This copy is for personal use only - distribution prohibited.

Transkrypt

1 244 Pol. Przegląd Otorynolaryngol 2012; 3 (1): Występowanie i rola aktywnej infekcji wirusem brodawczaka ludzkiego (HPV) w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi Pevalence of active HPV infection in head and neck cancer patients Paweł Golusiński 1, Katarzyna Lamperska 2, Boudewijn JM Braakhuis 3, Peter JF Snijders 4, Jakub Pazdrowski 1, Piotr Pieńkowski 1, Łukasz Łuczewski 1, Wojciech Golusiński 1 SUMMARY HPV, mainly HPV type 16 and to a lesser extent type 18, is a newly identified causal factor for SCCHN. The association between HPV and SCCHN is strongest for cancers of the tonsil, intermediate for the rest of the oropharynx, and weakest for the oral cavity and larynx. However, The prevalence of HPV in SCCHN in Poland reported in the literature varies from 0 72% One of the reasons of such a different results may be in our opinion method-related false positive results. The aim of the study, was the assessment of HPV prevalence in the head and neck cancer patients in polish population of SCCHN patients. The material comprised of tumor tissue obtained from 50 HNSCC patients with a primary tumor in the oral cavity, oropharynx or larynx, who were scheduled for surgical treatment. For all cases algorithm was performed: First p16 immunostaining was conducted and secondly the HPV DNA has been detected with the use of HPV DNA general primer (GP)5+/6+ PCR, followed by RLB hybridization. In 8% of cases the staining was observed in 50% of cancer cells or more. There was no HPV DNA detected in any case. There was no HPV DNA detected in any case, which may indicate the lower HPV prevalence in polish population than in Western Europe and US and smoking and drinking associated carcinogenesis. The p16 expression has been found in 8% of the patients and supplementary (GP)5+/6+ PCR did not detect the presence of HPV DNA. Thus, the p16 immunostaining is of limited use as a sole method of HPV detection and needs to be complemented by other techniques. Hasła indeksowe: rak płaskonabłonkowy głowy i szyi, wirus brodawczaka ludzkiego, czynniki ryzyka Key words: Head and neck cancer, Human papilloma virus, Casual risk factors Wykaz skrótów: Białko E (early) białko wczesne Białko L (late) białko późne CTRL (control) kontrola DNA (Deoxyribonucleic Acid) kwas deoksyrybonukleinowy DNA PK (DNA Protein Kinase) kinaza białkowa DNA E2F (eucariotic factor) eukariotyczny czynnik transkrypcyjny EIA (enzyme immuno assay) enzymatyczny test immunologiczny ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) test immunoenzymosorbcyjny GP5+/6+PCR (general primer PCR) PCR z zastosowaniem uniwersalnych starterów HNSCC (Head Neck Squamous Cell Carcinoma) rak płaskonabłonkowy głowy i szyi by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów Chirurgów Głowy i Szyi Otrzymano/Received: Zaakceptowano do druku/accepted: Oddział Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii Laryngologicznej, Wielkopolskie Centrum Onkologii Poznań Ordynator: Prof. Wojciech Golusiński 2 Zakład Immunologii Nowotworów, Wielkopolskie Centrum Onkologii Poznań 3 Department of Otolaryngology/Head-Neck Surgery, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands 4 Department of Pathology, VU University Medical Center, Amsterdam, The Netherlands Wkład pracy autorów/authors contribution: Wg kolejności Konflikt interesu/conflicts of interest: Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów. Adres do korespondencji/ Address for correspondence: imię i nazwisko: dr n. med. Paweł Golusinski adres pocztowy: Wielkopolskie Centrum Onkologii Oddział Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii Laryngologicznej ul. Garbary Poznań pawel.golusinski@wco.pl HPV (Human Papilloma Virus) wirus brodawczaka ludzkiego IGG immunoglobulina G ISH (In Situ Hybrydisation) hybrydyzacja in situ LCR (Long Control Region) region regulatorowy mrna (Messenger RNA) matrycowy RNA OD (Optical Density) gęstość optyczna PCR (Polymorphism chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy RNA (Ribonucleic Acid) kwas rybonukleinowy RLB (Reverse Line Blot) hybrydyzacja typu reverse line RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) PCR odwrotnej transkryptazy SPF PCR (short fragment PCR) PCR krótkich fragmentów

