Diagnostyka zakażenia HPV metody molekularne

Transkrypt

1 Wirusy ogólna charakterystyka obligatoryjny pasożyt wewnątrzkomórkowy replikacja tylko w żywej, wrażliwej komórce (tropizm)!!! brak enzymów metabolicznych korzysta z energii i mikromolekuł komórki gospodarza enzymy tylko do replikacji polimerazy: DNA, RNA zależna od DNA, DNA zależna od RNA (odwrotna transkryptaza), RNA zależna od RNA wirion pojedyncza kompletna cząstka wirusa, zdolna do zakażenia komórki wirusy defektywne, niekompletne do namnożenia wymagają udziału innego wirusa, np.. HDV z HBV Wirusy - budowa wielkość: nm niewidoczny w mikroskopie świetlnym, tylko elektronowym struktura: * RNA lub DNA - genom, rdzeń; kolisty lub liniowy; jedno- lub dwuniciowy, zakaźny lub niezakaźny * kapsyd (płaszcz) adsorbcja i wnikanie do komórki, z kapsomerów - identyczne jednostki białkowe nukleokapsyd - symetria helikalna(wydłużona) lub ikozahedralna (kulista) * osłonka u helikalnych i niektórych kulistych - adsorpcja do komórki ^ białka wirusowe strukturalne: związane z genomem, kapsydem, osłonką, enzymami ^ enzymy - polimerazy niezbędne do replikacji, jeżeli genom wirusa nie jest czytany przez polimerazy komórki zakażonej, proteazy, endonukleazy, ligazy Osłonka - adsorbcja do komórki wrażliwej glikoproteiny, lipoproteiny... * HIV: gp 120 receptor CD4 limfocytat * wirus grypy: hemaglutynina kwas sialowy na krw. czerwonej lub błonie śluzowej * HBV: Pre-S receptor na hepatocycie Klasyfikacja wirusów homologia kwasu nukleinowego: * wirusy DNA * wirusy RNA cechy kwasu nukleinowego DNA DS, DNA SS, RNA SS+, RNA SS-, RNA DS - typ kwasu wpływa na typ replikacji wygląd, kształt, wielkość symetria nukleokapsydu obecność lub brak osłonki wrażliwość na temperaturę, detergenty, naświetlanie.. niektóre nazwy wirusów pochodzą od nazw chorób, miejsca, gdzie dokonano izolacji, nazwiska odkrywcy, cech epidemiologicznych... Wirusy - replikacja adsorpcja na komórce setki receptorów, po wniknięciu wirusa komórka jest oporna na zakażenie innym wirusem!!! wnikanie endocytoza (pinocytoza, wiropeksja) wirus wpukla się z receptorem. fuzja wirus traci osłonkę (zostaje w błonie kom.), wnika nukleokapsyd. odpłaszczenie, odbiałczenie zostaje sam kwas nukleinowy eklipsa replikacja DNA lub RNA, synteza białek wirusa. zróżnicowana w zależności od kwasu nukleinowego. może zachodzić w jądrze lub cytoplazmie. różne efekty cytopatyczne: ciałka wtrętowe, transformacja (nowotwory), aberracja chromosomów (różyczka wady wrodzone), liza komórki. trwa różnie długi okres zakażenie utrzymujące się (persystentne, latentne) dojrzewanie tworzenie zakaźnego wirionu, nagie wirusy - w jądrze lub cytoplazmie, inne przechodzą przez błonę i tworzą osłonkę uwalnianie - przez pączkowanie wirusy osłonkowe, - liza komórki wirusy nagie Strategie replikacyjne wirusów Namnażanie wirusów jest zależne od rodzaju kwasu nukleinowego, który znajduje się w wirionie. Wirusy zawierające dsdna. Po wniknięciu do komórki wirus rozpoczyna najpierw wytworzenie tzw. "wczesnego mrna" na matrycy DNA pochodzącego z wirionu. Zwykle jednym z genów zawartych w genomie wirusa i odczytywanym poprzez wczesne mrna jest DNA-zależna polimeraza DNA, która dokonuje powielenia wirusowego DNA. Dopiero z takich powielonych cząsteczek DNA następuje produkcja "późnego mrna", kodującego kapsomery

2 oraz inne białka uczestniczące w składaniu wirionów. Wirusy zawierające ssdna - mogą one zawierać w kapsydach zarówno DNA o polarności dodatniej, jak i ujemnej. Charakterystyczną cechą jest pętelka powstała przez zawinięcie końcówki liniowej cząsteczki DNA, która służy jako starter podczas DNA. Sam proces replikacyjny jest stosunkowo skomplikowany i wiąże się z kilkukrotną replikacją materiału genetycznego, który następnie jest rozdzielany na nici i cięty za pomocą nukleaz. Wirusy ssrna o dodatniej polarności - po wniknięciu wirusa do komórki następuje produkcja białek bezpośrednio z genomowego RNA, który może w tym wypadku pełnić rolę mrna. W pewnym momencie rozwoju, gdy wytworzone zostaną odpowiednie białka, następuje powstanie dwuniciowej formy pośredniej RNA, która składa się zarówno z macierzystej nici o dodatniej polarności, jak i z nici o polarności ujemnej. Ta właśnie nić jest matrycą dla produkcji wielu kopii genomowego ssrna(+). Wirusy ssrna o ujemnej polarności - w ich przypadku musi najpierw dojść do stworzenia kopii o charakterze mrna (czyli RNA o dodatniej polarności), a następnie z tych kopii są produkowane białka. Powstaje też dwuniciowa forma pośrednia, której nić RNA(+) służy do powstania licznych genomów RNA(-) Retrowirusy Synteza kwasów nukleinowych u retrowirusów jest dosyć skomplikowana, ale jej kluczowym etapem jest zawsze przepisanie wirusowego RNA na DNA za pomocą obecnej w wirionie odwrotnej transkryptazy. Powstały w ten sposób ssdna jest uzupełniany o drugą nić, zaś nowo utworzony dsdna wbudowuje się w genom gospodarza, stanowiąc tzw. prowirus. DNA prowirusa służy zarówno do wytworzenia mrna dla białek wirusowych, jak i dla wytworzenia potomnych genomów RNA. Wirusy DNA Poxviridae: Variola - ospa prawdziwa Vaccinia krowianka Adenoviridae adenowirusy, wiele serotypów zap. gardła, spojówek, żołądka, jelit Papovaviridae: Human papilloma virus HPV brodawki (typy 6,11,16,18 dysplazja) Parvoviridae: Parvovirus typ B 19 zap. żołądka i jelit, rumień zakaźny Hepadnaviridae: HBV zapalenie wątroby typu B Herpesviridae H.simplex opryszczka (zak. latentne) HSV-1 (oralny) HSV 2 (genitalny) Varicella-zoster VZV - ospa wietrzna, półpasiec Cytomegalovirus CMV - cytomegalia Epstein-Barr EBV monoukleoza zakaźna, chłoniaki, rak jamy nosowo-gardłowej Human Herpes typy 6,7,8 limfotropowe, w AIDS Wirusy RNA Orthomyxoviridae: Influenza A, B, C ( łagodne) grypa Paramyxoviridae: Parainfluenza zap.gardła, krtani, oskrzeli, płuc Mumps świnka Measles odra Respiratory syncytial v. RSV zap.płuc u małych dzieci Picornaviridae: grupa enterowirusów Polio, Coxsackie A, B, Echo zak.oun, m.serc. bł.śl. Hepatitis A virus HAV - zap. wątroby Rhinovirus ponad 100 serotypów, przeziębienia Coronaviridae: - Coronavirus przeziębienia, SARS Rhabdoviridae: Lyssavirus wścieklizna Retroviridae: Human immunodeficiency virus HIV 1, 2 ARC, AIDS Human Tcell lymphotropic virus HTLV 1, 2 białaczki Togaviridae: Rubella virus - różyczka Reoviridae: Rotavirus biegunki u małych dzieci Filoviridae: wirusy Marburg, Ebola gorączki krwotoczne Bunyaviridae: wirus Hantan Calciviridae: wirus Norwalk Flaviviridae: żółta febra, Dengue, kleszczowe zap. mózgu inne: HCV, HDV, HEV arbowirusy przenoszone przez kleszcze, komary, należą do różnych rodzin Wirusy wrażliwość na czynniki fizyczne i chemiczne większość jest inaktywowana w C, 30 min. nie HBV, papovavirusy (HPV), priony niskie temperatury stabilne

3 wysuszenie różnie eter, chloroform otoczkowe wrażliwe (HSV) środki dezynfekujące: związki chloru, glutaraldehyd antybiotyki przeciwbakteryjne - niewrażliwe Izolacja i identyfikacja wirusa wady: trwa kilka dni, tygodni, droga hodowle komórkowe: zarodki ptasie wrażliwe zwierzęta!!! ostateczna identyfikacja: odczyny serologiczne test neutralizacji - NT wiązania dopełniacza - OWD immunofluorescencji - IF zahamowania hemaglutynacji Elisa techniki molekularne - PCR, RT-PCR, inne Izolacja hodowle komórkowe pierwotne nabłonki, fibroblasty, kom. zarodka - kilka pasaży linie komórkowe fibroblasty mysie, ludzkie, pasaży hodowle ciągłe (ustalone) kom. nowotworowe: HeLa, Hep-2 Różne wirusy mają różny tropizm do komórek hodowle komórkowe - obserwowane zmiany: * efekt cytopatyczny Polio, Adeno, HSV, CMV, VZV, RSV * efekt łysinkowy - Polio * hemaglutynacja Influenza * hemadsorpcja -Parainfluenza Izolacja wirusa zarodki ptasie 9-15 dni: * woreczek żółtkowy chlamydie, riketsje * błona kosmówkowo-omoczniowa - Herpes, ospa * jama owodni, jama omoczni grypa (odczyn hemaglutynacji) Izolacja wirusa wrażliwe zwierzęta * myszy, oseski mysie (Coxackie, wścieklizna), * chomiki (arbowirusy), * małpy (wirus żółtej febry) * świnki, króliki Bakteriofagi wirusy związane z Procaryota struktura: strzykawko -podobna (ogonek i główka) wiążąca się do receptorów na powierzchni komórki, następnie wstrzykiwana do komórki fagi lityczne produkują liczne kopie zabijające komórki, w efekcie liza komórki bakteryjnej profagi w komórce dają stan lizogenii, replikacja kwasu nukleinowego faga następuje z replikacją DNA komórki * bakterie lizogenne = noszące profaga, może on warunkować produkcję np. toksyny błoniczej * stan lizogenii może przejść w stan lizy *wrażliwość bakterii na bakteriofagi wykorzystywana jest do typowania bakterii Diagnostyka zakażeń wirusowych większość zakażeń charakterystyczne objawy badania wirusologiczne - cel: - określenie czynnika etiologicznego tylko niektórych zakażeń hepatitis, meningitis, biegunki - epidemiologia, ustalenie typów szczepionkowych np. grypa - znaczenie rokownicze HBV, HCV - ale nie celowane leczenie (bakterie, grzyby)

4 Diagnostyka zakażeń wirusowych - metody bezpośrednie: izolacja i identyfikacja wirusa metoda referencyjna dla wszystkich innych metod gold standard!!! wykazanie antygenów wirusowych w materiałach klinicznych * metody mikroskopowe * metody immunologiczne * metody genetyczne pośrednie: diagnostyka serologiczna wykrycie swoistych przeciwciał w surowicy krwi Bezpośrednie wykazanie wirusa w materiale ciałka wtrętowe (mikroskop świetlny) - wścieklizna, HSV, CMV, ospa, odra cząstki wirusa (mikroskop elektronowy) - w kale Rota, Norwalk, HAV, Ebola, w moczu CMV, węzły chłonne HIV, płyn mózg. rdz. Herpes, Mumps wykrywanie antygenów wirusowych lub składników strukturalnych (białka, geny) * metody immunologiczne z użyciem przeciwciał monoklonalnych - immunofluorescencja IF (mikroskop fluorescencyjny) - wścieklizna, grypa, odra, HSV, VZV, CMV, adenowirusy, ospa - testy immunoenzymatyczne Elisa HBV, HAV, RSV,CMV - aglutynacja lateksowa Rotavirus w kale - western blot HIV * techniki molekularne - hybrydyzacja in situ sondy genetyczne radioaktywne i nieradioaktywne - CMV, HPV,HSV - PCR wykrycie HCV-RNA - RT-PCR - różne Grypa- zakażenie drogą kropelkową uogólnione!! Influenza virus A, B, C glikoproteiny: * hemaglutynina H (wniknięcie do komórki) * neuraminidaza N (uwolnienie potomnych wirionów) duża zmienność: * antigenic drift (A, B) - przesunięcie antygenowe, niewielkie, ogniska zakażenia z powodu braku odporności w populacji co kilka lat * antigenic shift (A) skok antygenowy, wymiana całego segmentu RNA, nowy podtyp, pandemie: 1918 H1 N H2 N H3 N H1 N H5 N1 ptasia grypa 2009 A/H1N1 szczepionka: typ A (H1 N1, H3 N2), typ B Grypa - diagnostyka cel: wykrycie typu wirusa przygotowania dobrej szczepionki * materiał: wymaz, popłuczyny z jamy nosowo-gardłowej * izolacja wirusa: ^ 9-13 dniowy zarodek kurzy jama omoczniowa, inkubacja 2-3 dni, aglutynacja krwinek kurzych, typ wirusa - OZH, OWD, PCR ^ hodowla komórkowa z nerki psa jw. * wykrycie antygenu w błonie śluzowej nosa szybkie testy, weryfikacja - metody genetyczne Wścieklizna choroba śmiertelna wirus wścieklizny RNA SS- neurotropowy rezerwuar: dzikie zwierzęta lis, pies, nietoperze, nie ma w Japonii, W.Brytanii wydalany jest ze śliną zakażenie: po ugryzieniu, oślinieniu, wdychaniu zakażonego aerozolu (jaskinie nietoperze wampiry) powinowactwo tkanka mózgowa, transport drogą nerwów, tygodnie 2 lata szczepionka!!! skuteczna, jeżeli okres inkubacji wynosi > 30 dni diagnostyka badanie zwierzęcia!!! zakłady higieny weterynaryjnej * obserwacja zwierzęcia przez 10 dni brak objawów, nie ma obawy

5 * badanie głowy zwierzęcia wykrycie w tk. mózgowej ciałek Negriego IF, PCR * zwierzę żywe izolacja wirusa ze śliny zakażenie domózgowo myszy szczepionka - inaktywowana hodowana na diploidalnych komórkach ludzkich Wirusowe zapalenia wątroby HAV droga fekalno-oralna, najczęściej 7-10, lat, wirus w kale, IgM w surowicy, objawy ostre, niski poziom higieny, zagęszczenie, szczepionka Havrix A HBV (DNA) parenteralna, seksualna, perinatalna, narkotyki, różne markery, objawy ostre lub przewlekle, szczepionka Engerix B HCV nona-nonb, parenteralna, narkotyki, objawy poronne, przewlekłe, IgG, RNA - PCR, brak szczepionki, problem!!! HDV czynnik delta, parenteralna, narkotyki, objawy ostre, na ogół razem z HBV HEV- fekalno-oralna, objawy ostre, zanieczyszczona woda HFV, HGV Prion proteinaceus infectious particle lub virion Prusiner 1981 nazwa nowej klasy patogenów: białko zakaźne odpowiedzialne za powolne choroby zwyrodnieniowe mózgu: kuru drżenie, spożywanie mózgu zmarłych (forma rytualnego kanibalizmu, plemię Fore, Papua, Nowa Gwinea choroba Creutzfelda-Jacoba scrapie swędzenie, ocieranie, wyrywanie wełny, owce i kozy BSE bovine spongiform encephalopathy (bydlęca encefalopatia gąbczasta), choroba wściekłych krów encefalopatia norek, jeleni, łosi.. Priony - charakterystyka białko PrP-sc zakaźne białko oporne na trawienie proteazami oporne na promieniowanie UV nie wzbudza żadnego typu reakcji immunologicznej powstają zmiany w mózgu wirus brodawczaka ludzkiego (HPV) szeroko rozpowszechniony, ponad 100 typów, większość nieszkodliwa, około 30 typów jest odpowiedzialnych za infekcje narządów moczowopłciowych kobiet i mężczyzn na całym świecie około 630 milionów ludzi jest zakażonych HPV około 50% aktywnych seksualnie kobiet i mężczyzn zostaje zakażona większość kobiet 80% - zostaje zakażona przed ukończeniem 50 roku życia zakażenie HPV najbardziej rozpowszechnione jest w wieku lat, większość przebiega bezobjawowo i ustępuje samoistnie w ciągu 1-2 lat dzięki naturalnej odpowiedzi immunologicznej organizmu do transmisji wirusa może dojść nawet, gdy brak objawów zakażenia (brodawki lub inne widoczne zmiany) HPV wysokiego ryzyka - typy 16, 18, 31 i 45 (31, 33, 35, 35, 39, 40, 43, 51, 52, 53, 54, 55, 56 i 58 - umiarkowanego ryzyka), jeśli przetrwają rozwój raka szyjki macicy lub innych nowotworów narządów moczowo-płciowych, HPV 16 i 18 są odpowiedzialne za około 70% przypadków raka szyjki macicy HPV niskiego ryzyka - 6 i 11, 42, 43, 44 - odpowiedzialne za około 90% przypadków brodawek (kłykciny kończyste) narządów moczowo-płciowych bez cech nowotworzenia HPV wysokiego i niskiego ryzyka mogą powodować nieprawidłowe wyniki badania cytologicznego szczepionka (Silgard,, Gardasil, typy 6, 11, 16 i 18, Cervarix - 16, 18) (100% skuteczność przeciw HPV 16 i 18, może chronić przed HPV 31 i 45, odpowiedzialnych za powstawanie kolejnych 8-9% przypadków raka szyjki macicy. szczepionka może chronić kobiety zakażone jednym typem wirusa przed zakażeniem pozostałymi jego typami, najlepsza skuteczność u dziewczynek szczepionką nie można leczyć już istniejących brodawek płciowych albo rozwijającego się raka szyjki macicy Genom wirusa tworzą geny wczesne (E, early) oraz późne (L, late) późne geny L1 i L2 są odpowiedzialne za syntezę białek otoczki wczesne geny E1 i E2 odpowiadają za replikację genomu HPV onkoproteiny E5, E6 i E7 biorą udział w procesie nowotworzenia białko E4 umożliwia interakcję z keratynami, co daje widoczny efekt w postaci zmian brodawkowych. Diagnostyka zakażenia HPV metody molekularne

6 * wykrywające DNA HPV w rozmazie z szyjki macicy - PCR Amplicor - test dwustopniowy: 1. (+) lub (-), 2. - poszczególne typy onkogenne - amplifikacja + hybrydyzacja (odczyt na pasku membrany nitrocelulozowej INNO-LiPa HPV: 6,11,16,18,31,33,40,45,51,53,54,58,59,66,68,70 - hybrydyzacja in situ w preparatach cytologicznych * oznaczanie transkryptów mrna białek E6/7 (NucliSens HPV) Leczenie zakażenia HPV? nie ma leków anty-wirusowych leczenie objawowe Zapobieganie zakażeniom HPV ograniczenie liczby partnerów seksualnych używanie prezerwatyw, ale nie w 100% unikanie kontaktów seksualnych z osobami zakażonymi cytologia u kobiet