Badanie zawartości morfiny w płynach ustrojowych osób po spożyciu produktów spożywczych zawierających mak oraz jej oznaczanie w tych wyrobach

Transkrypt

1 Mariola Burstein Badanie zawartości morfiny w płynach ustrojowych osób po spożyciu produktów spożywczych zawierających mak oraz jej oznaczanie w tych wyrobach Mak jest jedn¹ z najstarszych roœlin rolniczych, której œlady uprawy s¹ spotykane w wykopaliskach archeologicznych z czasów prehistorycznych. Wykorzystywano go w celu pozyskania œrodków odurzaj¹cych, zw³aszcza opium, którym handel w wiekach XVII XIX przyczyni³ siê do rozwoju francuskich i angielskich kolonii w Indiach. W Europie do XIX wieku mak uprawiano na potrzeby domowe oraz jako roœlinê ozdobn¹. Po II wojnie œwiatowej nast¹pi³ wzrost area³u jego uprawy. Do rodzaju mak (Papaver) nale y oko³o stu gatunków ró ni¹cych siê wieloma cechami, m.in. pokrojem roœliny, kolorem i kszta³tem p³atków korony, kszta³tem makówki, barw¹ i sk³adem chemicznym nasion oraz zawartoœci¹ alkaloidów w roœlinie. Znaczenie rolnicze ma mak lekarski (Papaver somniferum L.). Najbardziej rozpowszechniony jest jego podgatunek euroazjatycki ssp. euroasiaticum o torebkach zamkniêtych pod tarcz¹ znamienia i nieosypuj¹cych siê nasionach. Obecnie w Polsce, w celu uzyskania nasion bêd¹cych surowcem w przemyœle cukierniczym i piekarniczym, uprawiany jest wy- ³¹cznie mak niskomorfinowy. W 1990 r. zarejestrowano jego pierwsz¹ odmianê Przemko, charakteryzuj¹c¹ siê bardzo nisk¹ zawartoœci¹ alkaloidów morfinowych w dojrza³ych makówkach. W nastêpnych latach wyhodowano kolejne odmiany maków niskomorfinowych, które zosta³y zapisane w Rejestrze Odmian [1] (tab. 1). Wyhodowanie nowych odmian maków niskomorfinowych maj¹cych ró ny pokrój lub barwê p³atków korony, w porównaniu do odmiany wysokomorfinowej, której uprawa jest zakazana, u³atwia Odmiana kontrolê zasiewów, a tak e likwidacjê nielegalnych plantacji. Zgodnie z Ustaw¹ o przeciwdzia³aniu narkomanii uprawa maku, z wyj¹tkiem maku niskomorfinowego, mo e byæ prowadzona wy³¹cznie na potrzeby przemys³u farmaceutycznego i nasiennictwa. Mak mo na produkowaæ na podstawie umowy kontraktacyjnej i uzyskanego z urzêdów gmin p³atnego pozwolenia na uprawê [2]. Aktualne zapotrzebowanie na nasiona maku na rynku krajowym nie jest pokrywane przez rodzimych producentów. Jest to spowodowane przede wszystkim wprowadzeniem zakazu uprawy maku wysokomorfinowego, œcis³ej kontroli jego uprawy i rejonizacji. W 2001 Tabela 1 Zestawienie odmian maków niskomorfinowych w Rejestrze Odmian Varieties of low morphine poppies registered on Variety Index Hodowca PRZEMKO IHAR Poznañ we wspó³pracy z ZD HAR Borowo MIESZKO ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Poznañ MICHA KO IHAR Poznañ we wspó³pracy z ZD HAR Borowo RUBIN ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Poznañ AGAT ZD HAR Borowo we wspó³pracy z IHAR Borowo ZAMBO IHAR Poznañ we wspó³pracy z ZD HAR Borowo Rok rejestracji morfiny w makowinach [%] 1990 < 0, < 0,04 Barwa kwiatów bia³e z fioletowym oczkiem ciemnoró owe z jasnofioletowym, oczkiem 1999 < 0,04 bia³e z fioletowym oczkiem 2000 < 0, < 0, < 0,05 ciemnoró owe z jasnofioletowym, oczkiem ró owe z jasnofioletowym, oczkiem ró owe z jasnofioletowym, oczkiem 24 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

2 r. zbierano plony z powierzchni 2054 ha, a w 2003 r. ju tylko z 1200 ha. Mak zajmuje w Polsce stosunkowo niewielk¹ powierzchniê uprawy, a jego cena jest bardzo wysoka. Tak jak w pañstwach oœciennych jego nasiona s¹ u ywane w naszym kraju przede wszystkim w przemyœle piekarniczym, cukierniczym i gastronomicznym. Wysoko ceni siê tak e spo ywczy i przemys³owy olej makowy. Sta³e zagro enie stwarza import konsumpcyjnych nasion maku wysokomorfinowego wykorzystywanych do zak³adania nielegalnych plantacji. Wyniki wielu badañ analitycznych i liczne doniesienia wskazywa³y, e po spo yciu produktów zawieraj¹cych mak lub po za yciu leków, których sk³adnikiem jest kodeina, w moczu pozostaj¹ œlady morfiny. Potwierdzi³y to badania przeprowadzone w Pracowni Psychofarmakologii Katedry Psychiatrycznej Akademii Medycznej w Warszawie. Jednorazowym testem jakoœciowym na obecnoœæ narkotyków zbadano mocz 16-letniego ch³opca. Uzyskano wynik dodatni, poniewa test wskaza³ obecnoœæ morfiny. Mocz poddano badaniu metod¹ FPIA na analizatorze TDX firmy Abott. Stê enie morfiny w moczu wynios³o 425 ng/ml i przekroczy³o wartoœæ progow¹ wynosz¹c¹ 250 ng/ml. Z przeprowadzonego z ch³opcem i jego matk¹ wywiadu wynika³o, e badany zjad³ poprzedniego dnia dro d ówkê z makiem. Zaniepokojona takim wynikiem matka ch³opca, w celu sprawdzenia wiarygodnoœci otrzymanych wyników badañ, zjad³a w ci¹gu dwóch dni trzy dro d ówki, które kupi³a w tej samej piekarni. Równie w jej moczu wykazano obecnoœæ morfiny, której stê enie w teœcie FPIA wynios³o 975 ng/ml. Badanie przeprowadzono nastêpnie na kolejnych trzech osobach, które spo y³y dro d ówki pochodz¹ce z tego samego Ÿród³a. Wyniki równie by³y dodatnie. Pozytywne wyniki w tych samych próbkach moczu zosta³y potwierdzone przez inne laboratoria: Pracowniê Toksykologiczn¹ Instytutu Ekspertyz S¹dowych w Krakowie, Pracowniê Badañ Narkotyków w P³ynach Ustrojowych CLK KGP oraz Pracowniê Zak³adu Badañ Antydopingowych Instytutu Sportu. Oznaczenia wykonano metodami HPLC i GC-MS [3]. Opisany w raporcie opublikowanym przez Pracowniê Psychofarmakologii problem wystêpowania morfiny w moczu powy ej wartoœci progowej po zjedzeniu wyrobów zawieraj¹cych mak zainspirowa³ autorkê niniejszej pracy do przeprowadzenia niezale nych, w³asnych badañ. Dodatkowym bodÿcem by³ fakt, e nie znaleziono publikacji naukowych dotycz¹cych badañ na wykrywanie obecnoœci morfiny w p³ynach ustrojowych po spo yciu produktów cukierniczych zawieraj¹cych mak. Alkaloidy opium charakterystyka Opium otrzymuje siê przez wysuszenie odpowiednio przygotowanego soku z niedojrza³ych makówek maku lekarskiego (Papaver somniferum L.). Zawarte w opium substancje maj¹ silne dzia³anie farmakologiczne, co odkryto ju ponad 6000 lat temu (œwiadcz¹ o tym zapisy na sumeryjskich tabliczkach). Obecnie na œwiecie produkuje siê oko³o 520 ton opium w przeliczeniu na czyst¹ morfinê g³ównie w po³udniowo- -wschodniej i po³udniowo-zachodniej Azji, Ameryce Po³udniowej i Meksyku. Opium zawiera oko³o 20 alkaloidów nale ¹cych do dwóch grup: alkaloidy fenantrenowe (morfina, kodeina, tebaina), alkaloidy izochinolinowe (papaweryna, narkotyna (noskapina), narceina). Spoœród tych alkaloidów najwiêksze znaczenie maj¹ morfina, kodeina i tebaina, która nie ma dzia³ania narkotycznego, ale s³u y do produkcji innych zwi¹zków psychoaktywnych [4]. Morfina charakterystyka Morfina (3,6-dihydroksy-4,5-epoksy-N-metylomorfinen-7) zosta³a po raz pierwszy wyizolowana z opium przez Sertürnera w 1805 r. Jej strukturê okreœli³ w 1927 r. Richardson, a jej pierwsza synteza zosta³a przeprowadzona 150 lat po wyizolowaniu, czyli w 1952 r. (ryc. 1). Ryc. 1. Wzór strukturalny morfiny Fig. 1. Morphine structural formula W celach klinicznych morfina jest stosowana w postaci siarczanu bia³ego proszku rozpuszczalnego w wodzie (1 g w 15,5 ml wody) i praktycznie nierozpuszczalnego w chloroformie i eterze. Wch³ania siê z przewodu pokarmowego w ograniczonym stopniu, w 15 75% zale nie od w³aœciwoœci osobniczych. Dzia- ³a uspokajaj¹co i przeciwlêkowo, poprawia samopoczucie, zmniejsza zdolnoœæ odczuwania bólu. Wi¹ e siê z bia³kami krwi w 35 40% i ³atwo przenika do wszystkich tkanek. Metabolizowana jest w w¹trobie, PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)

3 przez O-metylacjê do kodeiny i N-metylacjê do normorfiny, szybko przenika przez œcianê b³ony ³o yska i do mleka matki. Wydalana jest g³ównie z moczem i w niewielkiej iloœci z ka³em. Okres po³owicznego wydalania wynosi 1 2 godziny. Dawka toksyczna morfiny wynosi oko³o 60 mg, a dawka œmiertelna 300 mg po przyjêciu doustnym i mg przy podaniu pozajelitowym. Morfina i jej metabolity s¹ sprzêgane z kwasem glukuronowym i wydalane z moczem. Podstawowym zagro eniem, jakie stwarza przyjmowanie morfiny, jest rozwój tolerancji, a nastêpnie uzale nienie. Nag³e odstawienie morfiny prowadzi do wyst¹pienia objawów abstynencji. Morfina nasila dzia³anie innych opioidów, leków uspokajaj¹cych, nasennych, psychotropowych i etanolu. Morfina wystêpuje w organizmie w postaci wolnej i sprzê onej. W moczu ludzkim w 10% w postaci wolnej i 75% w postaci 3-glukuronidu morfiny (o okresie po³owicznego wydalania do 4 godzin). Pozosta³¹ czêœæ stanowi 6-glukuronid, 3-etero-siarczan i 3,6-diglukuronid morfiny. Wymienione