2 Tabela I. Rozpoznanie histopatologiczne i stopień dojrzałości nowotworu Table I. Histopathological diagnosis of cancer and degree of maturity Rozpoznanie Wstęp Stopień dojrzałości G Raki płaskonabłonkowe głowy i szyi stanowią heterogenną grupę nowotworów. Rozwijają się w różnych lokalizacjach pierwotnych, ale związane są ze wspólnymi czynnikami ryzyka i wykazują podobne cechy patologiczne. Rocznie na świecie rozpoznaje się około nowych zachorowań na nowotwory głowy i szyi, co stanowi ok. 6% wszystkich nowotworów złośliwych. W ciągu ostatnich dwudziestu lat odnotowano nieznaczny spadek ogólnej liczby zachorowań na raka głowy i szyi, w szczególności raka krtani [1]. Jednocześnie w Europie i Stanach Zjednoczonych obserwuje się stały wzrost zachorowań na raka zlokalizowanego w obrębie jamy ustnej i gardła środkowego. Dotyczy to przede wszystkim chorych poniżej 40. roku życia [2, 3]. Spożywanie wysokoprocentowych napojów alkoholowych oraz palenie tytoniu uważa się za podstawowe czynniki ryzyka rozwoju raka głowy i szyi. Około 75% wszystkich raków tego regionu związanych jest z występowaniem obu tych czynników. W ostatnich latach podkreśla się znaczącą rolę ludzkiego wirusa brodawczaka (HPV) w patogenezie raka płaskonabłonkowego głowy i szyi [4]. Około 25% przypadków zachorowań na te nowotwory zawiera genomowe DNA onkogennych podtypów HPV, a zwłaszcza HPV16 oraz w mniejszym stopniu HPV18 [5]. Najsilniejszy związek z wirusem HPV wykazują raki zlokalizowane w obrębie gardła środkowego, a zwłaszcza N G1 G2 G3 Carcinoma planoepitheliale keratodes Carcinoma planoepitheliale akeratodes Carcinoma planoepitheliale partim keratodes Razem Tabela II. Klasyfikacja TNM Table II. TNM clasyfication Lokalizacja TNM T N M N T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 M Jama ustna Gardło środkowe Krtań RAZEM migdałka podniebiennego. W jamie ustnej oraz krtani onkogenne HPV występują ze zdecydowanie mniejszą częstotliwością [6]. Raki związane z występowaniem wirusa HPV obserwuje się częściej u osób niepalących tytoniu i nienadużywających alkoholu. Histologicznie charakteryzują się one niskim stopniem dojrzałości oraz utkaniem przypominającym typ carcinoma basaloides [7]. W literaturze oraz w praktyce klinicznej terminem rak płaskonabłonkowy głowy i szyi określa się grupę nowotworów o różnej lokalizacji. Podobne utkanie histologiczne, lokalizacja guza oraz stopień zaawansowania klinicznego stanowią najczęściej stosowane kryteria dla celów zarówno projektowania badań klinicznych, jak i opracowywania standardowych strategii leczenia czy też prognozowania przeżywalności. Badania ostatnich lat dowodzą jednak, iż w obrębie grupy guzów, jednorodnej pod względem wszystkich wyżej wymienionych cech, najważniejszym kryterium zdaje się być czynnik etiologiczny, prowadzący do inicjacji procesu nowotworzenia. Jest to bardzo istotny problem, ponieważ grupy nowotworów o różnej etiologii są heterogenne również pod względem epidemiologicznym, klinicznym, a nawet prognostycznym. Proces kancerogenezy wywołany poprzez infekcję onkogennym wirusem HPV różni się znacząco od spowodowanego paleniem tytoniu i spożywaniem napojów alkoholowych. Niektórzy autorzy mówią nawet o istnieniu alternatywnego modelu kancerogenezy [8, 9]. 245

3 246 W rakach głowy i szyi wywoływanych przez infekcję HPV dochodzi do zakłócania mechanizmów komórkowych związanych z białkami p53 i prb należących do najważniejszych regulatorów cyklu komórkowego. Raki płaskonabłonkowe, w których stwierdzono związek z onkogennymi typami wirusa HPV, wydają się występować częściej u młodszych chorych, głównie płci męskiej. Gardło środkowe, gdzie raki HPV-zależne stanowią 40 60% wszystkich nowotworów, jest najbardziej uprzywilejowaną lokalizacją. Mimo iż w większości przypadków są to nowotwory o niskim stopniu dojrzałości, wydają się one lepiej poddawać leczeniu, przez co charakteryzują się lepszym rokowaniem niż raki niezwiązane z HPV [10]. Celem pracy było poszukiwanie aktywnej infekcji wirusem HPV16 w rakach głowy i szyi z zastosowaniem algorytmu: badanie immunohistochemiczne dla p16 z następowym badaniem GP5+/6+-PCR. Materiał i metody Przedmiotem badań była tkanka nowotworowa pochodząca od 50 chorych na raka płaskonabłonkowego regionu głowy i szyi leczonych na Oddziale Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii Laryngologicznej Wielkopolskiego Centrum Onkologii w Poznaniu w latach Wszyscy chorzy poddani zostali pierwotnemu leczeniu chirurgicznemu bądź leczeniu chirurgicznemu uzupełnionemu o radioterapię. Wiek chorych mieścił się w przedziale od 36 do 80 lat w chwili rozpoznania choroby. Średnio wynosił 60,06 roku (SD 12,4; mediana 58,5).W badanej grupie chorych było 36 mężczyzn (75%) i 12 kobiet (25%). Jako kryteria wyłączające z badania przyjęto wznowy nowotworu, ogniska będące drugimi pierwotnymi nowotworami, a także guzy leczone pierwotną radioterapią. Chorzy, u których zabieg operacyjny stanowił uzupełnienie nieradykalnego zabiegu pierwotnego, cytoredukcję guza lub zabiegi chirurgii ratującej również nie kwalifikowali się do niniejszej analizy. Rozpoznanie histopatologiczne, stopień dojrzałości nowotworu oraz TNM przedstawiają odpowiednio tabele I i II. Materiał tkankowy bezpośrednio po wykonaniu zabiegu operacyjnego dzielono na dwie części. Jedną, przeznaczoną do oceny histopatologicznej oraz badań immunohistochemicznych, utrwalano w buforowanej 0,1 M buforem fosforanowym o ph 7,4 4% formalinie. Drugą część materiału, przeznaczoną do badań genetycznych, niezwłocznie zamrażano i przechowywano w temperaturze -80. Ekspresja p16 w tkankach nowotworowych Do oznaczenia p16ink4a w skrócie p16 użyto zestawu CINtec TM Histology Kit (DakoCytomation), postępując kolejno zgodnie z zaleceniami producenta. Kontrolę negatywną stanowił skrawek wybarwiony z zastosowaniem mysich przeciwciał IgG. Za kontrolę pozytywną służył skrawek z raka szyjki macicy z ekspresją p16. Preparaty oceniano pod względem ilości wybarwionych komórek i intensywności wybarwienia. Za pozytywne uznawano przypadki, w których ciemno brązowe wybarwienie wykazywało co najmniej 50% komórek nowotworowych. Brano pod uwagę zarówno wybarwienie w obrębie jądra komórkowego, jak i cytoplazmy (Ryc. 1). DNA izolowano z mrożonej tkanki nowotworowej przy użyciu zestawu Wizard Genomic Purification Kit (Promega). W celu oceny jakości i ilości DNA izolowanego z tkanki guza przeprowadzano amplifikację DNA b-globiny, stosując swoisty PCR oraz elektroforezę w żelu agarozowym. Poszukiwanie infekcji onkogennymi typami wirusa HPV Obecność DNA wirusowego w tkankach badano z zastosowaniem techniki general primer GP5+/6+ PCR z użyciem 50 ng DNA (ilość określona w stosunku do zestawu Picogreen dsdna assay kit Invitrogen, Breda, Holandia). Za kontrole pozytywne służyły10 ng, 1 ng, 100 pg roztworu DNA pochodzące z linii komórkowych raka szyjki macicy SiHa (zawierające od 1 do 2 kopii HPV16 na komórkę), a za negatywne, reakcje przeprowadzone równolegle bez DNA. Produkty PCR poddawano następnie hybrydyzacji z dwoma koktajlami znaczników oligonukleotydowych specyficznych dla wirusów HPV wysokiego ryzyka: HPV typ 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 oraz niskiego ryzyka: 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 55, 57, 61, 70, 71, 72, 81, 83, 84. Detekcję hybryd przeprowadzono przy zastosowaniu techniki immunoenzymatycznej EIA (enzyme immunoassay) opisanej poprzednio [11]. Wyniki Ekspresja p16 w tkankach nowotworowych Badania immunohistochemiczne 50 guzów wykazały w 16 przypadkach (8%) intensywne wybarwienie powyżej 50% komórek nowotworowych. W 8 przypadkach (4%) stwierdzono średnio intensywne wybarwienie do 10% komórek nowotworowych, które zgodnie z zaleceniami dostępnymi w piśmiennictwie uznano za wynik negatywny. W pozostałych przypadkach nie odnotowano ekspresji p16. Wyniki EIA Interpretacja wyników EIA i kalkulacja poziomu odcięcia wartości OD wyniki GP5+/6+ EIA można uznać za prawidłowe i miarodajne, jeśli spełnione są następujące warunki: 1. Wszystkie kontrole negatywne wykazują wartości OD 405nm <0,1.

