6WDGLXPUR]ZRMRZH VDPLFH VDPFH QLPI\. Q /DWD . Q . Q 5D]HP

Transkrypt

1 PRZEGL Nr 3 EPIDEMIOL 2006; Krêtki 60: Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy 589 Joanna Katarzyna Strzelczyk, Andrzej Wiczkowski, Gra yna Spausta, Jolanta Ciarkowska, Marzena Zalewska-Ziob, Gra yna Izdebska-Straszak, Janusz Strzelczyk *, Janusz Kasperczyk ** OBECNOŒÆ KRÊTKÓW BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO U KLESZCZY IXODES RICINUS NA TERENACH REKREACYJNYCH OKOLIC TARNOWSKICH GÓR I ZABRZA W LATACH Katedra i Zak³ad Ogólnej Biologii Lekarskiej ŒAM w Zabrzu Kierownik: Andrzej Wiczkowski * Katedra Patofizjologii i Endokrynologii, Klinika Endokrynologii ŒAM w Zabrzu Kierownik: Beata Kos-Kud³a ** Katedra Medycyny i Epidemiologii Œrodowiskowej ŒAM w Zabrzu Kierownik: Jadwiga Joœko Metod¹ ³añcuchowej reakcji polimerazy (PCR) dokonano oceny zainfekowania krêtkami Borrelia burgdorferi sensu lato w populacji 233 kleszczy Ixodes ricinus od³owionych z terenów rekreacyjnych województwa œl¹skiego (okolice Tarnowskich Gór i Zabrza) w latach Obecnoœæ B burgdorferi sl wykryto w 33 (14,2%) kleszczach S³owa kluczowe: Borrelia burgdorferi sensu lato, borelioza, Ixodes ricinus, PCR Key words: Borrelia burgdorferi sensu lato, borreliosis, Ixodes ricinus, PCR WSTÊP Czynnikiem etiologicznym boreliozy z Lyme s¹ krêtki Borrelia burgdorferi mikroaerofilne Gram-ujemne bakterie z rodziny Spirochetaceae (1) Rezerwuarem tych bakterii s¹ ró ne gatunki ssaków i ptaków Przenoszone s¹ przez kleszcze z rodzaju Ixodes Na terenie Polski g³ównym wektorem jest kleszcz pospolity Ixodes ricinus (L) (2) Cz³owiek ulega zaka eniu przez uk³ucie zaka onego kleszcza, je eli kleszcz przyczepiony jest do skóry przez okres godzin (3) Stwierdzenie obecnoœci bakterii w organizmie cz³owieka zaka onego jest mo liwe dziêki zastosowaniu badania PCR (z ang Polymerase Chain Reaction reakcja ³añcuchowa polimerazy) Technika ta znalaz³a tak e zastosowanie do wykrycia B burgdorferi sensu lato w kleszczach (4) Do charakterystyki B burgdorferi oprócz w/w metody stosowane s¹ równie inne techniki z zakresu biologii molekularnej, takie jak, RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism polimorfizm d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych) (5), reakcja RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA losowa amplifikacja polimorficznych fragmentów DNA) (6), PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) elektroforeza w zmien-

2 JK Strzelczyk, A Wiczkowski i inni 590 Nr 3 nym polu elektrycznym (7), sekwencjonowanie DNA (8), jak równie analiza profili plazmidowych (9) oraz hybrydyzacja (10) Metody te znajduj¹ coraz szersze zastosowanie w diagnostyce i genotypowaniu szczepów B burgdorferi ze wzglêdu na ich wysok¹ czu- ³oœæ, swoistoœæ oraz krótki czas wykonania Maj¹ one przewagê nad badaniami serologicznymi, których standaryzacja jest trudna, poniewa stosowane testy mog¹ byæ przygotowywane w oparciu o ró ne genogatunki B burgdorferi W Polsce w ostatnich latach wzros³o zainteresowanie chorobami przenoszonymi przez kleszcze Wykrycie obecnoœci krêtków B burgdorferi w kleszczach od³owionych z okreœlonego terenu jest o tyle wa ne, e na tej podstawie mo na uznaæ ten obszar za region endemiczny Ponadto istotne jest równie okreœlenie odsetka zaka onych kleszczy jednego z parametrów indeksu ekologicznego Umo liwia to oszacowanie ryzyka zaka enia na danym terenie (11) W Polsce odsetek zaka onych kleszczy wynosi od 0,77% do 58% (12, 13) Jednak na wielu rekreacyjno-turystycznych terenach brakuje oceny stopnia ryzyka zaka enia przez B burgdorferi sl Dlatego te w niniejszej pracy dokonano oceny zaka enia B burgdorferi sl w populacjach kleszczy Ixodes ricinus pochodz¹cych z ró nych terenów rekreacyjnych wybranych regionów województwa œl¹skiego w latach MATERIA I METODY Zbadano ³¹cznie 233 kleszcze, które zebrano metod¹ flagowania w okresie wiosennoletnim w latach Za teren badañ obrano osiem fragmentów obszarów leœnych (las liœciasty i mieszany) województwa œl¹skiego o powierzchni ok 1000 m 2 nale ¹cych do powiatu tarnogórskiego (Krupski M³yn, Zielona, Lubliniec, Tarnowskie Góry, Œwierklaniec, Tworóg, Zbros³awice) i kompleksu leœnego Gliwice W roku 2001 przebadano 85 kleszczy (14), w , a w roku kleszcze (tab I) Do izolacji bakteryjnego DNA z kleszczy zebranych w latach u yto zestawu Genomic DNA Prep Plus (A&A Biotechnology, Gdynia, Polska) Proces izolacji przeprowadzono zgodnie z za³¹czonym protoko³em Do detekcji krêtków B burgdorferi sl zastosowano metodê PCR Amplifikowano fragment genu fla, koduj¹cego bia³ko rzêskowe flagellinê Startery zastosowane do reakcji, BFL1: 5 - GCT CAA TAT AAC CAA ATG CAC ATG -3 oraz BFL2: 5 -CAA GTC TAT TTT GGA AAG CAC CTA A- 3, Pracownia Syntezy Oligonukleotydów Instytutu Biochemii i Biofizyki PAN w Warszawie (15), by³y komplementarne do wszystkich znanych sekwencji genu fla B burgdorferi sl W sk³ad mieszaniny reakcyjnej przygotowywanej w objêtoœci 25 ml wchodzi³y: 12,5 ml PCR Master Mix, 2-krotnie stê ony (Promega, USA); 2,5 ml ka dego ze starterów o stê eniu 10 mm; 5 ml DNA; 2,5 ml sterylnej, dejonizowanej wody (Eppendorf, Niemcy) Reakcja PCR odbywa³a siê w termocyklerze typu Mastercycler Personal (Eppendorf, Niemcy) i sk³ada³a siê z nastêpuj¹cych etapów: denaturacja wstêpna w 94 C przez 2 min, nastêpnie 40 cykli obejmuj¹cych denaturacjê w 94 C przez 30 sekund, przy³¹czanie starterów w 60 C przez 60 sekund, wyd³u anie w 72 C przez 60 sekund; Koñcowe wyd³u anie w 72 C przez 60 sekund Jako kontrolê dodatni¹ zastosowano wzorcowy DNA B burgdorferi sl (DNA Gdañsk, Polska), z kolei kontrol¹ negatywn¹ by³a mieszanina reakcyjna, do której zamiast DNA dodawano steryln¹, dejonizowan¹ wodê (Eppendorf, Niemcy) Produkty reakcji PCR rozdzielano na 2% elu agarozowym barwionym bromkiem etydyny (1%, Serva, Niemcy)

3 Krêtki Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy Nr przy napiêciu 100V przez oko³o 1,5 h (Sigma Maxi Horizontal Gel Electrophoresis model SHU 20, Sigma Aldrich, Niemcy) Wielkoœæ amplifikowanego fragmentu wynosi³a 442 pary zasad Jako wzorca mas cz¹steczkowych u yto markera wielkoœci DNA M1 (puc19/mspi) (DNA Gdañsk, Polska) ele analizowano w promieniach œwiat³a UV przy u yciu transiluminatora (BTX-20M, CBS Scientific, USA), a nastêpnie fotografowano (Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software, Eastman Kodak, USA) WYNIKI W badaniach prowadzonych na terenie powiatu tarnogórskiego i kompleksu leœnego Gliwice w latach na 233 badanych kleszczy I ricinus u 14,2% wykryto obecnoœæ DNA B burgdorferi sl (tab I) W roku 2001 na 85 badanych kleszczy zaka onych B burgdorferi by³o 14 (16,5%), w 2002 na 114 zaka onych by³o 15 (13,2%), a w 2003 na 34 kleszcze zaka enie stwierdzono u 4 (11,8%) W badanym okresie zebrano ³¹cznie 129 samic, 76 samców oraz 28 nimf Odsetek zaka onych poszczególnych stadiów rozwojowych I ricinus kszta³towa³ siê nastêpuj¹co: w 2001 r stwierdzono 26,8% zaka onych samic, 22,2% samców i 5,6% nimf; w 2002 r: 14,7% samic, 9,7% samców i a 12,5% nimf; a w 2003 r: 21,4% samic, 5,6% samców oraz 0% nimf Porównuj¹c trzyletni okres badañ, najwy szy odsetek kleszczy zaka onych B burgdorferi sl stwierdzono wœród samic (16,3%), nieco ni szy u samców (13,2%), a wyraÿnie najni szy u nimf (7,1%) W 2002 r obserwowano znacznie ni szy procent zaka onych samic, natomiast nimfy zaka one by³y w wy szym procencie ni w pozosta³ych latach Tabela I Table I Wystêpowanie krêtków Borrelia burgdorferi sensu lato w ró nych stadiach rozwojowych kleszczy Ixodes ricinus w latach Occurrence of spirochetes Borrelia burgdorferi sensu lato in different development stages in Ixodes ricinus ticks in /DWD 5D]HP 6WDGLXPUR]ZRMRZH VDPLFH VDPFH LPI\ 2JyáHP n liczba zebranych kleszczy K/% liczba i odsetek zaka onych kleszczy n number of collected ticks K/% number and percentage of infected ticks

4 JK Strzelczyk, A Wiczkowski i inni 592 Nr 3 Œcie ka 1 kontrola negatywna Œcie ka 2 kontrola pozytywna Œcie ka 4, 8, 9 produkty amplifikacji fragmentu genu fla (strza³ki wskazuj¹ produkty wielkoœci 442 par zasad) Œcie ka 3, 5, 6, 7 brak produktu amplifikacji fragmentu genu fla Œcie ka 10 wzorzec wielkoœci DNA - M1 Lane 1 negative control Lane 2 positive control Lane 4, 8, 9 amplification products of fla gene fragment (arrow indicates products of 442 bp size) Lane 3, 5, 6, 7 absence of amplification products of fla gene fragment Lane 10 DNA - M1 size marker Ryc 1 Fig 1 el agarozowy z rozdzielonymi produktami amplifikacji fragmentu genu fla Agarose gel with separated amplification products of fla gene fragment Na wszystkich badanych terenach stwierdzono kleszcze zaka one krêtkami B burgdorferi Wyj¹tkowo wysok¹ ekstensywnoœci¹ zaka enia I ricinus charakteryzowa³y siê tereny rekreacyjne w Œwierklañcu (45%) oraz tereny leœne w okolicach Zielonej (37%) Natomiast najni szy stopieñ zainfekowanych kleszczy stwierdzono w Tarnowskich Górach (5,7%) Rycina 1 przedstawia rozdzia³ elektroforetyczny na elu agarozowym produktów amplifikacji DNA izolowanego z kleszczy Obecnoœæ w elu produktu reakcji PCR wielkoœci 442 par zasad œwiadczy o pozytywnym wyniku testu (próbki 4, 8, 9) DYSKUSJA W zwi¹zku z narastaj¹cym problemem epidemiologicznym, jaki stanowi borelioza z Lyme, du ego znaczenia nabiera ocena œrodowiskowych uwarunkowañ pojawiania siê tej choroby w ró nych regionach kraju Na terenie Polski kleszcze I ricinus wykazuj¹ zró nicowany stopieñ zaka enia B burgdorferi, wahaj¹cy siê w szerokich granicach 0,77-58% (12,13) Najni sz¹ ekstensywnoœæ zaka enia I ricinus wynosz¹c¹ tylko 0,77% (koszaliñskie, kroœnieñskie, suwalskie) poda³a Tylewska-Wierzbanowska i wsp (12) W województwie olsztyñskim stopieñ zaka enia klesz-

5 Krêtki Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy Nr czy B burgdorferi oceniono na 11-35% (16) Natomiast na terenach rekreacyjnych Trójmiasta stwierdzono 10,5% zaka enia Najwy szy poziom infekcji obserwowano u samców 18,9%, ni szy u samic 14,9%, a najni szy u nimf 8,2% (17) Badania nad prewalencj¹ zaka enia kleszczy I ricinus krêtkami B burgdorferi sl w latach na Pojezierzu Mazurskim wykaza³y sezonow¹ ró nicê zainfekowania kleszczy: 11,7% wiosn¹, a 2,6% jesieni¹ Najwy szy odsetek zaka onych kleszczy (22,8%) stwierdzono wœród samic, a odsetek zara onych samców wynosi³ 13%, nimf 10,5%, a larw 7,4% (18) Badania Wodeckiej i Sawczuk (19) prowadzone w latach (metod¹ PCR) i Humczewskiej i wsp (20) w latach (metod¹ IFA), w pó³nocno-zachodniej Polsce wykaza³y w badanych populacjach kleszczy zaka enie B burgdorferi wynosz¹ce 4,4% oraz 10-19% Michalik i Rejmenciak (21) wykazali w okolicach Poznania (metod¹ IFA) œredni¹ ekstensywnoœæ zaka enia kleszczy wynosz¹c¹ 22% (20,5% nimf, 23,8% samców i 31,0% samic) Dane z po³udniowo-wschodnich regionów Polski (województwo zamojskie, krakowskie, suwalskie i katowickie) wykaza³y, e odsetek postaci dojrza³ych kleszczy zaka onych krêtkami wynosi³ oko³o 4%, a larw a do 58,3% (13) Badania prowadzone w 1996 roku na Œl¹sku wykaza³y najwy szy odsetek zaka onych kleszczy w lasach ko³o Miko³owa (17,8% samców i 12,7% samic) i najni szy na obszarze Wojewódzkiego Parku Kultury i Wypoczynku w Katowicach (5% samców i 2,9% samic) (22) W póÿniejszym doniesieniu Petko (23) podaje, e liczba zaka onych kleszczy waha³a siê od 4,0-15,0% W naszych badaniach uzyskaliœmy podobny stopieñ zaka enia kleszczy, wynosz¹cy 14,2% Natomiast badania Stañczak i wsp (24), prowadzone równie na terenie Katowic, wykaza³y bardzo wysoki procent (37,5%) zainfekowanych kleszczy WNIOSKI Wilgotne lasy liœciaste i mieszane o bogatym poszyciu wystêpuj¹ce na badanych przez nas terenach rekreacyjnych województwa œl¹skiego tworz¹ ekosystem, który zapewnia dogodne warunki siedliskowe dla rozwoju kleszczy I ricinus Czêstotliwoœæ kontaktów ludzi z kleszczami na tych terenach jest znaczna, a stwierdzony przez nas stopieñ zainfekowania kleszczy pozwala wysun¹æ wniosek, e istnieje zwiêkszone ryzyko zaka enia krêtkami Borrelia JK Strzelczyk, A Wiczkowski, G Spausta, J Ciarkowska, M Zalewska-Ziob, G Izdebska-Straszak, J Strzelczyk *, J Kasperczyk ** PRESENCE OF SPIROCHETES OF BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO IN IXODES RICINUS TICKS IN THE RECREATIONAL AREA OF TARNOWSKIE GÓRY AND ZABRZE DISTRICTS IN SUMMARY Borrelia burgdorferi sensu lato is an aethiological factor of borreliosis Borrelia spirochete is transmitted to humans by ticks The aim of the study was to estimate the spirochetes B burgdorferi sl infection in Ixodes ricinus ticks by using PCR analysis of the flagellin gene fragment The study was carried out in in recreational areas of the Silesian Region in Poland (Tarnowskie

6 JK Strzelczyk, A Wiczkowski i inni 594 Nr 3 Góry and Zabrze administrative districts) In the 233 ticks analysed the DNA of B burgdorferi sl was detected in 33 (14,2%) cases Further comparison of spirochetes infection percentages in ticks during the three consecutive vegetation seasons was made The investigation of B burgdorferi sl detection in tick populations of recreational and endemic areas is important for the evaluation of the risk of infection PIŒMIENNICTWO 1 Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, i in Lyme disease - a tick - borne spirochetosis? Science 1982;216: Prokopowicz D Choroby przenoszone przez kleszcze Warszawa: Wydawnictwo Fundacji Buchnera; Pancewicz SA, Kondrusik M, Zajkowska J, i in Epidemiologia choroby z Lyme Med Prakt 1999;50: Danielova V, Daniel M, Rudenko N, i in Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in host- seeking Ixodes ricinus tick in selected South Bohemian locations (Czech Republic) Cent Eur J Publ Health 2004;12: uessada T, Martial-Convert F, Arnaud S, i in Prevalence of Borrelia burgdorferi species and identification of Borrelia valaisiana in uesting Ixodes ricinus in the Lyon Region of France as determined by Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003;22: Wang G, Van DA, Spanjaard L, i in Molecular typing of Borrelia burgdorferi sensu lato by randomly amplified polymorphic DNA fingerprinting analysis J Clin Microbiol 1998;36: Busch U, Hizo-Teufel C, Boehmer R, i in Three species of Borrelia burgdorferi sensu lato (B burgdorferi sensu stricto, B afzelii and B garinii) identified from cerebrospinal fluid isolates by pulsed field gel electrophoresis and PCR J Clin Microbiol 1996;43: Casati S, Bernasconi MV, Gern L, i in Diversity within Borrelia burgdorferi sensu lato genospecies in Switzerland by reca gene sequence FEMS Microbiol Lett 2004;238: Xu Y, Johnson RC Analysis and comparison of plasmid profiles of Borrelia burgdorferi sensu lato strains J Clin Microbiol 1995;33: Schouls LM, van de Pol I, Rijpkema SGT, i in Detection and identification of Ehrlichia, Borrelia burgdorferi sensu lato, and Bartonella species in Dutch Ixodes ricinus ticks J Clin Microbiol 1999;37: Schulze TL, Taylor RC,Taylor GC, i in Lime disease: a proposed ecological index to assess areas of risk in the northeastern United States Am J Publ Health 1991;81: Tylewska-Wierzbanowska S, Kruszewska D, Chmielewski T, i in Kleszcze jako rezerwuar Borrelia burgdorferi i Coxiella burnetii na terenie Polski Przegl Epidemiol 1996;50: Siñski E, Karbowiak G, Siuda K, i in Zaka enie kleszczy Borrelia burgdorferi w wybranych rejonach Polski Przegl Epidemiol 1994;48: Spausta G, Wiczkowski A, Ciarkowska J, i in Czêstoœæ wystêpowania Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy Ixodes ricinus z okolic Tarnowskich Gór Wiad Parazytol 2003;49: Stañczak J, Kubica-Biernat B, Burkiewicz A, i in Wstêpne badania nad zastosowaniem techniki reakcji ³añcuchowej polimerazy (PCR) do wykrywania krêtków Borrelia burgdorferi sensu lato w kleszczach Ixodes ricinus (Acari, Ixodidae) Problemy Hig 1997;54: Wegner Z, Stañczak J, Racewicz M, i in Wystêpowanie krêtków Borrelia burgdorferi w kleszczach Ixodes ricinus na terenie województwa bia³ostockiego W: Miêdzynarodowe Symozjum Borelioza z Lyme i inne zaka enia przenoszone przez kleszcze Bia³owie a Streszczenia 1995:51-2

7 Krêtki Borrelia burgdorferi sensu lato u kleszczy Nr Wegner Z, Racewicz M, Kubica-Biernat B, i in Wystêpowanie kleszczy Ixodes ricinus (Acari, Ixodidae) na zalesionych obszarach Trójmiasta i ich zaka enie krêtkami Borrelia burgdorferi Przegl Epidemiol 1997;51: Pawe³czyk A, Siñski E Prewalencja zaka enia kleszczy I ricinus krêtkami Borrelia burgdorferi sl: sezonowe i roczne zmiany Wiad Parazytol 2004;50: Wodecka B, Sawczuk M Wystêpowanie chorobotwórczych genogatunków z obrêbu Borrelia burgdorferi sensu lato w kleszczach Ixodes ricinus od³awianych z pó³nocno-zachodniej Polski Wiad Parazytol 2004;50: Humczewska M, KuŸna-Grygiel W, Ko³odziejczyk L, i in Ekstensywnoœæ zaka enia populacji Ixodes ricinus krêtkami Borrelia burgdorferi sensu lato w lasach pó³nocno-zachodniej Polski Wiad Parazytol 2003;49: Michalik J, Rejmenciak A Occurence of Ixodes ricinus in different types of forest habitats of the city of Poznañ and their infection rate with Borrelia burgdorferi sensu lato Wiad Parazytol 1998;44: Petko B, Siuda K, Stanko M, i in Borrelia burgdorferi sensu lato in the Ixodes ricinus ticks in southern Poland Ann Agric and Environ Med 1997;4: Petko B Lyme borreliosis in carpathian region of central Europe ecological aspect of diagnostics W: Buczek A, B³aszak C, red Stawonogi w medycynie Lublin: Liber, 2002: Stañczak J, Racewicz M, Kubica-Biernat B, i in Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks (Acari, Ixododae) in different Polish woodlands Ann Agric Environ Med 1999;6: Otrzymano r Adres autora: Joanna Katarzyna Strzelczyk Katedra i Zak³ad Ogólnej Biologii Lekarskiej Œl¹skiej Akademii Medycznej w Zabrzu ul Jordana 19, Zabrze tel (32) , biolmedzab@slamkatowicepl