metabolity s¹ równie obecne we krwi i w osoczu. Rycina 3 ukazuje metabolizm opiatów zachodz¹cy w organizmie cz³owieka. Heroina charakterystyka Znacznie silniejszym œrodkiem uzale niaj¹cym jest heroina (diacetylomorfina) (ryc. 2), która zosta³a otrzymana przez diacetylacjê morfiny w 1898 r. i wprowadzona do u ytku jako lek przeciwbólowy przez firmê Bayer. Na rynku narkotykowym wystêpuje w postaci bia³ego proszku. heroiny w jednej dawce wynosi 21 60%. Pozosta³e sk³adniki to wype³niacze, którymi mog¹ byæ zwi¹zki obojêtne farmakologicznie (laktoza, skrobia), jak równie aktywne: benzodiazepiny, strychnina, skopolamina i paracetamol. Ryc. 2. Wzór strukturalny heroiny Fig. 2. Heroin structural formula Osoby uzale nione za ywaj¹ morfinê i heroinê ró - nymi drogami: do ylnie, donosowo, przez wdychanie lub palenie. Heroinê (w Polsce tzw. kompot) najczêœciej przyjmuje siê do ylnie. Ryc. 3. Metabolizm opiatów w organizmie cz³owieka Fig. 3. Opiates metabolism in human body Heroina wprowadzona do ustroju ulega szybkiej hydrolizie do 6-O-monoacetylomorfiny, która nastêpnie ulega powolnej hydrolizie do morfiny. G³ównymi metabolitami heroiny wystêpuj¹cymi w moczu przez godzin po podaniu do ylnym s¹: 3-O-glukuronian morfiny (38,2% dawki), 6-O-monoacetylomorfina (1,3%), wolna morfina (4,2%) oraz niezmieniona heroina (0,1%). Inne glukuroniany morfiny oraz normorfina powstaj¹ z heroiny w znikomych iloœciach [6]. W moczu ludzi przyjmuj¹cych ten narkotyk wystêpuje czêsto kodeina, która nie jest metabolitem heroiny, ale powstaje w wyniku deacetylacji acetylokodeiny stanowi¹cej zanieczyszczenie nielegalnie produkowanej heroiny. Heroina ulega bardzo szybkiemu metabolizmowi, przez co nie mo na jej w zasadzie wykryæ w p³ynach biologicznych okres pó³trwania wynosi 2 3 minuty. Informacjê o tym, czy dana osoba za ywa³a heroinê, uzyskuje siê, oznaczaj¹c jej g³ówny metabolit morfinê. O stosowaniu heroiny mo e œwiadczyæ tak e obecnoœæ w moczu 6-O-monoacetylomorfiny (MAM), jednak metabolit ten udaje siê wykryæ jedynie bezpoœrednio w ci¹gu 2 8 godzin po przyjêciu heroiny, gdy szybko przekszta³ca siê on w woln¹ morfinê. 26 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

4 Kodeina charakterystyka Kodeina (metylomorfina) jest naturalnym alkaloidem wystêpuj¹cym w opium. Po raz pierwszy zosta³a wyizolowana w 1832 r. przez Robiqueta (ryc. 4). Jest stosowana w postaci fosforanów i siarczanów jako lek przeciwkaszlowy i w mieszankach przeciwbólowych (wykazuje 20% przeciwbólowej aktywnoœci morfiny). Jako lek kodeina jest podawana doustnie lub podskórnie. Ryc. 4. Model cz¹steczki kodeiny Fig. 4. Codeine particle Ryc. 5. Schemat metabolizmu kodeiny [4] Fig. 5. Codeine metabolism scheme [4] Kodeina stanowi sk³adnik polskiej heroiny i jest przyjmowana do ylnie. Dobrze wch³ania siê z przewodu pokarmowego i po podaniu domiêœniowym (maksymalne stê enie jest obserwowane po minutach). Po podaniu doustnym maksymalne stê enie jest osi¹gane po oko³o godzinie do dwóch. Kodeina ulega biotransformacji do morfiny (O-demetylacja) i norkodeiny (N-demetylacja). Zarówno kodeina, jak i jej metabolity ulegaj¹ nastêpnie sprzêganiu z kwasem glukuronowym (ryc. 5). Lp. Nr próbki (kolejna badana osoba) Wyniki badañ próbek moczu Results of urine sample analysis Czas, po którym pobrano próbkê Uzyskane stê enie narkotyków z grupy opiatów Tabela 2 Wynik badania próbki 1 d1m 7,5 965,7 Pozytywny Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i ślinie po spożyciu cukierniczych produktów spożywczych zawierających mak wyniki własne Oznaczanie morfiny obecnej w moczu po spo yciu dro d ówek z makiem eksperyment I Zebrano grupê jedenastu ochotników, którym podano do zjedzenia dro d ówki z makiem kupione w jednej z warszawskich piekarni (pochodzi³a z niej tak e dro d ówka zjedzona przez ch³opca, którego mocz badano w Pracowni Psychofarmakologii Katedry Psychiatrycznej AM w Warszawie). Nastêpnie po up³ywie okreœlonego czasu od ka dej z osób pobrano próbkê moczu, któr¹ nastêpnie poddano badaniom metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowego zestawu odczynników na opiaty. Wyniki przedstawia tabela 2. 2 d2m 7,5 255,1 Pozytywny 3 d3m 6 99,3 Negatywny 4 d4m 7,5 100,0 Negatywny 5 d5m 7,5 186,2??? 1 6 d6m 6 93,9 Negatywny 7 d7m 6 94,4 Negatywny 8 d8m 6 81,4 Negatywny 9 d9m 7,5 151,7??? 1 10 d10m 7,5 97,8 Negatywny 11 d11m 1??? wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od cut-off ) Cut-off graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml. 1??? questionable result (slightly lower than cut-off ) Cut-off treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates amounts to 200 ng/ml for urine samples PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)

5 Wyniki powy ej wartoœci cut-off s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale miêdzy 150 ng/ml a 200 ng/ml, w¹tpliwymi, zaœ poni ej wartoœci 150 ng/ml negatywnymi. Kryteria walidacji metody immunoenzymatycznej na obecnoœæ opiatów przedstawiono w tabeli 3. Tabela 3 Wynik Stê enie opiatów Absorbancja S1 0,000 1,142 S2 50,000 0,147 S3 300,000 0,089 S4 500,000 0,054 S1 > S2, 1,142 > 0,147 S2 > S3, 0,147 > 0,089 S3 > S4, 0,089 > 0,054 Na podstawie uzyskanych parametrów zosta³a wykreœlona krzywa zale noœci absorbancji od stê enia morfiny (ryc. 6). Ryc. 6. Wykres zale noœci absorbancji od stê enia morfiny Fig. 6. Relationship between absorbance and morphine concentration Oznaczanie morfiny obecnej w œlinie po spo yciu dro d ówek z makiem eksperyment II Od tej samej grupy ochotników pobrano równie próbki œliny w odstêpach czasowych odpowiednio po 2 i 4 godzinach od zjedzenia dro d ówki z makiem. Próbki te, podobnie jak próbki moczu, poddano badaniu metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowych zestawów odczynników na opiaty. Uzyskane wyniki badañ zosta³y przedstawione w tabeli 4. Wyniki badañ próbek œliny Results of saliva sample analysis Tabela 4 Lp. Nr próbki (kolejna badana osoba) Uzyskane stê enie po 2 h Wynik badania próbki Nr próbki (kolejna badana osoba) Uzyskane stê enie po 4 h Wynik badania próbki 1 d1s1 15,1??? 1 d1s2 2,7 Negatywny 2 d2s1 15,4??? 1 d2s2 15,4??? 1 3 d3s1 9,4 Negatywny d3s2 7,1 Negatywny 4 d4s1 8,7 Negatywny d4s2 7,6 Negatywny 5 d5s1 13,3 Negatywny d5s2 11,7 Negatywny 6 d6s1 18,3??? 1 d6s2 16,6??? 1 7 d7s1 64,3 Pozytywny d7s2 3,9 Negatywny 8 d8s1 6,2 Pozytywny d8s2 1,9 Negatywny 9 d9s1 105,4 Pozytywny d9s2 11,1 Negatywny 10 d10s1 13,5 Negatywny d10s2 6,8 Negatywny 11 d11s1 17,0??? 1 d11s2 11,7 Negatywny 1??? wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od cut-off ) Cut-off graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml 1??? questionable result (slightly lower than cut-off ) Cut-off treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates amounts to 20 ng/ml for saliva samples 28 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

6 Wyniki powy ej wartoœci cut-off s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale pomiêdzy 15 ng/ml a 20 ng/ml s¹ wynikami w¹tpliwymi, a poni ej wartoœci 15 ng/ml s¹ wynikami negatywnymi. Kryteria walidacji dla tej metody zilustrowano w tabeli 5. Wynik S1>S2, 1,263 > 0,597 S2>S3, 0,597 > 0,199 S3>S4, 0,199 > 0,060 Stê enie opiatów Absorbancja S1 0,000 1,263 S2 10,000 0,597 S3 100,000 0,199 S4 500,000 0,060 Tabela 5 Osoba d11 bra³a tylko udzia³ w badaniu œliny. Na podstawie parametrów zosta³a wykreœlona krzywa zale noœci absorbancji od stê enia morfiny (ryc. 7). kolumna HP-5MS, d³ugoœæ 15 m, œrednica wewnêtrzna 0,25 mm, gruboœæ filmu 0,25 μm, przep³yw 1,8 ml/min, program temperaturowy: izoterma 100 o C 2 min, przyrost 24 o C/min do 280 o C, izoterma 280 o C 3,5 min, dozownik temp. 250 o C, nastrzyk: 1 μl, temperatura linii transferowej: 280 o C. Monitorowane jony wyszczególniono w tabeli 6. Lp. Nazwa Widmo masowe [m/z] 1 kodeina 178, 196, kodeina D3 181, 199, morfina 401, 414, morfina D3 404, 417, MAM 287, 340, MAM D3 290, 343, 402 Tabela 6 W wyniku przeprowadzonych badañ stwierdzono w próbkach moczu d1m, d2m, d5m, d9m obecnoœæ morfiny oraz kodeiny (tab. 7). Tabela 7 Stê enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu Concentration of codeine and morphine in urine samples Nr próbki iloœciowa morfiny iloœciowa kodeiny d1m Ryc. 7. Wykres zale noœci absorbancji od stê enia morfiny Fig. 7. Relationship between absorbance and morphine concentration Badania instrumentalne próbek moczu i śliny Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj. d1m, d2m, d5m, d9m oraz d1s1, d2s1, d6s1, d7s1, d9s1, d11s1, d2s2 i d6s2 zosta³y poddane chemicznym badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. Badania przeprowadzono w nastêpuj¹cych warunkach analitycznych: d2m d5m d9m Chromatogramy próbki moczu d1m i jej widmo masowe przedstawiono na rycinach 8 i 9. W próbkach œliny d1s1, d2s1, d6s1, d11s1 oraz d2s2, d6s2 stwierdzono obecnoœæ morfiny na poziomie œlepej próby, a w próbce d7s1 œladow¹ iloœæ kodeiny oraz morfiny. Próbki d9s1, ze wzglêdu na bardzo ma³¹ iloœæ badanego materia³u, nie poddano badaniom potwierdzaj¹cym (tab. 8). PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)

7 W eksperymencie wzi¹³ udzia³ ochotnik, któremu podano dwa kawa³ki makowca kupione w przypadkowej cukierni oraz dro d ówkê z makiem pochodz¹c¹ z tego samego Ÿród³a, co dro d ówki spo ywane przez ochotników w dwóch wczeœniejszych eksperymentach. Celem eksperymentu by³o zbadanie, czy wystêpuj¹ ró nice w obecnoœci morfiny w cukierniczych wyrobach spo ywczych zawieraj¹cych mak, pochodz¹cych z ró - nych Ÿróde³. Aby to stwierdziæ, wykorzystano test immunologiczny do wykrywania morfiny w moczu o stê- eniu powy ej 300 ng/ml Morfina-TEST IsoTech. Przed przyst¹pieniem do badañ, czyli zanim ochotnik zjad³ ciastka, wykonano tzw. œlep¹ próbê pobrano od niego próbkê moczu i zbadano za pomoc¹ testu wynik by³ negatywny. Nastêpnie ochotnik zjad³ ciastko. Próbki moczu, które poddawano badaniu, pobierano od niego co godzinê. Wyniki badania zestawiono w tabeli 9. Tabela 9 Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu przez ochotnika dwóch kawa³ków makowca Collation of results (urine) after consumption of two pieces of poppy seeds cake Ryc. 8. Chromatogram próbki moczu d1m Fig. 8. d1m urine sample chromatogram Lp. Czas badania moczu od spo ycia ciastka Wynik testu 1 œlepa próba ujemny 2 0,5 ujemny 3 1 ujemny 4 2 dodatni 5 3 dodatni 6 4 dodatni 7 5 ujemny Ryc. 9. Widmo masowe próbki moczu d1m Fig. 9. Mass spectrum of d1m urine sample Tabela 8 Stê enie kodeiny i morfiny w próbce œliny d7s1 Concentration of codeine and morphine in d7s1 saliva sample Nr próbki iloœciowa morfiny iloœciowa kodeiny d7s Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i w œlinie po spo yciu dro d ówek z makiem eksperyment III (z u yciem testu IsoTech oraz SmartClip) 8 6 ujemny Po tygodniu podjêto eksperyment i podano ochotnikowi dro d ówkê z makiem pochodz¹c¹ ze wspomnianej ju piekarni. Jednoczeœnie pobierano od niego do badañ próbki œliny równie co godzinê od chwili zjedzenia ciastka. Nastêpnie próbki œliny poddano badaniu za pomoc¹ testów œlinowych SmartClip firmy Envitec. Wyniki przedstawiono w tabelach 10 i 11. Tabela 10 Zestawienie wyników badania moczu po zjedzeniu przez ochotnika dro d ówki z makiem Collation of results (urine) after consumption of poppy seeds cookie Lp. Czas badania moczu od spo ycia ciastka Wynik testu 1 œlepa próba ujemny 2 1 ujemny 3 2 dodatni 4 3 dodatni 5 4 dodatni 6 5 dodatni 7 6 dodatni 8 22 ujemny 30 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

8 Tabela 11 Zestawienie wyników badania œliny po zjedzeniu przez ochotnika dro d ówki z makiem Collation of results (saliva) after consumption of poppy seeds cookie Lp. Czas badania œliny od spo ycia ciastka Wynik testu 1 œlepa próba ujemny po up³ywie okreœlonego przedzia³u czasu pobierano od niego próbki moczu oraz œliny, które nastêpnie poddano badaniom metod¹ immunoenzymatyczn¹ na automatycznym analizatorze EVOLIS firmy Bio-Rad z wykorzystaniem firmowych zestawów odczynników na opiaty. Mocz zbadano jednoczeœnie za pomoc¹ testu Iso- Tech. Wyniki badania ukazuj¹ tabele 12 i 13 oraz rycina dodatni 3 2 ujemny 4 3 ujemny 5 4 ujemny 6 5 ujemny 7 6 ujemny Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i w ślinie metodą immunoenzymatyczną na automatycznym analizatorze EVOLIS W celu sprawdzenia powtarzalnoœci wyników po kolejnym tygodniu podano ochotnikowi dro d ówkê z makiem (z tej samej co wczeœniej piekarni). Nastêpnie Ryc. 10. Wykres zale noœci uzyskanego stê enia od czasu badania moczu Fig. 10. Relationship between obtained concentration and time of urine sample analysis Wyniki powy ej wartoœci cut-off s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale pomiêdzy 150 ng/ml a 200 ng/ml w¹tpliwymi, zaœ poni ej wartoœci 150 ng/ml negatywnymi. Wyniki badañ próbek moczu Results of urine sample analysis Tabela 12 Lp. Nr próbki Czas badania moczu od spo ycia ciastka Uzyskane stê enie Wynik badania próbki Wynik testu IsoTech 1 dom1 1 88,4 Negatywny ujemny 2 dom ,6 Pozytywny dodatni 3 dom ,5 Pozytywny dodatni 4 dom ,2 Pozytywny dodatni 5 dom5 5 96,0 Negatywny dodatni 6 dom6 6 90,5 Negatywny dodatni 7 dom7 7 85,2 Negatywny ujemny 8 dom ,8 Negatywny ujemny Cut-off graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania moczu wynosi 200 ng/ml Cut-off treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates amounts to 200 ng/ml for urine samples PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)

9 Lp. Nr próbki Wyniki badañ próbek œliny Results of saliva sample analysis Czas badania œliny od spo ycia ciastka Uzyskane stê enie Tabela 13 Wynik badania próbki 1 dos1 1 25,8 Pozytywny 2 dos2 2 16,2??? 1 3 dos3 3 11,4 Negatywny 4 dos4 4 10,5 Negatywny 5 dos5 5 6,4 Negatywny 6 dos6 6 3,8 Negatywny 7 dos7 7 2,9 Negatywny 1??? wynik w¹tpliwy (nieco mniejszy od cut-off ) Cut-off graniczna wartoœæ detekcji oddzielaj¹ca wyniki pozytywne od negatywnych w przypadku opiatów dla badania œliny wynosi 20 ng/ml. 1??? questionable result (slightly lower than cut-off ) Cut-off treshold value of detection which separates positive and negative results, in case of opiates amounts to 20 ng/ml for saliva samples Próbki moczu i œliny z wynikami pozytywnymi, tj. dom2, dom3, dom4 oraz dos1 i dos2, zosta³y poddane badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. W wyniku przeprowadzonych badañ w próbkach moczu dom2, dom3, dom4 stwierdzono obecnoœæ morfiny oraz kodeiny (tab. 14). W próbkach œliny dos1 i dos2 obecnoœæ morfiny i kodeiny stwierdzono na poziomie œlepej próby. Tabela 14 Stê enie kodeiny i morfiny w próbkach moczu Concentration of codeine and morphine in urine samples Nr próbki Czas badania moczu od spo ycia ciastka iloœciowa morfiny iloœciowa kodeiny dom dom dom dom Ryc. 11. Wykres zale noœci uzyskanego stê enia od czasu badania œliny Fig. 11. Relationship between obtained concentration and saliva analysis time Ryc. 12. Wykres zale noœci uzyskanego stê enia morfiny i kodeiny od czasu badania moczu Fig. 12. Relationship between obtained codeine and morphine concentration and urine analysis time Wyniki powy ej wartoœci cut-off s¹ wynikami pozytywnymi, w przedziale miêdzy 15 ng/ml a 20 ng/ml w¹tpliwymi, zaœ poni ej wartoœci 15 ng/ml negatywnymi. Wszystkie próbki wskazane do powy szych badañ potwierdzaj¹cych wykaza³y obecnoœæ morfiny i kodeiny. Oznaczanie morfiny obecnej w moczu i w ślinie za pomocą badań instrumentalnych Ryc. 13. Chromatogram próbki moczu dom3 Fig. 13. dom3 urine sample chromatogram 32 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

10 Tak przygotowane próbki maku zosta³y poddane chemicznym badaniom instrumentalnym metod¹ chromatografii gazowej sprzê onej ze spektrometri¹ masow¹ na urz¹dzeniu GC/MS QP-5050 firmy Shimadzu, zgodnie z ustalon¹ w CLK KGP metodyk¹ do wykrywania opiatów i oznaczania morfiny i kodeiny. Wyniki badañ ukazuje tabela 15. Ryc. 14. Widmo masowe próbki moczu dom3 Fig. 14. Mass spectrum of dom3 urine sample Oznaczanie morfiny obecnej w maku pochodzącym z różnych źródeł W celu zbadania, czy w maku dostêpnym w handlu detalicznym mo na stwierdziæ obecnoœæ morfiny, a jeœli tak, to w jakim stê eniu, kupiono mak pochodz¹cy z ró nych Ÿróde³: M1 i M2: kupiony na wagê na bazarze i w hali targowej, M3: mak niebieski paczkowany firmy WIKPOL z Piotrkowa Trybunalskiego. Wszystkie trzy próbki maku poddano badaniom za pomoc¹ mikroskopu steroskopowego firmy OLYM- PUS SZX12, stosuj¹c dziesiêciokrotne powiêkszenie. W próbkach maku M1 i M3 stwierdzono obecnoœæ domieszek s³omy makowej (ryc ). Tabela 15 Stê enie kodeiny i morfiny w próbkach maku Concentration of codeine and morphine in poppy seed samples Nr próbki iloœciowa morfiny w 15 g nawa ki [ng] iloœciowa morfiny w 1 g [ng] iloœciowa kodeiny w 15 g nawa ki [ng] iloœciowa kodeiny w 1 g [ng] M M M Z próbek maku M1, M2 i M3 oraz masy makowej pobranej z dro d ówki z piekarni warszawskiej (M1PL) oraz z ciastka makowego (M2CM) pobrano próbki po oko³o 400 mg i ka d¹ z nich ekstrahowano: Ryc. 16. Próbka maku M3 Fig. 16. M3 poppy seed sample Ryc. 15. Próbka maku M1 Fig. 15. M1 poppy seed sample W próbce maku M2 nie znaleziono domieszek s³omy makowej (ryc. 17). Ze wszystkich trzech próbek pobrano nawa ki po 15 g, po czym ka d¹ zalano 50 ml gor¹cej wody. Po dekantacji otrzymano oko³o 5 ml roztworu do analizy i dodano standardy wewnêtrzne: morfiny-d3, kodeiny- -D3 i 6-MAM-D3, 4 ml 0,1 M buforu fosforanowego o ph 6 i ekstrahowano na kolumienkach Bond Eluit Certify zgodnie z metodyk¹. Ryc. 17. Próbka maku M2 Fig. 17. M2 poppy seed sample PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)

11 noznacznie stwierdziæ, czy by³ to szum, czy pik zwi¹zku. 2. Badania metod¹ chromatografii gazowej sprzê onej ze spektrometri¹ masow¹ (GC/MS) Ryc. 18. Chromatogram nawa ki maku próbki M2 Fig. 18. Chromatogram of poppy seed analytical sample M2 Ryc. 19. Widmo masowe nawa ki maku próbki M2 Fig. 19. Mass spectrum of poppy seed analytical sample M2 40 ml metanolu (5 cykli): M1, M2, M3, M1PL, M2CM), 40 ml wody destylowanej (6 cykli): M1W, M2W, M3W, M1PLW, M2CMW, z u yciem sterowanego automatycznie ekstraktora firmy IKA Werke. 1. Badania metod¹ chromatografii cieczowej Otrzymane ekstrakty analizowano na chromatografie cieczowym firmy Shimadzu HPLC10Avp z automatycznym podajnikiem próbek w nastêpuj¹cych warunkach: kolumna LiChrospher TM 5μ, 60 RP-select B, 4 mm na 125 mm, eluent: A: woda: kwas fosforowy (1000:0,1), B: acetonitryl, w gradiencie stê enia: od 10%B, w 5 min 35%B, od 6 do 10 min 80%B, w 11 min 10%B, od 11 do 22 min 10%B, przep³yw 1,0 ml/min, czas analizy 22 min, temp. 30 o C, detektor DAD, UV λ = 210 nm. W wyniku przeprowadzonych badañ w opisanych warunkach w analizowanych próbkach nie stwierdzono obecnoœci morfiny w iloœci >0,01%. Dla czasu retencji morfiny w tych próbkach by³o porównywalne widmo absorpcji promieniowania z widmem bibliotecznym morfiny. OdpowiedŸ detektora by³a rejestrowana, ale nie mo na by³o tych widm porównaæ. Nie mo na by³o jed- Z próbek M2, M2CM, M1PL oraz M2W pobrano po 2 ml ekstraktu, odparowano do sucha w strumieniu azotu, a nastêpnie poddano derywatyzacji (200 μl BSA i 1 ml acetonitrylu ogrzewano w temp. 70 o C przez 30 minut) i analizowano na chromatografie gazowym GC/MS HP-6890 (+)/MSD-5973 firmy Hewlett Packard. Badania przeprowadzono w nastêpuj¹cych warunkach analitycznych i z wykorzystaniem sprzêtu: kolumna HP-5: d³ugoœæ 30 m, œrednica wewnêtrzna 0,25 mm, gruboœæ filmu 0,25 μm, przep³yw 1,7 ml/min, program temperaturowy: izoterma 100 o C 0,5 min; przyrost 15 o C/min do 290 o C, izoterma 290 o C 2 min, czas ca³kowity 15,17 min, dozownik: split 1:80, temp. 250 o C, nastrzyk 1 2 μl, solvent delay 2 min, temperatura linii transferowej 300 o C, skanowanie: m/z. Nie uzyskano jednoznacznych wyników. Otrzymane na chromatogramie piki nie wskazuj¹ jednoznacznie na obecnoœæ morfiny w badanych próbkach. Powodem s¹ zbyt ma³e nawa ki przygotowanych próbek do analizy lub niew³aœciwy dobór warunków analitycznych. Dyskusja W Polsce, zgodnie z Ustaw¹ o ruchu drogowym, obowi¹zuje bezwzglêdny zakaz prowadzenia pojazdów mechanicznych pod wp³ywem œrodków dzia³aj¹cych podobnie do alkoholu (zasada zero tolerancji ). Rozporz¹dzenie Ministra Zdrowia z dnia 11 czerwca 2003 r. (nowelizacja 2004 r.) wskazuje na koniecznoœæ wykonywania badañ na obecnoœæ wymienionych w rozporz¹dzeniu, nastêpuj¹cych œrodków dzia³aj¹cych podobnie do alkoholu: opiaty, amfetamina i jej analogi, kokaina, tetrahydrokannabinole, benzodiazepiny. Dopuszcza siê badania œliny (metod¹ nielaboratoryjn¹ wykorzystuj¹c¹ jednorazowe testy immunochemiczne), krwi i moczu (metoda laboratoryjna). W przypadku wykrywania opiatów w materiale biologicznym substancj¹ oznaczan¹ jest g³ównie morfina, kodeina i glukuronidy morfiny. Praktycznie nie da siê oznaczyæ heroiny ani 6-O-monoacetylomorfiny, gdy 34 PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec) 2008

12 ich okres po³owicznego rozk³adu jest bardzo krótki: dla heroiny wynosi 9 minut, a dla 6-O-monoacetylomorfiny 38 minut. Ujawnienie obecnoœci morfiny i kodeiny w materiale biologicznym, zgodnie z zasad¹ zero tolerancji, mo e poci¹gaæ za sob¹ dalsze czynnoœci prawne wobec badanego kierowcy, w tym mo liwoœæ oskar- enia o przestêpstwo z artyku³u 178a k.k., w przypadku stwierdzenia morfiny we krwi. Z przeprowadzonych badañ wynika, e obecnoœæ morfiny i kodeiny w organizmie nie musi byæ skutkiem za ywania tylko narkotyków opiatowych. Od 12 ochotników nieza ywaj¹cych narkotyków pobrano próbki œliny i moczu. U piêciu osób stwierdzono pozytywne wyniki wstêpnych badañ immunologicznych na zawartoœæ opiatów po zjedzeniu ciastka z makiem. Wyniki w badanych próbkach moczu potwierdzi³y siê w trzech przypadkach i waha³y siê w granicach od 436 ng/m (dom4) do 965 ng/ml (d1m). W próbkach œliny pozytywne wyniki potwierdzi³y siê równie u trzech osób i waha³y siê w granicach od 25 ng/ml (dos1) do 105 ng/ml (d7s1). Próbki w badaniach potwierdzaj¹cych metod¹ GC-MS wykaza³y obecnoœæ morfiny i kodeiny, których iloœciowa zawartoœæ waha³a siê w granicach od 119 ng/ml do 786 ng/ml w przypadku morfiny i od 18 ng/ml do 131 ng/ml dla kodeiny. Wyniki powy szych badañ potwierdzaj¹ istnienie problemu poruszonego w raporcie opracowanym przez Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie Alkoholizm i Narkomania [3] i wskazuj¹ na potrzebê wykonania przez w³aœciwe instytucje naukowo-badawcze dalszych badañ na obecnoœæ morfiny: nie tylko w moczu i œlinie, lecz tak e a raczej przede wszystkim we krwi. W powy szej pracy przeprowadzono równie badania próbek maku pochodz¹cych z trzech Ÿróde³: supermarketu (w oryginalnym opakowaniu, z etykiet¹ producenta), hali handlowej (bez opisu i charakterystyki producenta), bazaru (bez opisu i charakterystyki producenta), tj. prawdopodobnie z prywatnej uprawy. Spo ywanie maku w Polsce w postaci cukierniczych wyrobów (makowce, torty makowe, dro d ówki z makiem) jest bardzo popularne i czêsto wi¹ e siê z tradycjami œwi¹tecznymi. Uprawê maku w Polsce reguluj¹ przepisy Ustawy o przeciwdzia³aniu narkomanii (Ustawa z dnia 29 lipca 2005 r). Uprawa maku wysokomorfinowego mo e byæ prowadzona wy³¹cznie na potrzeby przemys³u farmaceutycznego i nasiennictwa, zaœ maku niskomorfinowego dla celów spo ywczych i nasiennictwa. Makiem niskomorfinowym okreœla siê roœlinê z gatunku mak lekarski nale ¹c¹ do odmiany, w której zawartoœæ morfiny w torebce (makówce) bez nasion, wraz z przylegaj¹c¹ do niej ³odyg¹ o d³ugoœci do 7 cm, wynosi poni ej 0,06% w przeliczeniu na zasadê morfiny i na such¹ masê wymienionych czêœci roœliny. Istnieje ogólne przekonanie, e dojrza³e nasiona maku przeznaczone do celów spo ywczych nie powinny zawieraæ morfiny. W ramach pracy wykonano badania na obecnoœæ morfiny trzech próbek maku spo ywczego, kupionych w ró nych miejscach handlowych. Próbki te wykaza³y obecnoœæ morfiny w iloœci od 5 ng do 178 ng w przeliczeniu na 1 gram nasion. Mo na przypuszczaæ, e morfina jest obecna w drobinach pochodz¹cych z torebek makowych (elementy s³omy makowej), które znajduj¹ siê miêdzy nasionami maku, a które wykazano na zamieszczonych w pracy zdjêciach z oglêdzin mikroskopowych. W zale noœci od iloœci tych drobin mo e jej byæ wiêcej lub mniej. Wnioski 1. Wykrycie morfiny w p³ynach ustrojowych mo e wskazywaæ nie tylko na spo ycie narkotyków opiatowych, lecz tak e na konsumpcjê cukierniczych produktów spo ywczych zawieraj¹cych mak. 2. Problem wykrywania morfiny w moczu po spo yciu ciastka z makiem, poruszony w raporcie opracowanym przez Instytut Psychiatrii i Neurologii w biuletynie Alkoholizm i Narkomania (2006), potwierdzi³ siê w wynikach badañ powy szej pracy i wymaga udokumentowania po przeprowadzeniu dalszych badañ. 3. Problem jest otwarty i stanowi podstawê do dyskusji. ryciny: 1, 2, 4 Internet; 3 [6], 5 [4], 6 19 autorka; tabele: 1 [1], 2 15 autorka BIBLIOGRAFIA 1. Mak, Zd HAr Borowo, IHAR Poznañ Ustawa z dnia 29 lipca 2005 roku o przeciwdzia³aniu narkomanii (Dz.U. Nr 179, poz. 1485) wraz z nowelizacj¹ z dnia 7 grudnia 2006 r. (Dz.U. Nr 7, poz. 48 i 49). 3. Alkoholizm i Narkomania 2006, t. 19, nr 2, s Toksykologia wspó³czesna pod red. Witolda Señczuka, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa Ka³a M.: Analiza toksykologiczna œrodków uzale niaj¹cych, Wyd. IES, Kraków Szukalski B.: Metody analizy œrodków uzale niaj¹cych, Wyd. Instytut Psychiatrii i Neurologii, Warszawa Krawczyk W.: Chromatografia gazowa w kryminalistyce, Wydawnictwo CLK KGP, Warszawa Szukalski B.: Prowadzenie pojazdów pod wp³ywem narkotyków nowe zagro enie, Problemy Kryminalistyki 2006, nr 252, s. 5. PROBLEMY KRYMINALISTYKI 260 (kwiecieñ czerwiec)