4 2. Kontrole pozytywne PCR o niskim stężeniu (np. SiHa 100 pg) wykazują wartości równe lub nieznacznie wyższe od poziomu odcięcia, a kontrole o wysokim stężeniu (np. SiHa 1 ng) wartości wyraźnie wyższe. 3. Wartość OD 405nm dla kontroli pozytywnej EIA jest większa od 0,5. Kalkulację wartości poziomu odcięcia (cut-off level), przeprowadzono w oparciu o poniższy algorytm: Wartość poziomu odcięcia = 3x ctrl1+ctrl2+ctrl3+ctrl4 Poziom odcięcia wartości OD dla badanego materiału ustalono na poziomie 0,1965. W badanym materiale wartość OD w żadnym z przypadków nie osiągnęła poziomu równego lub większego od 0,1965, co stanowi konieczny warunek pozwalający uznać daną próbę za pozytywną w kierunku nosicielstwa DNA onkogennego typu wirusa HPV. Omówienie Udowodniono, że obecność DNA onkogennych typów wirusa HPV jest związana z pewną określoną grupą raków płaskonabłonkowych regionu głowy i szyi. Hobbs i wsp. [6] w swojej metaanalizie w sposób kompleksowy Ryc. 1. Ekspresja p16 w co najmniej 50% komórek nowotworowych Fig. 1. p16 expression more than 50% cells positive 4 analizują dostępnych w piśmiennictwie 20 różnych doniesień dotyczących występowania wirusa HPV w rakach płaskonabłonkowych głowy i szyi. Wyniki uzyskiwane przez różnych badaczy wynosiły od 0% do 86% HPV-pozytywnych prób. Badania dotyczyły jednak różnych lokalizacji charakteryzujących się różnym stopniem predyspozycji do występowania wirusa. Wśród chorych na raka płaskonabłonkowego krtani najniższy odsetek raków związanych z występowaniem wirusowego DNA 3% opisał na materiale 37 chorych Dillner i wsp. [12], natomiast najwyższy, bo aż 36%, Dahlstrom i wsp. [13]. W obu przypadkach celem detekcji wirusa zastosowano technikę ELISA specyficzną dla L1 HPV16, a materiałem do badań była surowica krwi. Chen i wsp. [14] przy zastosowaniu PGMY09/ MY11 PCR wykazali obecność wirusa w komórkach nowotworowych u 86% chorych na raka jamy ustnej. Zdecydowanie najczęściej jednak opisuje się występowanie wirusa DNA w obrębie gardła środkowego. Większość autorów wskazuje tutaj występowanie wirusa w około 50% badanych guzów [15 17]. W badanym materiale nie odnotowano obecności aktywnego transkrypcyjnie wirusowego DNA w żadnym przypadku. Nowotwory gardła środkowego stanowiły jednak zaledwie 20% materiału o stosunkowo niewielkiej liczebności. Porównywanie wielu badań ma jednak zasadniczą wadę. Istnieje duża różnorodność zastosowanych 247

5 248 technik charakteryzujących się określoną czułością i specyficznością. Obecnie stosuje się szereg technik pozwalających na wykrywanie infekcji w badanym materiale. Techniki oparte na PCR różnią się od siebie czułością i specyficznością [18]. Większość z nich, przy zastosowaniu zaprojektowanych zestawów starterów, pozwala na identyfikację różnych genotypów wirusowych. Do systemów o najwyższej czułości należą Amplicor [19] oraz SPF10 [20]. GP5+/6+ [21] i PGMY [22] cechuje nieco mniejsza czułość. Według Gravitt i wsp. [22], GP5+/6+ charakteryzuje się jednak większą heterogennością niż SPF10 i PGMY09/11, co pozwala na wykrywanie infekcji wirusami HPV różnych typów zachodzącej jednocześnie. Innym popularnym sposobem detekcji wirusowego DNA są techniki oparte na hybrydyzacji DNA z odpowiednio wyznakowanymi znacznikami RNA. Należą tu techniki, takie jak Hybrid Capture I i Hybrid Capture II [23]. Przewaga technik ISH (in situ hybrydization) nad technikami opartymi na metodach PCR wiąże się z biologicznym mechanizmem kancerogenezy wywołanej przez wirusa. Odsetek wirusowego DNA, wykrywany u chorych na raka płaskonabłonkowego szyi technikami PCR, waha się w przedziale od 0% do 100%. Według Westra i wsp [24]. spowodowane jest to wykrywaniem DNA wirusowego zarówno w formie aktywnej, jak i w formie nieistotnej biologicznie. Braakhuis i wsp. [25], badając 143 chorych na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, stwierdzili obecność wirusowego DNA u około 17% badanych. Jednak zaledwie u połowy z nich stwierdzono obecność E6/E7 mrna stanowiącego o aktywności transkrypcyjnej wirusa, a więc jego faktycznym udziale w procesie kancerogenezy. W niniejszej pracy jednym z celów było określenie obecności wirusowego DNA w populacji 50 chorych na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi, pochodzącego z różnych lokalizacji. W tym celu zastosowano protokół opisany przez Snijdersa i wsp. [26]. Najpierw stosowano technikę GP5+/GP6+ PCR, następnie hybrydyzację produktów DNA z dwoma koktajlami oligonukleotydowych znaczników. Do odczytu wyników użyta była metoda immunoenzymatyczna EIA. Ten etap nie nastąpił w przedstawianej pracy ze względu na brak uzyskania produktów PCR. Technika wymaga zestawu starterów zaprojektowanych celem amplifikacji otwartej ramki odczytu w obrębie genu L1. Metoda ta pozwala wykryć za pomocą jednego badania 44 typy wirusa. Ponadto, ze względu na zastosowanie hybrydyzacji, pozwala wykazać faktycznie aktywną infekcję będącą bezpośrednią przyczyną choroby nowotworowej. Z punktu widzenia klinicznego najważniejsze jest zastosowanie technik diagnostycznych, które w sposób szybki, wydajny, a także uzasadniony ekonomicznie pozwolą stwierdzić obecność aktywnej infekcji onkogennym typem wirusa HPV, uruchamiającej proces kancerogenezy. Metoda taka powinna wykrywać obecność genomu onkogennego wirusa w jądrze komórkowym komórki nabłonka lub wykazać ekspresję onkoprotein wirusowych E6/E7 [27]. Badanie immunohistochemiczne ekspresji białka p16 spełnia powyższe kryteria, a ponadto umożliwia analizę materiału utrwalonego w parafinie. Wybarwienie komórek nowotworowych z zastosowaniem odpowiednich przeciwciał anty-p16 może stanowić marker ekspresji onkoproteiny wirusowej E7 [28]. Jest to możliwe, gdyż E7, inaktywując produkt genu Rb, jednocześnie zwiększa poziom p16, co pozwala na jego wykrycie technikami immunohistochemicznymi. W badanym materiale stwierdzono wybarwienie p16 przynajmniej 50% komórek nowotworowych w 8% (u 4 chorych). W 4% wybarwienie dotyczyło mniej niż 10% komórek nowotworowych i było mało intensywne. Westra i wsp. [24] oraz Klaes i wsp. [29] uważają, że tylko intensywne wybarwienie większości komórek nowotworowych może świadczyć o ekspresji onkoproteiny E7 i aktywnej infekcji HPV. W badanym materiale podane kryteria spełnia wyłącznie 4 chorych, co w zestawieniu z informacją o braku infekcji HPV uzyskaną techniką PCR potwierdza wysoką czułość techniki immunohistochemicznej jako metody przesiewowej. Smeets i wsp. [30] potwierdzili, że technika ta charakteryzuje się 100% czułością, ze względu jednak na specyficzność na poziomie 79% wymaga ona uzupełnienia. W ostatnich latach wiele badań zostało poświęconych różnicom w rozpowszechnieniu wirusa HPV jako czynnika ryzyka rozwoju raka płaskonabłonkowego głowy i szyi w zależności od lokalizacji geograficznej. Kreimer i wsp. [5] przeanalizowali pozycje dostępne w piśmiennictwie dotyczące rozpowszechnienia onkogennych typów wirusa HPV na świecie, opublikowane w latach Udowodniono, że migdałek podniebienny oraz nasada języka, znajdujące się w obrębie gardła środkowego, są lokalizacjami anatomicznymi, gdzie odsetek guzów związanych z infekcją HPV jest największy [5, 6] i wynosi 35,6%. Herrero i wsp. [31] na podstawie międzynarodowego, wieloośrodkowego badania porównawczego przypadków podają, że udział ten jest mniejszy i wynosi 18,3%. Parkin i Bray [32], którzy jako dodatkowe kryterium postawili obecność przeciwciał przeciwko onkoproteinom wirusowym E6/E7 w surowicy, dowodzą natomiast, że wśród raków gardła środkowego nie więcej niż 12% ma potencjalnie związek z infekcją wirusową. Zupełnie inne dane przedstwiają Fakhry i wsp., jako wyniki wieloośrodkowego prospektywnego programu badawczego przeprowadzonego w Stanach Zjednoczonych [33]. Uważają oni, że nawet 63% wszystkich guzów gardła środkowego jest związanych z HPV. Tak odmienne dane w piśmiennictwie, nawet po uwzględnieniu pewnych różnic metodologicznych, wydają się być dowodem na różne rozpowszechnienie wirusa w określonych lokalizacjach geograficznych. Z analizy Kreimera i wsp. wynika, że w Ameryce Północnej 47% raków gardła środkowego ma

6 związek z wirusem, w Azji 46%, w Ameryce Środkowej, Południowej, Afryce i Australii 36%, a w Europie 26%. W samej tylko Europie również obserwuje się bardzo zróżnicowane wyniki. Badacze ze Skandynawii [34] odnotowali obecność wirusa u 66% badanych chorych pochodzących z Norwegii, Szwecji i Finlandii. Zespół z Finlandii, Koskinen i wsp. [35] wykazali nawet 100% odsetek HPV-pozytywnych guzów. Analizowany przez nich materiał był jednak niewielki, bo obejmował tylko 12 chorych. Nieco niższy odsetek przedstawiają badacze niemieccy 25 60% [36, 37], którzy poddali analizie ponad 100 chorych. Van Houten [38] i Snijders [39], analizując materiał holenderski, podają odpowiednio występowanie wirusa w 23,3% i 28,6%. Ich wyniki obejmują jednak wyłącznie przypadki, w których potwierdzono aktywny proces infekcji, a nie wyłącznie obecności wirusowego DNA. Co ciekawe, w badaniach przeprowadzonych w Polsce, obejmujących bardzo niewielki materiał, udział infekcji wirusowej w etiopatogenezie raka płaskonabłonkowego głowy i szyi zdaje się odgrywać mniejszą rolę. Szkaradkiewicz i wsp. [40], badając grupę 28 chorych obejmującą 14 chorych na raka migdałka podniebiennego oraz 14 chorych na raka nasady języka, stwierdzili obecność wirusowego DNA wyłącznie w 3 przypadkach, co stanowiło 10,7%. Wyniki tej pracy są więc zdecydowanie bardziej zbliżone do obserwacji zaprezentowanych w niniejszej analizie, aniżeli dane z Europy zachodniej. Morshed i wsp. [41], przeprowadzając kompleksową analizę 93 chorych leczonych z powodu raka krtani w klinice lubelskiej, zastosowali technikę PCR z wykorzystaniem zaprojektowanego zestawu starterów (SPF10), pozwalającego na wykrywanie wielu typów wirusa. Technika ta należy do najczulszych metod detekcji wirusowego DNA [42]. W badanym materiale Morshed i wsp. zaobserwowali obecność wirusowego DNA w 33 przypadkach, co stanowiło 35,5%. Biorąc pod uwagę lokalizację mniej charakterystyczną dla występowania onkogennych HPV oraz inne dane z piśmiennictwa [5, 6], uważa się ten wynik za wysoki. Jednakże może mieć na to wpływ fakt, iż bardzo czuła technika PCR nieuzupełniona o techniki hybrydyzacji in situ wskazuje jedynie na występowanie wirusa, a nie na jego faktyczną integrację do genomowego DNA komórek nabłonka. Tak duże rozbieżności w rozpowszechnieniu onkogennych typów wirusa HPV, jako czynnika biorącego udział w etiopatogenezie raków płaskonabłonkowych, mają niewątpliwie związek z czynnikami ryzyka infekcji wirusem. Obecnie wiadomo, że chorzy, u których rak wywołany został przez wirusa HPV, charakteryzują się określonymi cechami. Są generalnie młodsi, palą papierosy w zdecydowanie mniejszym odsetku oraz charakteryzują się zdecydowanie większą liczbą partnerów seksualnych w porównaniu z chorymi, u których nie stwierdzono obecności wirusa. Istnieją również doniesienia mówiące o paleniu konopi indyjskich [43] oraz o infekcji wirusem HIV [44] jako czynnikach sprzyjających infekcji i powstawania nowotworu. Wnioski W żadnym z badanych przypadków nie stwierdzono obecności wirusa, co może świadczyć o stosunkowo niskim udziale raków związanych z HPV w Polsce. Klasyczna ścieżka kancerogenezy, związana ze środowiskowymi czynnikami ryzyka, zdaje się odgrywać najistotniejszą rolę. Badanie immunohistochemiczne dla p16 stanowi dobry test przesiewowy dla poszukiwania aktywnej infekcji HPV. Ze względu na pewną ilość wyników fałszywie dodatnich, pozytywne wyniki wymagają jednak uzupełnienia o techniki PCR, np. GP5+/6+-PCR. Piśmiennictwo 1. Ries LAG, Melbert D, Krapcho M. et al. SEER Cancer Statistics Review, Bethesda, MD: National Cancer Institute, Annertz K, Anderson H, Biorklund A. et al. Incidence and survival of squamous cell carcinoma of the tongue in Scandinavia, with special reference to young adults. Int J Cancer 2002;101: Shiboski CH, Schmidt BL, Jordan RC. Tongue and tonsil carcinoma: increasing trends in the U.S. population ages years. Cancer 2005;103: D Souza G, Kreimer AR, Viscidi R. et al. Case-control study of human papillomavirus and oropharyngeal cancer. N Engl J Med 2007;356: Kreimer AR, Clifford GM, Boyle P, Franceschi S. Human papillomavirus types in head and neck squamous cell carcinomas worldwide: a systematic review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2005;14: Hobbs CG, Sterne JA, Bailey M, et al. Human papillomavirus and head and neck cancer: a systematic review and metaanalysis. Clin Otolaryngol 2006;31: Wilczynski SP, Lin BT, Xie Y, Paz IB. Detection of human papillomavirus DNA and oncoprotein overexpression are associated with distinct morphological patterns of tonsillar squamous cell carcinoma. Am J Pathol 1998;152: Gillison ML, Koch WM, Capone RB, et al. Evidence for a causal association between human papillomavirus and a subset of head and neck cancers. J Natl Cancer Inst 2000;92: Herrero R. Castellsagué X, Pawlita M, et al. Human papillomavirus and oral cancer: the International Agency for Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst 2003;95: Adelstein DJ. Ridge JA, Gillison ML, et al. Head and neck squamous cell cancer and the human papillomavirus: summary of a National Cancer Institute State of the Science 249

7 250 Meeting, November 9-10, 2008, Washington, D.C. Head 24. Westra WH, Taube JM, Poeta ML, et al. Inverse relationship Neck 2009;31: van den Brule AJ, Pol R, Fransen-Daalmeijer N, et al. GP51/61 PCR followed by reverse line blot analysis enables rapid and high-throughput identification of human papillomavirus genotypes. J Clin Microbiol 2002;40: Dillner J, Knekt P, Schiller JT. Et al. Prospective seroepidemiological evidence that human papillomavirus type 16 infection is a risk factor for oesophageal squamous cell carcinoma. BMJ 1995;311: Dahlstrom KR, Adler-Storthz K, Etzel CJ. Et al. Human papillomavirus type 16 infection and squamous cell carcinoma of the head and neck in never-smokers: a matched pair analysis. Clin Cancer Res. 2003;9: Chen PC, Kuo C, Pan CC. et al. Risk of oral cancer associated with human papillomavirus infection, betel quidwith human papillomavirus infection, betel quid chewing, and cigarette smoking in Taiwan an integrated molecular and epidemiological study of 58 cases. J. Oral Pathol Med. 2002;31: Snijders PJ, Cromme FV, van den Brule AJ. et al. Prevalence 2001;92: and expression of human papillomavirus in tonsillar 30. Smeets SJ, Hesselink AT, Speel EJ. et al. A novel algorithm carcinomas, indicating a possible viral etiology. Int. J. Can- for reliable detection of human papillomavirus in paraffin cer 1992;51: Lewensohn-Fuchs I, Munck-Wikland E, Berke Z. et al. Involvement of aberrant p53 expression and human papillo- 2000;38: Clavel C, Masure M, Putaud I. et al. Hybrid capture II, a new between human papillomavirus-16 infection and disruptive p53 gene mutations in squamous cell carcinoma of the head and neck. Clin Cancer Res. 2008;14: Braakhuis BJ, Snijders PJ, Keune WJ, et al. Genetic Patterns in Head and Neck Cancers That Contain or Lack Transcriptionally Active Human Papillomavirus. J Natl Cancer Inst. 2004;96: Snijders PJ, van den Brule AJ, Jacobs MV, et al. HPV DNA detection and typing in cervical scrapes. Methods Mol Med. 2005;119: Gillison ML, Shah KV. Chapter 9: Role of mucosal human papillomavirus in nongenital cancers. J Natl Cancer Inst Monogr 2003: Begum S, Cao D, Gillison ML, et al. Tissue distribution of HPV 16 DNA integration in patients with tonsillar carcinoma as visualized by HPV16 in situ hybridization and p16 immunohistochemistry. Clin Cancer Res 2005;11: Klaes R, Friedrich T, Spitkovsky D. et al. Overexpression of p16 (INK4A) as a specific marker for dysplastic and neoplastic epithelial cells of the cervix uteri. Int J