Analysis of mutations within the TP53 gene in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck

Transkrypt

1 114 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Analysis of mutations within the TP53 gene in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck, Katarzyna Lamperska 2, Jakub Pazdrowski, Wojciech Golusinski SUMMARY Head and neck cancer is the six most common type of cancer. Tobacco and alcohol consumption are implicated in 75% of all SCCHN and have a multiplicative combined effect. It is considered to be the main risk factor for the cancer example mutations in the p53 tumour suppressor gene, paved the way for their use as molecular markers. Mutations in the TP53 gene frequently occur plays a sentinel role in the pathways that prevent development of cancer by inducing apoptosis, DNA repair and cell cycle arrest in response to different types of cellular stress The aim of the study, was the assessment of the TP53 mutations prevalence in the head and neck cancer patients and it s relation with the clinical data and course of the disease. The material comprised of a primary tumour in the oral cavity, oropharynx or larynx, who were scheduled for surgical treatment. The mutations in TP53, were detected with use consumption and the mutation incidence has been observed. The site of the tumour and histopathological grading were also related to the prevalence of was no correlation between mutations and the T and N stage of the disease. TP53 mutation, squamous cell carcinoma, risk factor by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów / tel. fax Raki płaskonabłonkowe głowy i szyi stanowią heterogenną grupę nowotworów. Rozwijają się w różnych lokalizacjach pierwotnych, ale związane są ze wspólnymi czynnikami ryzyka i wykazują podobne cechy patologiczne. Rocznie na świecie rozpoznaje się około nowych zachorowań na nowotwory głowy i szyi. Pomimo coraz doskonalszych technik diagnostycznych oraz metod leczenia, okres 5-letniego przeżycia uśredniony dla wszystkich stadiów zaawansowania choroby w ostatnich 10 latach nie uległ poprawie i wynosi około 60% [1]. Dane te nie dotyczą nowotworów zlokalizowanych w obrębie gardła dolnego, gdzie okres 5-letniego przeżycia nie przekracza 40%. Spożywanie wysokoprocentowych napojów alkoholowych oraz palenie tytoniu uważa się za podstawowe czynniki ryzyka rozwoju raka głowy i szyi. Około 75% wszystkich raków tego regionu związanych jest z występowaniem obu tych czynników [2]. Jednocześnie w Europie i Stanach Zjednoczonych obserwuje się stały wzrost zachorowań osób poniżej 40. roku życia, tak zwanych młodych dorosłych niepalących tytoniu i nienadużywających alkoholu [3, 4]. Mutacje w obrębie genu supresorowego TP53 należą do najczęstszych genetycznych alteracji obserwowanych w nowotworach złośliwych. W zależności od zastosowanych metod i liczby badanych eksonów występują w około 50 70% nowotworów złośliwych [5]. Zjawisko to należy do stosunkowo wczesnych w sekwencyjnym procesie karcynogenezy i powoduje konwersję hiperplastycznych komórek nabłonkowych w dysplastyczne, co jest procesem nieodwracalnym. Aktywowane onkogeny, utleniacze, onkogeny wirusowe, hipoksja, cytokiny i czynniki wzrostu, jak również inne czynniki uszkadzające DNA, narażają komórkę nabłonka na niekontrolowaną proliferację prowadzącą do przemiany nowotworowej. Funkcja genu TP53 polega na integrowaniu reakcji komórki na oddziałujące na nią czynniki uszkadzające DNA. Dochodzi do tego poprzez aktywację (transkrypcję) szeregu genów docelowych. Obecnie uważa się, iż TP53 reguluje ekspresję nawet znanych genów [6]. W zależności od stopnia

2 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 115 Tabela I. B uszkodzenia materiału genetycznego komórki TP53 posiada zdolność zwolnienia bądź zatrzymania cyklu komórkowego, naprawy DNA lub, w przypadku gdy jest to niemożliwe, indukcji apoptozy. