Aktywność enzymatyczna szczepów Scopulariopsis brevicaulis hodowanych na podłożach Sabourauda i Czapek-Doxa

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE / ORIGINAL ARTICLES Mikologia Lekarska 2009, 16 (4): Copyright 2009 Cornetis ISSN X Aktywność enzymatyczna szczepów Scopulariopsis brevicaulis hodowanych na podłożach Sabourauda i Czapek-Doxa Enzymatic activity of Scopulariopsis brevicaulis strains cultured on Sabouraud and Czapek-Dox media Jadwiga Witalis, Magdalena Skóra, Paweł Krzyściak, Anna B. Macura Zakład Mykologii, Katedra Mikrobiologii Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego w Krakowie ADRES DO KORESPONDENCJI: Prof. dr hab. n. med. Anna B. Macura Zakład Mykologii Katedry Mikrobiologii CM UJ ul. Czysta 18, Kraków, tel.: wew. 247, mbmacura@cyf-kr.edu.pl STRESZCZENIE Wprowadzenie: Na wynik badań in vitro aktywności enzymatycznej patogennych grzybów mogą mieć wpływ różne czynniki, np. rodzaj użytego do ich hodowli podłoża. Cel pracy: Celem analizy było porównanie profili enzymatycznych szczepów Scopulariopsis brevicaulis, hodowanych na podłożu Sabourauda (SGA) i podłożu Czapek- -Doxa (CDA). Materiał i metody: Do badań wykorzystano 24 szczepy S. brevicaulis: 4 wzorcowe i 20 wyizolowanych z materiałów klinicznych (z paznokci i skóry). Profil enzymatyczny szczepów określano in vitro przy użyciu testu API ZYM (biomérieux). Wyniki: Badając spektrum enzymatyczne 24 szczepów S. brevicaulis, stwierdzono aktywność ogółem 11 enzymów (tych samych w hodowlach na obu podłożach). Poziom aktywności enzymatycznej, ujęty jako suma aktywności wszystkich enzymów, okazał się wyższy w przypadku hodowli na SGA niż na CDA. Poszczególne szczepy S. brevicaulis różniły się pod względem liczby aktywnych enzymów w zakresie od 7 do 11 (hodowle na SGA) i od 6 do 11 (hodowle na CDA). Stwierdzono statystycznie istotne różnice, zależnie od użytego do hodowli podłoża, w intensywności zewnątrzkomórkowego wydzielania 8 enzymów: fosfatazy zasadowej, esterazy (C4), lipazy esterazowej (C8), arylamidazy walinowej, fosfatazy kwaśnej, fosfohydrolazy naftolowej AS-BI, N-acetylo-β-glukozaminidazy i α-mannozydazy. Wnioski: 1. Oba podłoża są przydatne do hodowli grzybów w celu określania in vitro ich profilu enzymatycznego. 2. Zróżnicowanie fenotypowe szczepów S. brevicaulis zależnie od rodzaju podłoża hodowlanego, zaobserwowane na podstawie enzymogramów (zwłaszcza pod względem nasilenia aktywności enzymatycznej), wskazuje na zdolność adaptacji tego gatunku do warunków pokarmowych w jego środowisku wzrostu. SŁOWA KLUCZOWE: Scopulariopsis, aktywność enzymatyczna ABSTRACT Introduction: The result of in vitro evaluation of pathogenic fungi enzymatic activity may be influenced by numerous factors, including the brand od culture medium. Objective: The objective of the study was a c omparison of enz ymatic profiles in Scopulariopsis brevicaulis strains cultured on Sabouraud cultur e medium (SGA) vs. on Czapek-Dox medium (CDA). Material and methods: A t otal of 24 S. brevicaulis strains: four standard strains and t wenty isolated from clinical materials (nails and sk in). The enzymatic profile was evaluated using an API ZYM test (biomérieux). Results: The analysis of 24 S. brevicaulis strains revealed activity of eleven enzymes (the same on both of the media). The enzymatic activity level expressed in terms of the overall activity of all the enzymes was higher in the strains cultured on SGA than on CDA. The particular S. brevicaulis strains differed in the number of active enzymes: 7-11 on SGA, and 6-11 on CD A. Statistically significant differences in the intensity of the extracellular secretion, depending on the medium used, were found in the following eight enz ymes: alk aline phosphatase, esterase (C4), esterase lipase ( C8), valine ar ylamidase, acid phosphatase, naphtol-as-bi-phosphohydrolase, N-acetyl-βglucosaminidase, and α-mannosidase. Conclusions: 1. Both of the culture media may be used to in vitro evaluation of fungal enzymatic profile. 2. The phenotypic variability of S. brevicalis strains, dependent on the culture medium brand, as observed on the basis of the enzymograms (especially related to the extent of enzymatic activity) indicates that the this species is able to adapt to nutrition patterns in its growth environment. KEY WORDS: Scopulariopsis, enzymatic activity Wprowadzenie Typowym siedliskiem grzybów pleśniowych z rodzaju Scopulariopsis jest gleba, gdzie jako sapr otrofy ucz estniczą w pr ocesie mineralizacji szczątków organicznych. Gatunek Scopulariopsis brevicaulis znany jest też jako czynnik etiologiczny grzybic powierzchniowych, w tym głównie grzybicy paznokci (tzw. akauliozy), rzadziej skóry; sporady cznie w ywołuje r ównież g rzybice nar ządowe (1). Aktualny stan wiedzy na temat ekologii i patogenności Scopulariopsis przedstawiono w opublikowanym wcześniej na łamach Mikologii Lekarskiej artykule przeglądowym (2). Chorobotwórczość g rzybów jest det erminowana m.in. pr zez wydzielanie z ewnątrzkomórkowych enz ymów. N iektóre gatunk i mają z dolność do enz ymatycznego r ozkładu kerat yny i inn ych składników ludzkiej skóry i jej przydatków, a przez to do degradacji naturalnej bariery chroniącej przed inwazją mikroorganizmów (3-7). W pr owadzonych badaniach nad pat omechanizmem g rzybic powierzchniowych, wywoływanych przez grzyby z rodzaju Scopulariopsis, skoncentrowano się więc na aspekcie ich aktywności enzymatycznej. Poniżej przedstawiono wyniki badania przesiewowego wykonanego pr zy uż yciu t estu API ZY M pr ofilu enz ymatycznego szczepów S. brevicaulis, hodowanych na dw óch standar dowych podłożach. Cel pracy Celem badań b yło por ównanie pr ofili enz ymatycznych sz czepów S. brevicaulis, hodowanych na podłożach Sabourauda i Czapek- -Doxa. Materiał i metody Hodowla Do badań wykorzystano 24 szczepy S. brevicaulis, w tym: 4 wzorcowe, pochodzące z bazy Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holandia ( CBS , CBS , CBS , CBS 215

2 216 Witalis J., Skóra M., Krzyściak P., Macura A.B. Enzymatic activity of Scopulariopsis brevicaulis strains ) oraz 20 wyizolowanych z materiałów klinicznych (z paznokci i skór y), zident yfikowanych na podsta wie c ech f enotypowych jako S. brevicaulis. Hodowlę grzybów prowadzono na dwóch rodzajach podłoży: 1. SGA podło że Sabourauda z chloramf enikolem (Sabouraud Dextrose With Chloramphenicol Lab-Agar, BIOCORP) o ph 5,6±0,2. Skład: mieszanina pept onów (10 g), gluko za (40 g), agar (15 g), chloramfenikol (0,5 g), jałowa woda destylowana (1000 ml), 2. CDA podłoże Czapek-Doxa (Czapek-Dox Liquid Medium, Modified, OXOID) o ph 6,8±0,2 z dodatkiem 15 g agaru bakteriologicznego (Bac teriological Lab -Agar, BIOC ORP). Sk ład: az otan sodu (2 g), chlorek potasu (0,5 g), glicerofosforan magnezu (0,5 g), siarczan żelazawy (0,01 g), siarczan potasu (0,35 g), sacharoza (30 g), jałowa woda destylowana (1000 ml). Aktywność enzymatyczna Profil enzymatyczny szczepów S. brevicaulis oznaczono za pomocą testu API ZY M (biomérieux), który umożliwia wykrycie 19 enz ymów: fosfatazy zasadowej, esterazy (C4), lipazy esterazowej (C8), lipazy (C14), arylamidazy leucynowej, arylamidazy walinowej, arylamidazy cystynowej, trypsyny, α-chymotrypsyny, fosfatazy kwaśnej, fosfohydrolazy naftolowej AS-BI, α- galaktozydazy, β- galaktozydazy, β- glukuronidazy, α-glukozydazy, β- glikozydazy, N-ac etylo-β-glukozaminidazy, α-mannozydazy i α-fukozydazy. Z 14-dniowych hodowli grzybów na podłożach SGA i CDA przygotowano zawiesiny w jałowej wodzie destylowanej (gęstość: 5-6 w skali McFarlanda). Nast ępnie pr zeniesiono po 65 µl za wiesiny g rzybów poszczególnych szczepów do studzienek na pask ach API ZY M, które potem umieszczono w komorze wilgotnej i inkubowano w temp. 37 C przez 4 godz. Po inkubacji dodano do studzienek po 1 k ropli odczynników ZYM A (Tris-hydroksymetylo-aminometan, 37% kwas solny, laurynowy siarczan sodu, woda) oraz ZYM B (Fast blue BB aktywny składnik, metanol, dimetylosulfotlenek). Wyniki aktywności enzymatycznej oceniono według tabeli załączonej do testów przez producenta, w skali punktowej od 0 do 5 w zależności od intensywności reakcji barwnej. Analiza statystyczna wyników Dane oprac owano w pr ogramie do oblicz eń stat ystycznych R w wersji (2009 r.) (8). Do porównania zmiennych zastosowano nieparametryczny test sumy rang dla prób powiązanych (test Wilcoxona). Dopuszczalną wartość błędu I-r odzaju α pr zyjęto na po ziomie p=0,05. Wyniki Mikologia Lekarska 2009, 16 (4) W badanej grupie szczepów S. brevicaulis stwierdzono aktywność 11 enzymów (tych samych w hodowlach na obu podłożach), tj. fosfatazy zasadowej, esterazy (C4), lipazy esterazowej (C8), arylamidazy leucynowej, arylamidazy walinowej, arylamidazy cystynowej, fosfatazy k waśnej, f osfohydrolazy naf tolowej AS-BI, β- glukozydazy, N-acetylo-β-glukozaminidazy i α-mannozydazy (ryc. 1). U poszczególnych szczepów liczba aktywnych enzymów wahała się w zak resie od 7 do 11 w w ypadku hodo wli na podło żu SGA i w zak resie od 6 do 11 na podło żu CDA (tab. I). M imo tych różnic w enzymogramach, wszystkie badane szczepy z hodowli na podłożu SGA w ykazały akt ywność: f osfatazy zasado wej, est erazy ( C4), fosfatazy kwaśnej i N-acetylo-β-glukozaminidazy, z kolei wszystkie szczepy hodowane na podłożu CDA: esterazy (C4), lipazy esterazowej (C8), arylamidazy leucynowej, fosfohydrolazy naftolowej AS-BI, β-glikozydazy i N-acetylo-β-glukozaminidazy. Poziom aktywności enzymatycznej, ujęty jako suma aktywności wszystkich wydzielanych enzymów, okazał się wyższy w przypadku hodowli na podłożu SGA (mediana: 21) niż na podłożu CDA (mediana: 15). Wartości sum akt ywności wszystkich enz ymów, wydzielanych przez poszczególne szczepy, wahały się w zakresie od 12 do 30 (podłoże SGA) i w zakresie od 8 do 25 (podłoże CDA) (tab. I). Analizując w yniki oc eny akt ywności enz ymatycznej sz czepów hodowanych na podło żu SGA i podło żu CDA, stwierdzono istotne statystycznie różnice w przypadku 8 enzymów, a mianowicie: fosfatazy zasadowej (p=0,002), esterazy (C4) (p=0,003), lipazy esterazowej (C8) (p=0,049), arylamidazy walinowej (p=0,002), fosfatazy kwaśnej ( p=0,008), f osfohydrolazy naf tolowej AS-BI ( p=0,0009), N-acetylo-β-glukozaminidazy (p=0,005) i α-mannozydazy (p=0,03). Na rycinie 1 zilustr owano graficznie rozkłady wartości aktywności tych 8 enzymów. Największe różnice zaznaczyły się w natężeniach reakcji fosfatazy zasadowej oraz fosfatazy kwaśnej. Szeregując enzymy wg malejącego natężenia reakcji, ocenianego w teście API ZYM w skali od 0 do 5, w przypadku hodowli na podłożu SGA otrzymano następującą kolejność wartości średnich arytmetycznych: fosfataza zasadowa (2,9), lipaza esterazowa (C8) (2,8), N-acetyloβ-glukozaminidaza (2,7), f osfataza kwaśna (2,3), ar ylamidaza leuc y- nowa (2,0), β- glukozydaza (1,8), est eraza (C4) (1,7), a-manno zydaza (1,6), ar ylamidaza walino wa (1,4), f osfohydrolaza naf tolowa AS-BI (1,2), arylamidaza cystynowa (0,1). Natomiast w przypadku hodowli na podłożu CDA: arylamidaza walinowa (2,4), esteraza (C4) (2,2), arylamidaza leucynowa i N-acetylo-β-glukozaminidaza (2,0), fosfohydrolaza naftolowa AS-BI (1,8), β-glukozydaza (1,6), lipaza esterazowa (C8) (1,5), f osfataza k waśna (0,8), f osfataza zasado wa i a-manno zydaza (0,4), arylamidaza cystynowa (0,3). Omówienie W g rupie 24 sz czepów S. br evicaulis, zar ówno w pr zypadku hodowli prowadzonych na podłożu SGA, jak i hodo wli na podłożu CDA, test API ZY M umożliwił wykrycie tych samych 11 z 19 enz y- mów. Z daniem aut orów pr zedstawianej prac y oba t e podło ża w równym stopniu są przydatne do hodowli grzybów w celu określania in vitro ich profilu enzymatycznego. Brak jest inn ych opublikowanych danych na t emat aktywności enzymów wykrywanych testami API ZYM u szczepów S. brevicaulis, hodowanych na podłożu CDA. Można natomiast porównać rezultat naszego badania z opubliko wanymi w ynikami t estów API ZY M, określającymi spektrum enz ymatyczne sz czepów S. br evicaulis hodowanych na podło żu SGA (9, 10). W badaniu H ryncewicz- Gwóźdź i wsp. (9), wykonanym na 16 szczepach S. brevicaulis, wykryto aktywność tych samych 11 enzymów, a dodatkowo jeszcze trypsyny i β-galaktozydazy (oba te ostatnie enzymy na niskim poziomie natężenia r eakcji, odpo wiednio: 0,06 i 0,3). W prac y Białasiewicz i wsp. (10), gdzie wz orcowy szczep S. brevicaulis był jednym z 22 badanych gatunkó w g rzybów, po za 11 enz ymami w spólnymi z r ezultatami nasz ych t estów w ymienia się jesz cze lipaz ę, α-chymotrypsynę i α-glukozydazę (tu również wszystkie trzy enzymy otr zymały najniższą oc enę 1 w 5-st opniowej sk ali nat ężenia reakcji barwnej). Stwierdzić więc można, że otrzymane przez nas wyniki odnośnie do spektrum t ych enz ymów h ydrolitycznych, które wykazują największą aktywność u S. brevicaulis, są generalnie zgodne z rezultatami wyżej cytowanych prac. Saprotroficzny S. br evicaulis, który r ozkłada r óżne sz czątki or ganiczne, ma z dolność do pr zechodzenia w paso żytniczy tr yb ż ycia, stając się pat ogenem. Oznacza t o, ż e w jak imś zak resie musi mieć zdolność przystosowawczą do zmiany warunków w swoim środowisku wzrostu. Wskazują na to także uzyskane przez nas wyniki testów API ZYM. Różnice w ph i składzie podłoża SGA i CDA nie spowodowały, co prawda, powstania różnic w ogólnym profilu enzymatycznym S. brevicaulis (w obu przypadkach spektrum objęło te same 11 enzymów), jednak analizując enz ymogramy posz czególnych sz czepów, stwierdzono, ż e niezależnie od inn ych r óżnic, f osfataza zasado wa i fosfataza kwaśna były wydzielane przez wszystkie szczepy hodowa-

3 Aktywność enzymatyczna szczepów Scopulariopsis brevicaulis ne na podło żu SGA, nat omiast lipaza est erazowa (C8), ar ylamidaza leucynowa, fosfohydrolaza naftolowa AS-BI i β glikozydaza pr zez wszystkie szczepy hodowane na podłożu CDA. To fenotypowe zróżnicowanie, związane z rodzajem podłoża hodowlanego, jak również wykazane istotne statystycznie różnice w intensywności wydzielania 8 spośród 11 enzymów, wskazują na zdolność szczepów S. brevicaulis do adaptacji pod względem korzystania ze źródeł pokarmu w ich środowisku wzrostu. W badaniu inn ych autorów, w kt órym testem API ZYM określono spektrum enz ymatyczne 30 sz czepów S. brevicaulis, hodowanych na płynn ym podłożu keratynowym (11). St wierdzono wydzielanie tr zech enz ymów, nieobecn ych w w ypadku nasz ych hodowli na podło żach SGA i CD A, a miano wicie α- galaktozydazy, β-galaktozydazy i α-glukozydazy, natomiast w porównaniu z profilem enzymatycznym naszych hodowli brak było aktywności lipazy esterazowej (C8) oraz trzech arylamidaz: leucynowej, walinowej i c ystynowej. Wnioski Badanie 24 sz czepów S. brevicaulis za pomocą t estu API ZY M dało pod względem spektrum enz ymów w oc enie łącznej t e same wyniki (11 enzymów), niezależnie od użytego do hodowli podłoża. Ś wiadczy t o, ż e podło ża Sabourauda i Czapek -Doxa w r ównym st opniu są pr zydatne do hodo wli g rzybów w c elu określania in vitro ich profilu enzymatycznego. Zróżnicowanie fenotypowe szczepów S. brevicaulis zależnie od rodzaju podło ża hodo wlanego, zaobser wowane na podsta wie enzymogramów (zwłaszcza pod względem nasilenia aktywności enzymatycznej), wskazuje na z dolność adaptacji t ego gatunku do warunków pokarmowych w jego środowisku wzrostu. Tabela I: Table: I: Badane szczepy Tested strains Ocena testem API ZYM aktywności enzymatycznej szczepów Scopulariopsis brevicaulis, hodowanych na podłożach Sabourauda (SGA) i Czapek-Doxa (CDA) API ZYM estimation of the enzymatic activity of Scopulariopsis brevicaulis strains, cultured on Sabouraud (SGA) and Czapek-Dox (CDA) media Sumaryczna aktywność wszystkich enzymów Overall enzymatic activity Liczba aktywnych enzymów Number of active enzymes SGA CDA SGA CDA Średnia arytmetyczna Arithmetical mean 20,5 15,3 9,5 8,6 Mediana Median Minimalna wartość Minimal value Maksymalna wartość Maximal value Szczepy 1-4: szczepy wzorcowe (1 CBS , 2 CBS , 3 CBS , 4 CBS ) / Strains 1-4: standard strains (1 CBS , 2 CBS , 3 CBS , 4 CBS ) Szczepy 5-20: szczepy kliniczne, wyizolowane z paznokci i skóry / Strains 5-20: clinical strains, isolated from nails and skin 217

4 Enzymatic activity of Scopulariopsis brevicaulis strains Mikologia Lekarska 2009, 16 (4) Lipaza esterazowa (C8) 218 Ryc. 1. Graficzna ilustracja rozkładu war tości akt ywności enz ymatycznej S. brevicaulis, oc enianej testem API ZY M. Cz erwonym kolor em o znaczono enz ymy w ydzielane pr zez sz czepy, hodowane na stałym podłożu Sabourauda (SGA), niebiesk im na stałym podłożu Czapek- -Doxa (CDA) Fig. 1. Visualisation of the of S. brevicaulis enz ymatic activity values distribution, as evaluated using an API ZY M t est. Red colour: enzymes secreted b y strains cultur ed on solid Sabouraud medium (SGA ); blue color: on solid Czapek - -Dox medium (CDA)

5 Aktywność enzymatyczna szczepów Scopulariopsis brevicaulis Piśmiennictwo 1. De Hoog G.S., Guarro J., Figueras G., Figueras M.J.: Atlas of Clinical Fungi. Wyd. 2, Centraalbureau voor Schimmelcultures, Universitat Rovira i Virgili, Reus, Hiszpania, 2000, Bochenek M., Witalis J., Macura A.B.: Występowanie i chorobotwórczość grzybów z rodzaju Scopulariopsis. Mikol. Lek., 2008, 15, Macura A.B.: Patomechanizm infekcji grzybiczych. [w:] Mikologia co nowego? red. E. Baran, Cornetis, Wrocław, 2008, Anbu P., Gopinath S.C., Hilda A., Mathivanan N., Annadurai G.: Secretion of keratinolytic enzymes and keratinolysis by Scopulariopsis brevicaulis and Trichophyton mentagrophytes: regression analysis. Can. J. Microbiol., 2006, 52, Kobierzycka M., Cisło M.: Rola enzymów w patogenezie infekcji grzybiczych. Mikol. Lek., 12, Filipello Marchisio V., Fusconi A.: Morphological evidence for keratinolytic activity of Scopulariopsis spp. isolates from nail lesions and the air. Med. Mycol., 2001, 39, Maleszka R.: Enzymatic activity of dermatophytes in various forms of onychomycosis. Mikol. Lek., 1999, 6, R Development Core Team (2009). R: A language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical C omputing, Vienna, Austria. ISBN , URL http: // 9. Hryncewicz-Gwóźdź A., Plomer-N iezgoda E., Baran E., Walów B., Czarnecka A.: Wrażliwość na leki przeciwgrzybicze i aktywność enzymatyczna szczepów Scopulariopsis brevicaulis określone in vitro. Mikol. Lek., 2008, 15, Białasiewicz D., Głowacka A., Kurnatowska A.: Aktywność wybranych enzymów hydrolitycznych u grzybów. Mikol. Lek., 1995, 2, Kacalak-Rzepka A., Maleszka R., Turek-Urasińska K., Kempińska A., Ratajczak-Stefańska V., Różewicka M.: Investigation concerning agents influencing the development of onychomycosis caused by Scopulariopsis brevicaulis. Mikol. Lek., 2004, 11, Praca wpłynęła do Redakcji: Zaakceptowano do druku: