stanie równowagi: E S k k ES k1 2 3 k k ES 1 E S k 2 3 k 2 k k 1 3 K M ES E S 1 K M

78 Gdy [E]<< [S] to [S]=[S] całk i [E]=[E] całk [ES] ES S E ES 1 k M calk ES E calk S S K M V k 3 E calk S S K M dla [S] << K M V V max K M S dla [S] >> K M V=V max

79

80

81 Zależność początkowej szybkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu

82

83

84 Wyznaczanie stałych K M i V Równanie Lineweavera Burke a

85 Wartości K M niektórych enzymów enzym substrat K M (μm) β-galaktozydaza laktoza 4000 anhydraza węglanowa CO karboksylaza pirogronianowa pirogronian HCO 3 - ATP syntetaza arginylo-trna arginina trna L.Streyer, Biochemia, PWN Warszawa, 2000.

86

87

88 Metabolizm komórkowy i sposoby uzyskiwania energii Metabolizm całokształt reakcji chemicznych i związanych z nimi przemian energii zachodzący w komórkach. Podstawa wszelakich zjawisk biologicznych.

89

90 Metabolizm komórkowy anabolizm katabolizm procesy biosyntezy złożonych cząsteczek, wymagające dostarczenia energii procesy rozkładu dużych cząsteczek organicznych, dostarczające energię Energia pozyskana z rozkładu tylko częściowo zamieniana jest w pracę. Jest to tzw. energia swobodna (reszta rozpraszana jest w postaci ciepła). Energia swobodna wykorzystywana jest w syntezie, transporcie czy ruchu cząsteczek.

91 Szlaki metaboliczne Sposoby wykorzystywania energii Sposoby magazynowania energii aktywny transport substancji przez błony wzrost rozmnażanie ruch odpowiedź na bodźce utrzymanie homeostazy ATP - adenozynotrifosforan FAD - dinukleotyd flawinoadeninowy NAD - dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy NADP - fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego pompa protonowa

92 Podział bakterii ze względu na źródła energii i węgla Chemoorganotrofy (heterotrofy) źródło węgla i energii: substraty organiczne np. cukry, kwasy tłuszczowe, alkohole Chemolitotrofy (autotrofy) źródło energii: substraty nieorganiczne np. S 2-, S o, H 2, Fe 2+, NH 3 źródło węgla: utlenione związki węgla np. CO 2, węglany Fototrofy (autotrofy lub heterotrofy) źródło energii: światło źródło węgla CO 2 lub substraty organiczne

93 ATP adenozynotrójfosforan (adenosine triphosphate) ADP adenozynodwufosforan (adenosine diphosphate) NAD + - dwunukleotyd nikotynoamidoadeninowy (forma utleniona) NADH dwunukleotyd nikotynoamidoadeninowy (forma zredukowana)

94 ADP - forma uniwersalnego komórkowego nośnika energii ATP w postaci rozładowanej. Zawiera niewielką ilość energii do reakcji biochemicznych. ATP- adenozynotrifosforan. Uniwersalny nośnik i przekaźnik energii w komórkach. W typowej reakcji przekazania energii, krańcowa grupa fosforanowa ATP przyłącza się do cząsteczki innej substancji, przenosząc z sobą większość energii zawartej w wiązaniu chemicznym, którym była pierwotnie połączona w cząsteczce ATP. W wyniku tej rakcji powstaje ADP, z którego na ogół odtwarza się ATP. NAD + (NADH)- dinukleotyd amidoadeninowy. Koenzym wykorzystywany w procesach metabolicznych w komórkach jako akceptor lub donor protonu. NAD + bierze udział w reakcjach katabolicznych, w tym w oddychaniu komórkowym. NADP + (NADPH) fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego. Koenzym wykorzystywany w komórkach jako akceptor lub donor protonu. Bierze udział w reakcjach anabolicznych, w tym w fotosyntezie.

95 Sposoby uzyskiwania energii fotosynteza - energia światła absorbowana przez barwniki (bakteriochlorofile i karotenoidy) zostaje przetworzona w siłę protonomotoryczną lub energię chemiczną, fermentacja substrat jest metabolizowany bez udziału zewnętrznego (egzogennego) czynnika utleniającego.w wyniku tego procesu powstają proste związki oraz energia, oddychanie tlenowe (respiracja) substrat organiczny jest przekształcany z udziałem zewnętrznego czynnika utleniającego: tlenu, do wody i dwutlenku węgla. Energia wiązań zostaje przekształcona w ATP, oddychanie beztlenowe podobnie jak w oddychaniu tlenowym następuje utlenienie substratu organicznego lecz rolę zewnętrznych akceptorów elektronów pełnią azotany, siarczany lub fumarany.

96 Fotosynteza Fotosynteza seria złożonych reakcji przekształcających energię świetlną w energię chemiczną. Process odbywa się w organellach zwanych chloroplastami Fotosystemy Budowa - kompleks antenowy zbierający światło, zawierający setki cząsteczek pigmentów absorbujących światło (karoteny, chlorofil lub bakteriochlorofil) oraz centrum aktywne, w którym znajdują się dwie specjalne cząsteczki chlorofilu. Rola - zbieranie energii świetlnej i przekształcenie jej w energię chemiczną. LHC I i LHC II light harvesting complex

97 Chloroplasty Przestrzeń międzybłonowa w komórce Stroma Przemiany chemiczne węgla Tylakoidy Białka zbierające swiatło Centra reakcji Łańcuch transportu elektronów Syntaza ATP

98

99 Centrum reakcji i kompleksy zbierające światło, widok prostopadły do płaszczyzny błony komórkowej (góra) i z boku (dół). Kolor niebieski LH2, kolor zielony LH1, kolor żółty centrum reakcji.

100 Potencjał oksydacyjno-redukcyjny (mv) Fotosynteza oksygenowa ( z wytworzeniem tlenu) (w algach i cyjanobakteriach fotosystemy współdziałają ze sobą) -600 h P700* e - Ferredoksyna e - h P680* e - 0 ADP+P i Plastochinon e - Kompleks cytochromów światło e - 2H + (ze środowiska) NADP+ NADPH +400 światło ATP Plastocyjanina e - P700 Fotosystem I P680 Fotosystem II e - H 2 O ½ O 2 + 2H

101 Światło powoduje wyrzucenie z chlorofilu w fotosystemie PSII elektronu o dużej energii, który przesuwa wzdłuż łańcucha transportu elektronów. Powoduje to powstanie siły protonomotorycznej po obu stronach błony. Energia ta następnie zostaje wykorzystana do syntezy ATP (proces fotofosforylacji). Elektrony z fotosystemu PSI redukują NADP. Utleniony chlorofil w fotosystemie PSII pobiera elektrony pochodzące z rozkładu wody. Towarzyszy temu wydzielenie się cząsteczki tlenu. W reakcjach niezależnych od światła (reakcje ciemne) energia pochodząca z fotosyntezy wykorzystana jest do syntezy związków węgla z CO 2.

102

103 Fotosynteza anoksygenowa (bez wytworzenia tlenu) w bakteriach fotosyntetyzujących Widmo błony bakterii R. sphaeroides z zaznaczonymi chromoforami: Car karotenoidy, LH1 kompleks zbierający światło, RC centrum reakcji, Bpheo bakteriofeofityna, Bchl bakteriochlorofil.. Kim, E.-J., et al., International Journal of Hydrogen Energy, : p

104 Bakteriochlorofil b

105 Schemat fotosyntezy z udziałem bakterii fotosyntetyzujących (bakteriochlorofil)* 2 Potencjał oksydacyjno-redukcyjny (mv) h światło bakteriofeofityna ATP ADP+P i Ubichinon Kompleks cytochromu bc 1 Pul a UQ cyt c (bakteriochlorofil) 2

106 atp

107 nikotynazmide Budowa NAD + i NADH

108 Fermentacja Rodzaje fermentacji etanolowa mlekowa propionowa mrówczanowa masłowa metanowa mieszana

109 Fermentacja alkoholowa C 6 H 12 O 6 2C 2 H 5 OH + 2CO kcal ATP + H 2 O ADP + Pi 7.3 kcal 7.3 kcal 1ATP 14.6 kcal 2ATP kcal (ciepło)

110 Glikoli za duza

111 Glikoliza gora

112 Glikolza dól

113 Glikoliza (szlak Embdena-Meyerhofa-Parnasa) glukoza + 2ATP + 4ADP + 2NAD pirogronian + 2ADP + 4ATP + 2NADH Bilans netto: 2 NADH i 2ATP

114

115 Fermentacja kwasów mieszanych

116 Oddychanie tlenowe W obecności tlenu pirogronian uzyskany w procesie glikolizy jest przekształcany w acetylo-coa i CO 2. Następnie grupa acetylowa w acetylo-coa ulega przekształceniu do CO 2 i H 2 O w cyklu kwasu cytrynowego (cykl kwasów trójkarboksylowych). Proces ten dostarcza energii oraz prekursorów koniecznych do biosyntezy. W wyniku jednego cyklu uwalniają się dwie cząsteczki CO 2, powstaje jedna cząsteczka ATP, trzy cząsteczki NADH lub NADPH i jedna FADH (dinukleotyd flawino-adeninowy- akceptor i donor wodoru w komórkowych reakcjach metabolicznych, także w procesie fotosyntezy)

117 Cykl kwasu cytrynowego

118 Łańcuch transportu elektronów (łańcuch oddechowy) Powstający NADH (potencjał redoks 320 mv) przekazuje elektrony do tlenu (potencjał redoks +820 mv) w kilku etapach, wykorzystując nośniki elektronów o coraz wyższym potencjale redoks. Umożliwia to stopniowe uwalnianie energii zmagazynowanej w elektronach NADH. Ten łańcuch wyspecjalizowanych cząsteczek nazwano łańcuchem transportu elektronów lub łańcuchem oddechowym. W bakteriach zlokalizowany jest on w błonie cytoplazmatycznej. Uwolniona energia jest wykorzystywana przez komórkę do pompowania protonów poprzez błonę cytoplazmatyczną na zewnątrz. Tendencja protonów do powrotu na wewnętrzną stronę błony nazywana jest siłą protonomotoryczną (PMF). Siła ta może być wykorzystana do syntezy ATP (fosforylacja oksydatywna).

119 Składniki łańcucha transportu elektronów Flawoproteiny np. ferredoksyny - białka żelazowo-siarczkowe przenoszące tylko jeden elektron, silne reduktory o bardzo niskim potencjale redoks, chinony - zwiazki aromatyczne ulegające odwracalnej redukcji, mogą pobierać jeden lub dwa elektrony, a z każdym przenoszonym elektronem pobierają ze środowiska jeden proton, potencjał redoks około +30 mv, cytochromy - białka zawierające jedną lub więcej grup hemowych, pobierają elektrony i przekazują je dalej poprzez naprzemienną redukcję i utlenianie jonu żelaza, potencjał redoks cytochromu c wynosi +230 mv.

120 Duże stężenie tlenu Małe stężenie tlenu Oddychanie tlenowe E. coli J.Nickielin, K.Graeme-Cook, T.Paged, R.Killington, Krótkie wykłady Mikrobiologia, PWN, Warszawa, 2000.

121 Beztlenowe oddychanie E. Coli z wykorzystaniem azotanu J.Nickielin, K.Graeme-Cook, T.Paged, R.Killington, Krótkie wykłady Mikrobiologia, PWN, Warszawa, 2000.

122 Wydajność tworzenia ATP z glukozy Droga kataboliczna mole ATP/mol glukozy Oddychanie tlenowe 34 glikoliza 2 fermentacja 2-3

123 Wydajność tworzenia ATP z glukozy Droga kataboliczna mole ATP/mol glukozy Oddychanie tlenowe 34 glikoliza 2 fermentacja 2-3

124 Biopaliwa

125

126 XXXIX OKK

127 Rodzaje biopaliw wodór bioetanol biogaz estry kwasów rzepakowych (biodiesel)

128 Wodór ważny nośnik energii

129 Zastosowanie wodoru nośnik energetyczny, w petrochemii - do uwodornienia olefin i związków aromatycznych, izomeryzacji, krakingu, usuwania związków siarki i azotu, w metalurgii i przemyśle jądrowym - do usuwania tlenu, w przemyśle chemicznym - do produkcji amoniaku, metanolu, tworzyw sztucznych, w przemyśle elektronicznym - do produkcji włókien optycznych obwodów scalonych, przy produkcji mikrochipów Si.

130 Przemysłowe metody produkcji wodoru CH 4 + 2H 2 O CO 2 + 4H 2 C + H 2 O CO + H 2 CO + H 2 O CO 2 + H 2 CH 4 C + H 2 Elektroliza roztworów metali alkalicznych lub NaCl (elektrody niklowe)

131 Biologiczne metody otrzymywania wodoru biofotoliza wody przy użyciu alg i cyjanobakterii, fotofermentacja w obecności bakterii fotosyntetyzujących, fermentacja anaerobowa (ciemna) w obecności bakterii fermentujących, systemy hybrydowe wykorzystujące bakterie fermentujące i fotosyntetyzujące.

132 Ciemna fermentacja Mikroorganizmy bakterie anaerobowe ( np. Clostridium pasteurianum, Enterobacter cloacae) Enzym Fe-hydrogenaza (dwukierunkowa hydrogenaza żelazowa) katalizująca reakcję: 2H e - H 2 Enzym podczas wytwarzania wodoru nie zużywa ATP, jednak jest bardzo podatny na inhibicję tlenową.

133 Enzym zawiera pięć klastrów (centrów) żelazowo-siarkowych połączonych kowalencyjnie z białkiem. Jeden jest typu Fe 2 S 2, trzy Fe 4 S 4, a piąty, tzw. centrum H, składa się z dwóch subcentrów i zawiera sześć atomów żelaza. Cztery atomy znajdują się w konwencjonalnym centrum [4Fe-4S], które poprzez siarkę z reszt cysteiny połączone jest z biologicznie unikalnym subcentrum zwierającym dwa atomy żelaza skoordynowane ligandami CO i CN. Centrum Fe 2 S 2 Centrum Fe 4 S 4

134 H klaster w Fe-hydrogenazie z Clostridium pasteurianum D.Das, T.Dutta, K.Nath, S.M. Kotay, A.K.Das, T.N. Veziroglu, 2006, Current Science, 90, 1627

135 Warunki prowadzenia biologicznego procesu otrzymywania wodoru mieszana kultura otrzymana z naturalnych źródeł (kompost, osad z fermentacji anaerobowej, gleba), źródło węgla glukoza, odpadowa biomasa, ph około 5,5, niskie ciśnienie cząstkowe wodoru, (S 0 /X 0 ) ~ 4 (stosunek stężenia substratu w pożywce do biomasy w inokulum), odpowiednie stężenie jonów żelaza (zbyt niskie stężenie żelaza faworyzuje produkcję etanolu kosztem wydzielania wodoru), krótki hydrauliczny czasu zatrzymania ścieków (stosunek objętości czynnej reaktora do natężenia przepływu ścieków).

136 W czasie fermentacji, w obecności mieszanej kultury bakterii, oprócz reakcji prowadzących do utworzenia wodoru, zachodzi także wiele reakcji konkurencyjnych. Podczas tych reakcji zużywany jest substrat organiczny i mogą one prowadzić do zanieczyszczenia gazu dodatkowymi produktami np. metanem. Dlatego też konieczne jest zahamowanie tych procesów. glukoza pirogronian pirogronian + CoA + 2 Fd(ox) acetylo-coa +2 Fd(red) + CO 2 2 Fd(red) + 2 H + 2 Fd(ox) + H 2 C 6 H 12 O 6 + 2H 2 O 2CH 3 COOH + 4H 2 + 2CO 2 C 6 H 12 O 6 CH 3 CH 2 CH 2 COOH + 2H 2 + 2CO 2 C 6 H 12 O 6 3CH 4 + 3CO 2 CH 3 COOH + 2H 2 CH 3 CH 2 OH +H 2 O CH 3 COOH CH 4 + CO 2

137 Zalety procesu: bardzo duża szybkość wydzielania wodoru, możliwość wytwarzania wodoru w dzień i w nocy, możliwość stosowania różnych odpadowych substratów organicznych. Wada: w trakcie fermentacji powstają kwasy i alkohole. Obniża to opłacalność procesu, ponieważ zmniejsza się wydajność przekształcenia związku organicznego do wodoru. Konieczne jest ponadto dalsze oczyszczanie ścieku powstającego w czasie procesu.

138 Fotobiologiczne otrzymywanie wodoru Mikroorganizmy : Algi ( np. Chlamydomonas reinhardtii) Cyjanobakterie (Anabaena, Nostoc) Bakterie fotosyntetyzujące (Rhodobacter sphaeroides, Rhodospirillum rubrum) Enzymy: kompleks nitrogenazy (nitrogenaza) hydrogenaza NiFe

139 Kompleks nitrogenazy Dwuskładnikowy system metaloprotein składający się z reduktazy i dinitrogenazy: reduktaza (białko Fe) - przenosi elektrony z ferrodoksyny na dinitrogenazę, dinitrogenaza (białko FeMo) katalizuje reakcję wiązania azotu cząsteczkowego: N 2 + 8e - + 8H ATP +16 H 2 O 2 NH 3 + H ADP + 16P i gdy w środowisku brak jest azotu reakcja przebiega następująco: 2 H + + 4ATP + 2 Fd rd H ADP + 4 P i + 2 Fd ox

140 Rodzaje nitrogenaz molibdenowa zawiera molibden i żelazo w centrum kofaktora, jest najbardziej rozpowszechniona wśród mikroorganizmów, wanadowa - syntetyzowana, gdy w układzie znajduje się wanad, a brak jest molibdenu; charakteryzuje się największą szybkością wytwarzania wodoru, żelazowa - powstaje gdy w układzie brak jest molibdenu i wanadu.

141 Hydrogenaza NiFe (niklowo-żelazowa) Katalizuje proces utleniania wodoru cząsteczkowego (uzyskane elektrony użyte są do redukcji NAD + ): H 2 2 H + Hydrogenaza NiFe zbudowana jest z małej i dużej podjednostki. Mała podjednostka to trzy centra żelazowo-siarkowe, dwa typu [4Fe-4S] (patrz Fe hydrogenaza w ciemnej fermentacji) i jedno [3Fe-4S]:

142 Biofotoliza wody z udziałem alg lub cyjanobakterii Fotosynteza (warunki aerobowe) O 2 CO 2 H 2 O PSII PSI Fd RUBISCO [CHO] Biofotoliza bezpośrednia (warunki anaerobowe) 2 H 2 O 2 H 2 + O 2 O 2 H 2 O PSII PSI Fd H 2 asa H 2

143 Proces nie zawiera etapu wiązania CO 2 lub magazynowania energii w postaci metabolitów komórkowych - powstają tylko wodór i tlen, który jest jednakże silnym inhibitorem. Próba rozwiązania problemu inhibicji tlenem: rozdział reakcji wydzielania tlenu i wodoru (algi Chlamydomonas reinhardtii) warunek konieczny podłoże hodowlane pozbawione siarki Hodowla w pożywce pozbawionej siarki powoduje obniżenie szybkości fotosyntezy tlenowej natomiast nie zmienia szybkości respiracji. Po pewnym czasie trwania procesu wytwarzają się warunki anaerobowe bowiem cały tlen z fotosyntezy zostaje zużyty w respiracji. Podczas naświetlania obserwuje się wydzielanie wodoru oraz zużycie znacznych ilości wewnątrzkomórkowych substancji zapasowych: skrobi i białek. Czas wydzielania wodoru - około 100 godzin. Po tym okresie algi muszą powrócić do normalnej fotosyntezy w celu uzupełnienia substratu endogennego.

144 Fotofermentacja z udziałem bakterii Rhodobacter sphaeroides Enzymy: nitrogenaza hydrogenaza (NiFe hydrogenaza) - katalizuje proces utleniania wodoru cząsteczkowego Warunek konieczny wydzielania wodoru: atmosfera anaerobowa i brak azotu: 2 H ATP + 2 e H 2 + 4ADP + 4 P i W warunkach aerobowych natomiast zachodzi proces respiracji. Obserwuje się wtedy wzrost biomasy, ale nie wytwarza się wodór. Źródło energii światło Źródło węgla związki organiczne (kwas jabłkowy, mleczan, ścieki z produkcji kwasu mlekowego)

145 Schemat wytwarzania wodoru przez bakterie Rhodobacter sphaeroides światło H + na zewnątrz membrany H +, elektrony CO 2 aparat fotosyntetyczny H 2 synteza ATP ATP Hydrogenaza substrat cykl TCA H + Nitrogenaza H 2 H 2 elektrony Biosynteza, produkty wzrostu Koku, H. et al.. Int. J. Hydrogen Energy 2002, 27,

146 Warunki procesu wydzielania wodoru przez bakterie Rhodobacter sphaeroides O.U. 001 Podłoże jabłczan lub ścieki, makroelementy, cytrynian żelaza, witaminy lub ekstrakt drożdżowy, mikroelementy Warunki: temperatura 28 o C - 30 o C ph 7 C/N: 15/2 [mmol/mmol] natężenie oświetlenia: 5-13 klx inokulum 5 30% obj. konieczny jest etap aktywacji

147 Zalety procesu fotofermentacji duża wydajność przekształcania związku organicznego w wodór, brak tlenu - silnego inhibitora nitrogenazy, zdolność do wykorzystania szerokiego spektrum światła, możliwość wykorzystania związków organicznych pochodzących z odpadów lub ścieków Wady procesu nitrogenaza wymaga dużych ilości energii (4 ATP/H 2 ), co może zmniejszać wydajność przekształcenia energii świetlnej, niezbyt duża szybkość procesu.

148 Bioetanol

149 Roczna produkcja bioetanolu w USA (miliardy galonów) Źródło: Renewable Fuels Association

150 Zastosowanie etanolu napój alkoholowy rozpuszczalnik paliwo substrat w wielu syntezach organicznych substancja dezynfekująca składnik antyzamrażaczy Otrzymywanie etanolu Proces fermentacji etanolowej, polegający na przemianie cukrów, w obecności mikroorganizmów, dostarczający energii metabolicznej komórkom w warunkach beztlenowych (2 mole ATP/mol heksozy).

151 Mikroorganizmy

152 Produkcja etanolu z udziałem drożdży Saccharomyces cerevisiae Dekarboksylaza pirogronianowa dehydrogenaza Dehydrogenaza alkoholowa alkoholowa

153 Produkcja etanolu jest ściśle powiązana ze wzrostem komórek drożdży: ATP jest wykorzystane do biosyntezy masy drożdży (biomasa jest ko-produktem). Kontrola procesu: wewnątrzkomórkowa akumulacja ATP inhibituje aktywność enzymu fosfofruktokinazy, co w efekcie powoduje zahamowanie glikolizy. Teoretycznie: 1 g glukozy 0.51 g etanolu g CO 2 Praktycznie: 1 g glukozy około 0.46 g etanolu g CO 2 (wydajność 91 93%) Różnica: glukoza wykorzystana jest dodatkowo do syntezy biomasy i produktów ubocznych np. gliceryny i wyższych alkoholi.

154 Etanol ma negatywne działanie na błony komórkowe powodując ich dezintegrację i lizę. Drożdże mogą wzrastać w podłożu zawierającym do 120 g/l etanolu, a prowadzą fermentację aż do 200 g/l etanolu. Otrzymany w wyniku fermentacji etanol jest 15%. Niezbędne są ślady tlenu (0.05%) do syntezy NAD, steroli i nienasyconych kwasów tłuszczowych.

155 Bakterie Zymomonas mobilis Bakterie anaerobowe, gramujemne, wyizolowane w procesie produkcji napoju alkoholowego (pulque) otrzymanego z fermentującego soku agawy maguey (Meksyk). Fermentacja heksoz: 1 mol heksozy 2 mole etanolu + 2 mole CO mol ATP Maksymalna wydajność procesu (97%) jest wyższa niż przy zastosowaniu drożdży (93%) bowiem w przypadku bakterii produkowana jest mniejsza ilość biomasy, a więc więcej węgla wykorzystywane jest do tworzenia etanolu. Ograniczenia: wąskie spektrum substratów: D-glukoza, D-fruktoza, sacharoza (w tym ostatnim przypadku tworzy się jednocześnie sorbitol, który powoduje zmniejszenie wydajności powstawania etanolu).

156 A.Chmiel, Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, PWN, Warszawa, 1998.

157 Surowce stosowane w procesie produkcji etanolu cukry proste skrobia produkty uboczne z przemysłu rolno-spożywczego (serwatka, melasa) surowce ligninocelulozowe (biomasa roślinna zawierająca celulozę i ligninę)

158 Skrobia - źródło cukrów prostych Źródło skrobi zawartość [%] ryż pszenica jęczmień owies żyto kukurydza ziemniaki 12-22

159 Przemysłowe metody otrzymywania etanolu Surowce: ziemniaki, żyto, buraki cukrowe Procesy: hydroliza skrobi za pomocą - i -amylaz zawartych w słodzie gorzelnianym, 60 0 C, ph , fermentacja (drożdże), C, ph 4.5, 3 doby, destylacja zawartość alkoholu 92%, (produkty uboczne: aldehydy, wyższe alkohole, estry, kwasy organiczne), rektyfikacja zawartość alkoholu - 96%, odwodnienie: 99.5 % - środki odwadniające: CaO, Na 2 SO 4. Wydajność: 100 kg skrobi 63 litry 100% etanolu.

160 Biokonwersja surowców lignocelulozowych

161 Celuloza (C 6 H 10 O 5 ) n gdzie n = Hemiceluloza (C 5 H 8 O 4 ) n gdzie n =

162 Lignina Inaczej drzewnik. Polimer o złożonej budowie, pochodna fenoli. W przemyśle papierniczym oddzielana od celulozy poprzez rozpuszczanie w kwaśnym siarczynie sodowym (NaHSO3).

163 Struktura ligniny w dębie francuskim

164 Porównanie udziału biomasy wykorzystywanych źródłach energii

165 Produkcja etanolu z surowców lignocelulozowych Metody hydrolitycznego rozkładu związków homopolisacharydów (celulozy) i heteropolisacharydów (ligniny): fizyczne mielenie, napromieniowanie, temperatura, chemiczne działanie zasadami, kwasami, utleniaczami, reduktorami, rozpuszczalnikami organicznymi, biologiczne stosowanie grzybów z rodzaju Pleurotus, Phlebia, Trichoderma reesei oraz ich mutantów.

166 Enzymy hydrolizujące celulozę: endoglukanaza odcina końcowe elementy łańcucha egzoglukanaza rozcina wiązania wewnątrz łańcucha struktura celulozy

167 Produkcja etanolu metodą pośrednią biosynteza celulaz przygotowanie substratu hydroliza enzymatyczna (scukrzanie) fermentacja hydrolizatu destylacja alkoholu Zalety: łatwe sterowanie procesem i jego optymalizacja Wady: wolna hydroliza, zwiększone stężenie celobiozy i glukozy hamuje aktywność celulaz Ulepszenie procesu: przyspieszenie hydrolizy celobiozy i celodekstryny dzięki zastosowaniu dodatkowo -glukozydazy z Aspergillus niger.

168 Produkcja etanolu metodą bezpośrednią Enzymatyczna hydroliza celulozy i fermentacja sacharydów prowadzona jest w jednym bioreaktorze. Mikroorganizmy: bakterie Clostridium thermocellum, 1 mol glukozy ( z hydrolizy celulozy) 1 mol etanolu, grzyby strzępkowe: Fusarium oxysporum (hydroliza heksoz i pentoz) mieszane kultury: Clostridium thermocellum i Clostridium termosaccharolyticum Zalety: Wydajność etanolu wyższa o 25 40% niż w metodzie pośredniej Trudności: Różnica między optymalną temperaturą hydrolizy celulozy (45-50 O C) i fermentacji cukrów (28-35 O C)

169 Biogaz

170 Bakterie metanogenne bezwzględne beztlenowce ( dopuszczalne stężenie tlenu < 0.01 mg/l), mała szybkość wzrostu (czas generacji 10 h), temperatura fermentacji o C (optymalna o C), ph

171 Surowce stosowane w fermentacji metanowej odpady roślinne, fekalia, osady z oczyszczalni, odpady przemysłu rolno-spożywczego, ścieki mleczarskie, browarnicze, gorzelniane, cukrownicze, z przemysłu papierniczego i rzeźni

172 Schemat metanogenezy biomasa hydroliza aminokwasy cukry kwasy tłuszczowe gliceryna acetogeneza acidogeneza kwas octowy H 2, CO 2 metanogeneza biogaz alkohole kwas propionowy kwas masłowy acetogeneza

173 Reakcje metanogenezy

174 Skład biogazu Teoretycznie: 65% metanu + 35% dwutlenku węgla W praktyce: 55-75% metanu, 25-45% CO 2, 0-0.3% N 2, 1-5% H 2, 0-3% H 2 S Doczyszczanie biogazu: absorpcja CO 2 w wodzie ( 25 razy lepiej rozpuszczalny niż metan), adsorpcja chloru na węglu aktywnym, utlenianie siarkowodoru: Fe 2 O H 2 S Fe 2 S H 2 O 2 Fe 2 S O 2 2Fe 2 O 3 + 6S

175 Zalety i wady energii z biogazu Zalety: energia czysta i odnawialna, zdecentralizowana produkcja energii (bez strat podczas przesyłania), koszty zbliżone do kosztów uzyskania energii ze źródeł konwencjonalnych, możliwość stosowania w krajach rozwijających się, poprawa stanu sanitarno-epidemiologicznego. Wady: konieczność przestrzegania wymagających warunków technologicznych, nakłady inwestycyjne (budowa fermentatorów).

176 Biodiesel

177 Kwasy tłuszczowe stosowane jako biopaliwo olej słonecznikowy olej rzepakowy olej sojowy olej arachidowy olej z nasion bawełny

178 Zalety kwasów tłuszczowych jako paliwa: płynny stan skupienia, wysoka energetyczność (80% paliwa diesla), dostępność surowca, odnawialność. Wady kwasów tłuszczowych jako paliwa: duża lepkość, niska lotność, tworzenie koksów, tworzenie gum w czasie magazynowania (utlenianie i polimeryzacja), zabrudzenie oleju smarnego.

179 Metody otrzymywania biodiesla (mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych) piroliza - powstaje mieszanina nienasyconych estrów metylowych, 1-olefin, n-parafin alkoholiza (transestryfikacja) w obecności alkoholu (metanol, etanol butanol, propanol) tworzą się estry kwasów tłuszczowych i gliceryna katalizatory alkalia NaOH, KOH, węglany, alkoholany sodu lub potasu, kwasy kwas siarkowy, kwas sulfonowy, kwas solny, enzymy lipazy

180 Schemat transestryfikacji tłuszcz + alkohol katalizator ester + gliceryna triglicerydy diglicerydy monoglicerydy W praktyce stosowana jest kataliza alkaliczna (najszybsza). Proces zachodzi w trzech etapach, konieczny stosunek wagowy alkoholu do oleju wynosi 6:1, a temperatura, zależnie od rodzaju surowca, o C. Substraty muszą być bezwodne ( 0.06% w/w), o niskiej zawartości nasyconych kwasów tłuszczowych. Produkt zawiera mieszaninę estrów, gliceryny, alkoholu, katalizatora oraz tri-, di- i monoglicerynianów.

181 Optymalizacja procesu: redukcja kosztów surowych materiałów (60 70%) i procesu, zwiększenie dostępności surowców Możliwości rozwiązań: zastosowanie odpadowego, zużytego oleju po smażeniu, zastosowanie procesu ciągłego, zagospodarowanie produktu ubocznego - gliceryny.

182 Produkcja piwa Napój produkowany z wody, słodu jęczmiennego, szyszek chmielowych i drożdży z rodzaju Saccharomyces

183 Surowce słód, woda, drożdże, chmiel, składniki podstawowe preparaty enzymatyczne i stabilizujące, dodatki % (kukurydza, ryż, pszenica).

184 Schemat produkcji piwa otrzymywanie słodu mielenie słodu zacieranie słodu brzeczka gotowanie z chmielem oddzielanie osadów chłodzenie fermentacja (dodanie drożdży) dojrzewanie (leżakowanie) filtracja stabilizacja rozlewanie

185

186 Otrzymywanie: Słód moczenie ziarna jęczmienia browarnego 40 godz, kiełkowanie na plaskich paletach -5 dni, suszenie wyskotemperaturowe Cel słodowania: wytworzenie i uaktywnienie enzymów (głównie amylazy) obecnych w ziarnie, niezbędnych do rozkładu skrobi i białek w czasie zacierania. Rodzaje słodów: jasne (pilzneńskie), ciemne (monachijskie), karmelowe, barwiące.

187 Zacieranie Cel procesu: hydroliza skrobi, β-glukanu, białek (75 %) transformacja do cukrów prostych głownie maltozy czas trwania 1-2 godz. Dekstryny nie ulegają fermentacji Enzymy: hemicelulaza, α-amylaza, β-amylaza, endopeptydazy, endo-β-glukanaza ph Temperatura: stopniowe podgrzewanie od 37 o C do 76 o C czas trwania 1-2 godzin Skład brzeczki po zacieraniu: maltoza 44%, dekstryny 31%, maltotrioza 11%, glukoza 9%, sacharoza 3%, fruktoza 2%, aminokwasy mg/100 cm 3.

188 Dodawanie do brzeczki: Niesłodowany jęczmień - grys lub mąka Ryż Pszenica Odtłuszczona kukurydza - płatki

189 Gotowanie brzeczki z chmielem - warzenie ekstrakcja i transformacja związków występujących w chmielu (αkwasy podlegają izomeryzacji do izo-α-kwasów; dłuższy czas gotowania i wyższe ph brzeczki zwiększa ilość izo-α-kwasów i goryczkę piwa), sterylizacja, wytrącenie osadów, nadanie odpowiedniego smaku i zapachu, ustalenie barwy, zakwaszenie, zagęszczenie, inaktywacja enzymów.

190 Fermentacja brzeczki i leżakowanie piwa Fermentacja główna (5-14 dni) drożdże: Saccharomyces cerevisiae carslbergensis, (dolna) - pils Saccharomyces cerevisiae cerevisiae (górna) Ale, Weissbier Rodzaje fermentacji fermentacja górna - przebiega w temp o C, po niej następuje kilkudniowe dojrzewanie przy C, fermentacja dolna odbywa się w temp o C, a dojrzewanie około 0 o C. Dojrzewanie piwa (leżakowanie) fermentacja końcowa (wtórna); czas procesu 3-6 tygodni w zależności od stosowanej metody

191 Sposoby prowadzenia procesów dolnej fermentacji fermentacja główna przebiega w temp. do 10 o C, a fermentacja końcowa poniżej -1 o C, fermentacja główna przebiega w temp o C, a fermentacja końcowa poniżej -1 o C, fermentacja główna przebiega w temp. do 10 o C, z zastosowaniem okresu ciepłego (12-14 o C), a fermentacja końcowa poniżej -1 o C, fermentacja pod ciśnieniem (0.7-1 bar).

192 Woda w produkcji piwa zużycie: 6-7 l wody/l wyprodukowanego piwa, woda wykorzystywana jest głównie podczas przygotowania słodu, w procesie zacierania i do mycia urządzeń, miękka woda - piwo o łagodnym słodkawym posmaku (piwo jasne), twarda woda np. bogata w węglan wapnia (piwo ale).

193

194 Błędy w produkcji piwa 1. Zmętnienie obecność szczepów dzikich drożdży, bakterii mlekowych lub octanowych 2. Kwaśnienie piwa bakterie mlekowe i octanowe 3. Pleśnienie piwa (Mucor, Aspergillus, Penicilinum) 4. Utlenianie dodawanie antyoksydantów

195 Fermentacja mlekowa

196 Wytwarzanie produktów mlecznych W czasie fermentacji laktozy powstaje kwas mlekowy, następuje koagulacja białka i hydroliza kazeiny. Jogurt odtłuszczone mleko zaszczepia się mieszaniną bakterii Streptococcus thermophilus i Lactobacillus bulgaris (w równych ilościach) i poddaje fermentacji przez parę godzin w temperaturze 43 o C. Istotnym elementem procesu jest zwiększenie zawartości suchej substancji mleka poprzez zagęszczenie lub dodanie odtłuszczonego mleka w proszku. Kefir pełne mleko zaszczepia się grzybkami kefirowymi (bakterie Leuconostoc kefir, Streptococcus lactis, Lactobacillus brevis, L. acidophilus, oraz drożdże Saccharomyces carlsbergensis) i fermentuje w temperaturze o C przez godzin.

197 Sery do mleka wprowadza się inoculum bakterii mlekowych. W czasie fermentacji kazeina mleka jest hydrolizowana przez trypsynę, podpuszczkę i pepsynę. Kolejne etapy procesu to gotowanie, prasowanie i dojrzewanie tworzącego się sera. Przy produkcji serów niebieskich (blue cheese) stosuje się ponadto bielenie za pomocą nadtlenków i dodatek pleśni Penicilinum roqueforti. Dojrzewanie sera polega na rozkładzie białek i tłuszczów oraz przemianie sacharydów i kwasów organicznych. Rozkład białek i tłuszczów prowadzi do wytworzenia odpowiedniego zapachu, smaku i konsystencji sera. Przemiana cukrów i kwasów powoduje zmianę kwasowości oraz oczkowanie sera. Sery dojrzewają w temp o C. Podczas produkcji serów szwajcarskich po 3-5 tygodniach przenosi się je do temp o C, aby zintensyfikować tworzenie oczek przez bakterie propionowe (produktami fermentacji są kwas propionowy, woda i CO 2 ). Następnie ponownie umieszcza się sery w pomieszczeniach chłodniejszych.

198 Wino

199 Wino napój alkoholowy otrzymywany w wyniku fermentacji alkoholowej miazgi lub soku winogron Ok.1000 składników % woda do 14 % alkohol etylowy gliceryna węglowodany fenole kwasy organiczne sole mineralne

200 Wino najbardziej udana próba jaką podjął człowiek, by przełożyć coś łatwo psującego się na coś bardzo trwałego Wino doustny środek imaginogenny. John Arlott ( ) Ś.O.Pogrobelski Wstęp do imaginoskopii, str. 14 Wino- owoc winorośli i pracy człowieka- nie jest zwykłym dobrem konsumpcyjnym. Towarzysząc człowiekowi od tysiącleci, wino czerpie zarówno z sacrum jak i profanum. Jest wartością cywilizacji i kryterium jakości życia. Stanowi dobro kultury. Jest czynnikiem życia społecznego, a historia wina jest nierozłącznie związana z dziejami ludzkości.

201 Związki biologicznie czynne

202 Aminokwasy Antybiotyki

203

204 Aminokwasy egzogenne Pobierane z środowiska zewnętrznegoorganizm nie potrafi ich zsyntetyzować fenyloalanina histydyna izoleucyna leucyna lizyna metionina treonina tryptofan walina Aminokwasy endogenne- Syntetyzowane bezpośrednio w organizmie ludzkim lub zwierząt wyższych alanina arginina asparagina kwas asparaginowy cysteina glicyna glutamina kwas glutaminowy prolina seryna tyrozyna Na skalę przemysłową - produkcja kwasu glutaminowego, metioniny, lizyny. Zastosowanie preparaty paszowe oraz w przemyśle spożywczym, farmaceutycznym, kosmetycznym.

205

206 Listownica japońska, jap. kombu E 621 Glutaminian sodu

207 Lizyna Lizyna to aminokwas egzogenny i należy go pozyskiwać z pożywienia, albowiem organizm człowieka nie potrafi go produkować. Jest ona bardzo ważnym składnikiem potrzebnym do wzrostu, naprawy tkanek i produkcji hormonów, enzymów i przeciwciał. Jest potrzebna do prawidłowej budowy kości u dzieci. Pomaga wchłaniać wapń i utrzymuje prawidłową równowagę azotową u osób dorosłych. Lizyna przyspiesza tworzenie kalogenu i regenerację tkanek. Jest wskazana dla osób po zabiegach chirurgicznych i urazach sportowych, ponieważ stymuluje budowę białek mięśniowych. Aminokwas ten także zwalcza wirusa opryszczki. L-lizyna może skutecznie zwalczać infekcje i zapobiegać ich nawrotom. Suplementy zawierające L-lizynę mogą także skutecznie łagodzić skutki ostrego zatrucia alkoholem.

208 Metionina

209 wpływa na przemianę lipidową, uczestniczy w procesie transmetylacji, jest niezbędna w syntezie choliny, kreatyny, adrenaliny, jest ważnym regulatorem układu nerwowego i mięśniowego szczególnie istotnym dla utrzymania prawidłowego wzrostu i stanu tych tkanek, neutralizuje wolne rodniki dzięki czemu działa stabilizująco na DNA i działa przeciwnowotworowo, jest potrzebna do biosyntezy cysteiny, karnityny, tauryny, lecytyny, spowalnia proces degradacji białek w stanach chorobowych i oparzeniach, przeciwdziała stłuszczeniu hepatocytów czyli komórek wątrobowych, reguluje pracę tarczycy, działa detoksykacyjnie.

210 Mechanizmy negatywnej kontroli metabolicznej Geny odpowiedzialne za biosyntezę danego aminokwasu kontrolują aktywność enzymów biorących udział w tym procesie, aby nie dopuścić do jego nadprodukcji: w środowisku zawierającym określony aminokwas w ilości wystarczającej do normalnego rozwoju komórki, zablokowana jest synteza enzymów biorących udział w jego wytwarzaniu; w warunkach nadmiaru aminokwasów hamowana jest aktywność wszystkich kluczowych enzymów szlaku metabolicznego lub tylko pierwszego enzymu w jego odgałęzieniu prowadzącym do wytworzenia danego aminokwasu. Przemysłową produkcję aminokwasów prowadzi się w warunkach rozregulowanego systemu kontroli, która prowadzi do nadprodukcji.

211 Czynniki sprzyjające nadprodukcji aminokwasu wzrost przepuszczalności przez błonę cytoplazmatyczną - zwiększony transport aminokwasu na zewnątrz komórki spowodowany deficytem biotyny (do 5 g/dm 3 ), dodatkiem nasyconych kwasów tłuszczowych C 16 C 18, lub detergentów, odcinanie rozgałęzień szlaku metabolicznego przez wprowadzenie nadmiaru produktu tego rozgałęzienia, dodatek do podłoża prekursorów - substancji przeciwdziałających regulacji metabolicznej szlaku, mutageneza wprowadzenie mutantów ze zwiększoną aktywnością enzymów katalizujących biosyntezę danego aminokwasu.

212 Produkcja kwasu L-glutaminowego Proces ten może przebiegać według dwóch różnych szlaków metabolicznych: w warunkach dużego stężenia jonu NH 4 + proces katalizuje dehydrogenaza glutaminianowa: NH oksoglutaran 2- + NADPH + H + L-glutaminian - + NADP + +H 2 O gdy stężenie jonu NH mmole/dm 3 udział biorą syntetaza glutaminowa i syntaza glutaminianowa. NH oksoglutaran 2- + NADPH + H + + ATP L-glutaminian - + NADP + + ADP + P i

213 Warunki prowadzenia procesu bakterie - Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, źródła węgla glukoza, sacharoza, melasa, hydrolizaty skrobiowe, metanol, etanol, źródła azotu sole amonowe, amoniak, mocznik, makro- i mikroelementy, temperatura 32 o C, a następnie 38 o C, ph 8, intensywne napowietrzanie (hamuje syntezę -ketoglutaranu powodującego zmniejszenie ilości kwasu glutaminowego), Wydajność procesu 100g/dm 3 po godzinach hodowli.

214 Produkcja L-lizyny szczawiooctan L-asparaginian kinaza asparaginianowa semialdehyd asparaginianowy dehydrogenaza homoserynowa dihydrodipikolinian L-homoseryna L-lizyna L-metionina L-treonina Biosyntezę L-lizyny prowadzi się w warunkach wysycenia komórki L-treoniną i L-metioniną, co powoduje zablokowanie syntezy tych aminokwasów.

215 Regulacja procesu Kinaza asparaginianowa hamowana jest przez jednoczesny nadmiar L-lizyny i L-treoniny (1 mmol/dm 3 ), a stymulowana przez L-izoleucynę i L-walinę. Aktywność dehydrogenazy homoserynowej regulowana jest niezależnie od aktywności kinazy asparaginianowej. Warunki prowadzenia procesu bakterie - Corynebacterium glutamicum, Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, podłoże zawiera g/dm 3 biotyny, L-homoserynę lub L-treoninę, L-metioninę i L-izoleucynę, źródło węgla glukoza, etanol, kwas octowy, ph 7, temperatura 30 o C, napowietrzanie, czas trwania procesu 48 godzin.

216 Rola lizyny w organizmie 1.Niezbędna przy budowie białek, głównie w mięśniach i w kościach, istotna w okresie rozwoju. 2.Wchłania wapń, poprawia koncentrację umysłową. 3.Łagodzi objawy przeziębienia, grypy oraz opryszczki. 4.Obecna przy wytwarzaniu hormonów, przeciwciał, enzymów i przy budowie kolagenu. 5.Jej niedobór skutkuje objawami zmęczenia i rozdrażnienia, powoduje anemię i wypadanie włosów. 6.Najprawdopodobniej jeden z czynników wpływających w dużej mierze na procesy antykancerogenne w połączeniu z dużymi dawkami antyoksydantów. 7.Uczestniczy w procesach odnowy tkanek, tworzenia się przeciwciał, stymulacji wzrostu, a także wytwarzania hormonów i enzymów.

217 Antybiotyki

218 Antybiotyk specyficzny inhibitor procesów biologicznych. ( antybioza oznacza brak możliwości współżycia między dwoma mikroorganizmami). Penicylina odkrycie r. (Aleksander Fleming), oczyszczenie 1939 r. (Florey, Chain), Nobel produkcja na skalę przemysłową 1942 r., zwiększenie wydajności procesu r. (zastosowanie grzyba Penicillium chrysogenum, mutacja gazem musztardowym, promieniowaniem UV i rentgenowskim wydajność 7 g/l), współczesne mutanty wydajność 20 g/l. Penicillinum roquefortii sery pleśniowe

219 Penicylina

220 Penicylina G

221

222 Antybiotyki uzyskuje się na skalę przemysłową metodami syntezy chemicznej. Wiele z nich jest produkowanych metodami biotechnologicznymi. Pojemność fermentora (bioreaktora) ok. 50 do 300 m³. W bioreaktorach przeprowadza się reakcje biosyntezy antybiotyków naturalnych przez odpowiednie drobnoustroje oraz reakcje biotransformacji. Biotransformacja (w syntezie antybiotyków) polega na przekształceniu związków chemicznych w antybiotyki za pomocą enzymów formie czystej, mikroorganizmów lub komórek organizmów wyższych. Produkt jaki możemy otrzymać z danego substratu zależy od wielu czynników. Najważniejsze z nich to: *rasa drobnoustroju *ph, *stężenie substratu, *użyte do hodowli składniki odżywcze i inne warunki hodowli, *użyte dodatkowe substancje, np. inhibitory enzymów

223