Cancer embedded head and neck cancer specimen. Int J Cancer 2007;121: Herrero R., Castellsague X., Pawlita M. et al. Human pap- mavirus in carcinoma of the head, neck and esophagus. illomavirus and oral cancer: the International Agency for Anticancer Res. 1994;14: Research on Cancer multicenter study. J Natl Cancer Inst 17. Klussmann JP, Weissenborn SJ, Wieland U. et al. Prevalence, 2003;95: distribution, and viral load of human papillomavirus 16 DNA 32. Parkin DM, Bray F. Chapter 2: the burden of HPVrelated in tonsillar carcinomas. Cancer 2001;92: cancers. Vaccine 2006;24(Suppl 3):S11 S Iftner T, Villa LL. Chapter 12: human papillomavirus technologies. J Natl Cancer Inst Monogr 2003;31: tients with human papillomavirus-positive head and neck 33. Fakhry C, Westra WH, Li S. et al. Improved survival of pa- 19. van Ham MA, Bakkers JM, Harbers G.K. et al. Comparison squamous cell carcinoma in a prospective clinical trial. J of two commercial assays for detection of human papillomavirus (HPV) in cervical scrape specimens: validation of the 34. Mork J, Lie AK, Glattre E. et al. Human papillomavirus in- Natl Cancer Inst 2008;100: Roche AMPLICOR HPV test as a means to screen for HPV fection as a risk factor for squamous-cell carcinoma of the genotypes associated with a higher risk of cervical disorders. J Clin Microbiol 2005;43: Koskinen WJ, Chen RW, Leivo I. et al. Prevalence and physi- head and neck. N Engl J Med 2001;344: Kleter B, van Doorn LJ, ter Schegget J. et al. Novel shortfragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum denomas of the head and neck. Int J Cancer 2003;107: cal status of human papillomavirus in squamous cell carcitection of anogenital human papillomaviruses. Am J Pathol 36. Kleist B, Poetsch M, Bankau A, et al. First hints for a correlation between amplification of the Int-2 gene and infection 1998;153: Jacobs MV, Snijders PJ, van den Brule AJ. et al. A general with human papillomavirus in head and neck squamous primer GP5+/GP6(+)-mediated PCR-enzyme immunoassay cell carcinomas. J Oral Pathol Med. 2000;29: method for rapid detection of 14 high-risk and 6 low-risk 37. Klussmann JP, Weissenborn SJ, Wieland U, et al. Prevalence, distribution and viral load of human papillomavirus human papillomavirus genotypes in cervical scrapings. J Clin Microbiol 1997;35: DNA in tonsillar carcinomas. Cancer 2001;92: Gravitt PE, Peyton CL, Alessi TQ. et al. Improved amplification of genital human papillomaviruses. J Clin Microbiol logical evidence that human papillomaviruses are 38. van Houten VM, Snijders PJ, van den Brekel MW, et al. Bio- etiologically involved in a subgroup of head and neck squamous cell carcinomas. Int J Cancer 2001;15(93): Snijders PJ, Scholes AG, Hart CA, et al. Prevalence of mu- sensitive test for human papillomavirus detection. Comparison with hybrid capture I and PCR results in cervical cosotropic human papillomaviruses in squamous-cell carcinoma lesions. J Clin Pathol 1998;51: of the head and neck. Int J Cancer 1996;66:464 9.

8 40. Szkaradkiewicz A, Kruk-Zagajewska A, Wal M, et al. Epstein-Barr virus and human papillomavirus infections and oropharyngeal squamous cell carcinomas. Clin Exp Med. 2002;2: Morshed K, Polz-Dacewicz M., Szymański M, Polz D. Shortfragment PCR assay for highly sensitive broad-spectrum detection of human papillomaviruses in laryngeal squamous cell carcinoma and normal mucosa: clinico-pathological evaluation. Eur Arch Otorhinolaryngol. 2008;265(Suppl 1):S Crum CP. Detecting every genital papilloma virus infection: what does it mean? Am J Pathol. 1998;153: Braakhuis BJ, Brakenhoff RH, Meijer CJ, et al. Human papilloma virus in head and neck cancer: the need for a standardised assay to assess the full clinical importance. Eur J Cancer. 2009;45: Kreimer AR, Alberg AJ, Daniel R. et al. Oral human papillomavirus infection in adults is associated with sexual behavior and HIV serostatus. J Infect Dis 2004;189: