Abstract. Keys words: Candida abicans, resistance, azole, enzymatic

Transkrypt

1 Streszczenie Celem pracy było określenie związku pomiędzy opornością na azole a aktywnością enzymów hydrolitycznych szczepów Candida albicans. Materiał stanowiły 122 szczepy Candida albicans uzyskane z próbek klinicznych (plwocina, ropa, mocz, krew, aspirat z oskrzeli) pochodzących od chorych hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Szpitalu im. Jana Pawła II w Nowym Targu w latach Izolację grzybów C. albicans wykonano poprzez posiewy materiału klinicznego na podłoże Sabourauda oraz na podłoże różnicujące Candida. Do potwierdzenia identyfikacji szczepów C. albicans wykorzystano testy biochemiczne ID32C (BioMerieux). Wrażliwość na leki azolowe oceniano przy użyciu testów ATBFungus2 (BioMerieux), z kolei aktywność enzymatyczną oceniano z wykorzystaniem testów ApiZym (Bio- Merieux). W analizie statystycznej zastosowano test mediany i test korelacji rang Spearmana. Wyniki analizy korelacji wykazują, że istnieje istotna statystycznie zależność pomiędzy opornością na azole, a aktywnością enzymów hydrolitycznych: esteraz, arylamidazy leucynowej, arylamidazy cystynowej, fosfohydrolazy, α-glukozydazy i N-acetylo-beta-glukozaminidazy. Wzrostowi oporności na flukonazol towarzyszy spadek aktywności esterazy, lipazy esterazowej, α-glukozydazy, fosfohydrolazy i N-acetylobetaglukoza-minidazy i wzrost aktywności arylamidazy leucynowej i arylamidazy cystynowej. Szczepy Candida albicans oporne na azole różnią się od wrażliwych aktywnością enzymów hydrolitycznych. Wzrostowi oporności na flukonazol towarzyszy wzrost aktywności arylamidazy leucynowej i arylamidazy cystynowej, co może mieć wpływ na wzrost inwazyjności badanych szczepów. Korelacje pomiędzy opornością na azole, a aktywnością enzymów mogą sugerować udział azoli w tworzeniu enzymatycznego fenotypu oporności. Słowa kluczowe: Candida abicans, oporność, azole, aktywność enzymatyczna Abstract The aim of the study was the assessment of the correlation between resistance to azole drugs and hydrolytic activity of the Candida abicans strains. 122 Candida albicans strains were isolated from clinical samples (sputum, puss, urine, blood bronchial aspirate) obtained from patients hospitalized at the Independent Public Hospital Memorial Jan Paweł II in Nowy Targ. Candida albicans strains were isolated on Sabourauda media and Candia differential media. Identification was based on Candida ID32C tests (biomerieux). ATB Fungus2 (biomerieux) strips were used for testing the susceptibility to azole drugs. atic activity was determined by using API ZYM tests (biomerieux). The Rang-Spearmann correlation and the median test were used for statistical analysis. P<0.05 level was adopted for the assessment of statistical significance. The correlation analysis demonstrated the statistically significant relationship between resistance to azole drugs and the activity of the following enzymes: esterases, leucine arylamidase, cystine arylamidase, phosphohydrolase, α-glucosidase and N-acetyl-β-glucosaminidase. The increasing resistance to fluconazole is accompanied by a decrease in the activity of esterase, esterase lipase, α-glucosidase, phosphohydrolase and N-acetylβ-glucosaminidase and by an increase in the activity of leucine arylamidase and cystine arylamidase. Candida albicans strains resistant to azole drugs differed from the sensitive strains in hydrolytic activity. An increase of resistance to fluconazole is accompanied by an increase of activity of leucine arylamidase and cystine arylamidase which can affect the invasiveness of tested strains. The correlation between resistance to azole drugs and enzymes activity may suggest the azole participation in the formation of the enzymatic phenotype of resistance. Keys words: Candida abicans, resistance, azole, enzymatic activity Wykaz stosowanych skrótów: MIC - (z ang. Minimal Inhibitory Concentration) - minimalne stężenie hamujące, CLSI (d.nccls) (z ang. Clinical and Laboratory Standards Institute) Instytut Standaryzacji Klinicznej i Laboratoryjnej

2 Wstęp Proces zakażenia drożdżakami z rodzaju Candida można podzielić na cztery etapy. Pierwszym jest kolonizacja, następnie zakażenie powierzchniowe, zakażenie głębokie i w końcu zakażenie rozsiane. Istnieje wiele czynników wirulencji grzybów, które odgrywają istotną rolę na każdym etapie tego procesu. Należą do nich: zmiana fenotypu, wytwarzanie adhezyn oraz wydzielanie enzymów hydrolitycznych rozkładających białka, lipidy, czy węglowodany [1, 2]. Proteazy Candida rozkładające białka cechuje brak specyficzności substratowej, różnią się natomiast miejscem i mechanizmem rozszczepiania łańcucha polipeptydowego. Proteazy mogą upośledzać mechanizmy obronne gospodarza, między innymi zaburzać czynność leukocytów wielojądrzastych, wywoływać cytolizę makrofagów oraz rozszczepiać immunoglobuliny i białka dopełniacza. Biorą też udział w rozwoju stanu zapalnego, ponieważ uwalniają prozapalne cytokiny z ich prekursorów, aktywują proteazy gospodarza i inaktywują inhibitory proteaz [3, 4]. Wykazano różnice w aktywności proteaz aspartylowych u szczepów Candida wyizolowanych z różnych materiałów biologicznych z ostrym lub przewlekłym przebiegiem kandydozy [5, 6]. Wytwarzane przez Candida lipazy trawią lipidy, które stanowią dla nich źródło substancji odżywczych, a ich obecność wspomaga adherencję drożdżaków do komórek gospodarza [7]. Fosfolipazy grzybów odgrywają ogromną rolę w aktywności przeciwgrzybiczej niektórych leków, takich jak np. nowe lipidowe warianty amfoterycyny B, ponieważ umożliwiają selektywne uwalnianie aktywnej amfoterycyny B w miejscach infekcji grzybiczej [8]. Istnieje związek morfologii kolonii grzybów, które występują w dwóch postaciach: blastospor i pseudostrzępek z aktywnością enzymatyczną. Obie formy wykrywano w tkankach, przy czym formy pączkujące łączono z zakażeniem bezobjawowym zaś formy nitkowate z objawowym [9]. Uważa się, że rozwój drożdżaka w postaci nitkowatej, dzięki wysokiej aktywności enzymów proteolitycznych, charakteryzuje się większą zjadliwością związaną ze zdolnością strzępek do trawienia i penetrowania tkanek gospodarza [3, 10, 11]. y hydrolityczne również odgrywają dużą rolę w adherencji poprzez zmianę struktury przestrzennej białek powierzchniowych gospodarza. Proces ten znacznie ułatwia przyleganie form inwazyjnych [4]. Izolaty Candida albicans, w których wykryto najwyższe aktywności enzymów lipolitycznych, najsilniej przylegają do komórek nabłonkowych gospodarza [2, 12]. Ponadto, uszkadzając barierę naskórka gospodarza, otwierają drogę do inwazji innych patogenów [13, 14]. Aktywność enzymów hydrolitycznych może zatem decydować o zachwianiu równowagi układu grzyb gospodarz w przebiegu odpowiedzi organizmu na zakażenie. Zaburzenie równowagi tego układu może się przyczyniać do rozwoju zakażenia i być jedną z przyczyn rozsiewu grzybów i uogólnionej kandydozy. Cel pracy Celem pracy było określenia związku pomiędzy opornością na azole a aktywnością enzymów hydrolitycznych szczepów Candida albicans. Materiał Materiałem badanym były 122 szczepy Candida albicans uzyskane z próbek klinicznych (plwocina, ropa, mocz, krew, aspirat z oskrzeli) pochodzących od chorych hospitalizowanych w Samodzielnym Publicznym Szpitalu w Nowym Targu im. Jana Pawła II w latach Metody Izolacja grzybów Izolację grzybów z rodzaju Candida przeprowadzono zgodnie z procedurą przyjętą w laboratorium szpitalnym. Pobrany od chorych materiał kliniczny posiewano na podłoże Sabourauda (Agar Sabourauda + 4% glukozy) oraz na podłoże różnicujące Candida ID2 firmy BioMerieux (Francja). Posiewy inkubowano przez okres 48 godzin w temperaturze 37 C. Identyfikacja szczepów Po zakończonej inkubacji hodowle oceniano pod względem zabarwienia kolonii na podłożu Candida ID2. Niebieskie zabarwienie wskazywało na obecność Candida albicans. Do potwierdzenia identyfikacji wykorzystywano testy ID 32C firmy BioMerieux (Francja). ID32C jest wystandaryzowanym zestawem do automatycznej identyfikacji grzybów drożdżopodobnych, który automatycznie wykorzystuje bazę 32 zminiaturyzowanych testów asymilacyjnych i bazę danych. Ocena wrażliwości na leki przeciwgrzybicze Badanie wrażliwości na leki przeciwgrzybicze wykonano metodą rozcieńczeniową za pomocą testów ATB fungus2 firmy BioMerieux. Pasek ATB FUNGUS 2 INT składa się z 16 par studzienek. Pierwsza para nie zawiera żadnego leku i służy jako pozytywna kontrola wzrostu. Kolejnych 15 par zawiera cztery leki przeciwgrzybicze w kilku stężeniach pozwalających określić MIC (z ang. Minimal Inhibitory Concentration). Z badanych szczepów drożdżaków sporządzano zawiesinę, przenoszono do podłoża wzrostowego i nanoszono do studzienek paska. Po 48 godzinnej inkubacji odczytywano wzrost. Interpretację testów przeprowadzono według zaleceń CLSI ( z ang. Clinical and Laboratory Standards Institute) (tab. I). Ocena aktywności enzymatycznej W stosunku do badanych szczepów określono aktywność 19 enzymów hydrolitycznych z wykorzystaniem testu API ZYM firmy BioMerieux (Francja). Oznaczenia przeprowadzono dla szczepów wrażliwych oraz dla szczepów wykazujących wysoką oporność na azole. Zestaw API ZYM Tab. I. Zalecane przez CLSI stężenia graniczne azoli w mg/l dla Candida spp. Lek przeciwgrzybiczy Szczep wrażliwy (n=61) Szczep oporny (n=61) Flukonazol 8 64 Itrakonazol 0,125 1 Worikonazol 1 4

3 Tab. II. Profil enzymów oraz substraty składające się na test API ZYM Numer probówki Substrat Kontrola Fosfataza zasadowa 2-naftylofosforan 3 Esteraza (C4) 2-naftylomadlan 4 Lipaza esterazowa (C-8) 2-naftylokapronian 5 Lipaza (C-14) 2-naftylomirystylan 6 Arylamidaza leucynowa L-leucylo-2-naftyloamid 7 Arylamidaza walinowa L-walinylo-2-naftyloamid 8 Arylamidaza cystynowa L-cystynylo-2-naftyloamid 9 Trypsyna N-benzylo-Dlarginino-2-naftyloamid 10 α-chymotrypsyna N-glutarylo-fenyloalanino-2-naftyloamid 11 Fosfataza kwaśna 2-naftylofosforan 12 Fosfohydrolaza naftoluas-bi Naftolu-AS-BI-fosforan 13 α-galaktozydaza 6-Br-2-naftylo-α-D-galaktopiranoza 14 β- galaktozydaza 2-naftylo-β- galaktopiranoza 15 β- glukoronidaza Naftolu-AS-BI-β-D-glikoronid 16 α-glukozydaza 2-naftylo-α-D-glukopiranoza 17 β- glukozydaza 6-Br-2-naftylo-β-glukopiranoza 18 N-acetylo-β-glikozaminidaza 1-naftylo-N-acetylo-β-D-glukozyloamid 19 α-mannozydaza 6-Br-2-naftylo-α-D-mannopiranoza 20 α-fukozydaza 2-naftylo-α-fukopiranoza firmy BioMerieux zawiera pasek z 20 mikroprobówkami, w których znajdują się właściwe dla odpowiednich reakcji enzymatycznych substraty oraz bufor. Sposób przeprowadzenia testu pozwala na ocenę reakcji enzymatycznej nawet jeśli substrat nie jest rozpuszczalny. Poza paskami, każdy zestaw zawiera komory inkubacyjne, karty wyników i odczynniki ZYMA (trójhydroksymetyloaminometan, kwas solny 37%, siarczan laurylowy, woda destylowana) i ZYMB (fast blue 2 B, metoksyetanol). Profil ocenianych enzymów przedstawiono w tabeli II. W celu wykonania oznaczenia sporządzono zawiesinę grzybów w jałowym 0,9% roztworze NaCl o gęstości 5 w skali McFarlanda. Paski testowe umieszczano w oznaczonych numerem szczepu komorach inkubacyjnych wypełnionych 5 ml 0,95% jałowego roztworu NaCl. Do mikroprobówek znajdujących się na paskach testowych dodawano pipetą po 200μl przygotowanej zawiesiny. Komory zamykano plastikowymi wieczkami i inkubowano przez 4 godziny w temperaturze 37 C. Po zakończonej inkubacji do każdej probówki dodano po jednej kropli odczynnika ZYMA i ZYMB. Odczyt przeprowadzono po 10 minutach posługując się załączoną przez producenta 5-stopniową skalą oceny zabarwienia, w której 0 oznaczało brak reakcji, a 5 największą intensywność zabarwienia. Aktywności enzymów przypisywano następnie wartości nanomolowe hydrolizowanego substratu zgodnie z następującymi kryteriami: 5-40 nmol, 4-30 nmol, 3-20 nmol, 2-10 nmol, 1-5 nmol. Wyniki Wartości MIC flukonazolu, itrakonazolu i worikonazolu dla szczepów Candida albicans W zależności od uzyskanych wartości MIC dla leków azolowych badane szczepy podzielono na dwie grupy. Pierwszą grupę (grupa S) stanowiło 61 szczepów Candida albicans wrażliwych na wszystkie leki azolowe (MIC dla flukonazolu wynosił <8g/ml, dla itrakonazolu <0,125g/ ml, dla worikonazolu <1g/ml). Drugą grupę stanowiły stanowiły 61 szczepy Candida albicans oporne na azole (grupa R), które charakteryzowały się wysoką opornością na flukonazol (wartość MIC64g/ml), itrakonazol (wartość MIC2g/ml), worikonazol (wartość MIC4g/ml). Wartości MIC odczytano przy użyciu aparatu miniapi firmy BioMerieux (Francja). Aktywność enzymatyczna szczepów Canidida albicans wrażliwych i opornych na azole Zbadano aktywność enzymatyczną 122 szczepów Canidida albicans charakteryzujących się wrażliwością lub wysoką opornością na azole. Wśród wszystkich szczepów Candida albicans wykazano całkowity brak aktywności następujących enzymów: lipazy (C-14), fosfatazy zasadowej, trypsyny, α-chymotrypsyny, α - galaktozydzy, β - galaktozydazy, β - glukoronidazy, kwaśnej fosfatazy, β-glukozydazy, α-mannozydazy, α-fukozydazy. Aktywność enzymatyczną wykryto w przypadku pozostałych ośmiu enzymów: esterazy C4, lipazy esterazowej, arylamidazy leucynowej, arylamidazy walinowej, arylamidazy cystynowej, fosfohydrolazy naftolowej, α-glukozydazy i N-acetylo-β-glukozoaminidazy. Testem mediany porównano grupę wrażliwych i opornych Candida albicans względem ich aktywności enzymatycznej i otrzymano następujące wyniki przedstawione w tabeli III. Z przeprowadzonej analizy statystycznej (test korelacji rang Spearmana) dla Candida albicans wrażliwych i opornych na azole wynika, że istnieją znamienne korelacje pomiędzy występowaniem oporności, a poziomem aktywności enzymów (tabela IV). Wzrostowi oporności na flukonazol

4 Tab. III. Wartości mediany enzymów dla Candida albicans wrażliwych i opornych na azole towarzyszy spadek aktywności esterazy, lipazy esterazowej, α-glukozydazy, fosfohydrolazy i N-acetylobetaglukozaminidazy i wzrost aktywności arylamidazy leucynowej i arylamidazy cystynowej. Dyskusja Candida albicans wrażliwe Candida albicans oporne n=61 n=61 Mediana Rozstęp Mediana Rozstęp Wiele danych z piśmiennictwa wskazuje, że szczepy Candida albicans charakteryzujące się wysoką aktywnością proteolityczną są równocześnie szczepami najbardziej patogennymi. Naglik i wsp. [5, 6] udowodnili, że szczepy Candida albicans wytwarzające duże ilości proteaz, są zdecydowanie bardziej patogenne w porównaniu do mutantów pozbawionych zdolności produkowania tych enzymów. Z innych badań wynika, iż uszkodzenie genów odpowiedzialnych za wytwarzanie enzymów proteolitycznych prowadziło do osłabienia patogenności grzybów [15]. Według Batura- Gabryel i Młynarczyk [16] istnieje znamienna korelacja między proteolityczną i lipolityczną aktywnością badanych szczepów. Również Krajewska Kułak i wsp. [17] wykazali statystycznie znamiennie wyższą aktywność enzymów proteolitycznych wśród szczepów Candida izolowanych od pacjentek z przewlekłą nawrotową kandydozą pochwy w porównaniu z aktywnością enzymatyczną szczepów izolowanych od kobiet bez objawów klinicznych. Podobną zależność obserwowano w przypadku innych ontocenoz [18,19]. Ashraf i wsp. badając szczepy Candida izolowane z krwi wykazali, że charakteryzowała je istotnie wyższa aktywność enzymów proteolitycznych w porównaniu do szczepów izolowanych od pacjentów bez objawów klinicznych [20]. Zależność pomiędzy aktywnością enzymów hydrolitycznych a opornością na leki azolowe zaobserwowała również Tyczkowska Sieroń i wsp. [21]. Udowodnili oni, iż wzrost aktywności enzymów lipolitycznych jest ściśle powiązany ze zmniejszeniem oporności szczepów Candida albicans. Także Fekete Forgàs i wsp. [22] wykazali, że szczepy Candida albicans, w których indukowano oporność na flukonazol, wykazywały większą zdolność do wytwarzania proteaz i inwazyjność populacji. Badając zatem wrażliwość izolowanych od pacjentów grzybów oraz rodzaj i aktywność wydzielanych przez nie enzymów można określić patogenność oraz stopień zaawansowania infekcji grzybiczej. Wnioski Test Mediany Esteraza (C4) ,00 0,041 Lipaza esterazowa (C-8) ,00 0,043 Arylamidaza leucynowa ,00 0,046 Arylamidaza walinowa ,00 0,257 Arylamidaza cystynowa ,00 0,049 Fosfohydrolaza naftolu ,00 0,043 α-glukozydaza ,00 0,027 N-acetylo-βglukozaminidaza ,00 0,325 Tab. IV. Współczynniki korelacji rang - Spearmana pomiędzy aktywnością enzymów a wartościami MIC dla flukonazolu szczepów Candida albicans Wartość współczynnika korelacji (r) 1. Szczepy Candida albicans oporne na azole różnią się od szczepów wrażliwych aktywnością enzymów hydrolitycznych. 2. Wzrostowi oporności na flukonazol towarzyszy wzrost aktywności arylamidazy leucynowej i arylamidazy cystynowej, co może mieć wpływ na wzrost inwazyjności badanych szczepów. p Poziom istotności statystycznej (p) Esteraza (C4) -0,57 0,00 Lipaza esterazowa (C-8) -0,45 0,00 Arylamidaza leucynowa 0,54 0,00 Arylamidaza walinowa 0,19 0,03 Arylamidaza cystynowa 0,51 0,00 Fosfohydrolaza naftolu AS-BI -0,28 0,00 α-glukozydaza -0,62 0,00 N-acetylo-β-glukozaminidaza -0,47 0,00 Wyróżniono istotne współczynniki korelacji przy p<0,05.

5 3. Korelacje pomiędzy opornością na azole a aktywnością enzymatyczną mogą sugerować udział leków azolowych w tworzeniu enzymatycznego fenotypu oporności. Piśmiennictwo: 1. Batura-Gabryel H, Młynarczyk W. Aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida i występowanie grzybicy jamy ustnej u chorych na raka płuca i przewlekłą obturacyjną chorobę płuc. Mikol Lek. 2000; 7(2): Batura-Gabryel H, Młynarczyk W. Aktywność proteolityczna i lipolityczna grzybów z rodzaju Candida wyizolowanych od chorych na przewlekłe choroby układu oddechowego. Mikol Lek. 2000; 7(3): Lane T, Garcia JR. Phospholipase production in morphological variants of Candida albicans. Mycoses 1991; 34: Monod M, Capoccia S, Lechenne B, Zaugg Ch. Secreted proteases from pathogenic fungi. Infect J Med Microbiol. 2002; 292: Naglik JR, Tsichlaki E, Challacombe SJ. Candida secreted aspartyl proteinases expression and function during infection. Mikol Lek. 2004; 11(2): Naglik JR, Challacombe SJ, Hube B. Candida albicans secreted aspartyl proteinases in virulence and patogenesis. Microbiol Molecul Biol Rev. 2003; Ghannoum MA. Potencial role of phospholipases in virulence and fungal pathogenesis. Clin Microbiol Rev. 2000; 13: Swenson CE, Perkins WR, Roberts P. In vitro and in vivo antifungal activity of complex: are phospholipases important? Antimicrob Agents Chemother. 1998; 42: Bernatowska E, Dzierżanowska D, Kurnatowska A. Zakażenia grzybicze. Alfamedica 2006; Batura-Gabryel H. Aktualne poglądy na oddziaływanie zakażenia grzybami z rodzaju Candida na organizm człowieka. Nowiny Lekarskie 1995; 64: Gow NA. Germ tube growth of Candida albicans. Curr Top Med Mycol.1997;8: Leidich SD, Ibrahim AS, Fu Y, Koul A. Cloning and disruption of caplb1, a phospholipase B gene involved in the pathogenicity of Candida albicans. J Biol Chem. 1998; 273: Verstrepen KJ, Klis FM. Flocculation, adhesion and biofilm formation in yeasts. Mol Microbiol 2006; 60: Kurnatowski P. Kilka danych o układzie żywiciel grzyb.[w:] Wybrane zagadnienia mikologii medycznej. red.a. Kurnatowska. Promedi. Łódź. 1995; Odds FC, Gow NAR, Brown AJP. Fungal virulence studies came on age. Genome Biology. 2001;2(3) :rev Batura-Gabryel H, Brajer B, Kuźnar B, Młynarczyk W. Czy aktywność hydrolityczna grzybów z rodzaju Candida wyizolowanych od chorych na przewlekłą obturacyjną chorobę płuc(pochp) może zmieniać się z postępem choroby podstawowej? Postępy Dermatologii i Alergologii XX. 2003; 3: Krajewska-Kułak E, Niczyporuk W, Karczewski J. Ocena aktywności hydrolitycznej szczepów grzybów drożdżopodobnych izolowanych z ontocenozy pochwy. Mikol Lek. 1998;5(1): Krajewska-Kułak E, Łukaszuk C, Niczyporuk W, Bartoszewicz M, Roszkowska I, Sczurzewski M, Trybuła J. Biotypy enzymatyczne szczepów grzybów drożdżopodobnych izolowanych z różnych ontocenoz. Mikol Lek. 2001;8(1): Dąbkowska M, Swoboda-Kopeć E, Kawecki D, Obuch-Woszczatyński P, Stelmach E, Łuczak M. Badanie aktywności enzymatycznej szczepów Candida izolowanych z materiałów klinicznych chorych z układową kandydozą. Mikol Lek. 2005;12(2): Ashraf I, Mirbod F, Filer S, Banno Y, Cole G Kitajima Y, Edwards J. Evidence implicating phospholipase as a virulence factors of Candida albicans. Infect and Immun. 1995;63(5): Tyczkowska-Sieroń E, Kurnatowski P. Analiza zależności pomiędzy aktywnością enzymatyczną a opornością na flukonazol szczepów grzybów z rodzaju Candida. Mikol Lek. 2006;13(2): Fekete-Forgas K, Gyure L, Lenkey B. Changes of virulence factors accompanying the phenomenon of induced fluconazole resistance in Candida albicans. Mycoses. 2000;43: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. Adres do korespondencji: dr n. med. Anna Ślemp-Migiel Zakład Mikrobiologii Podhalańskiego Szpitala Specjalistycznego im. Jana Pawła II ul. Szpitalna 14, Nowy Targ tel./faks: (62, 65) anna.smigiel@o2.pl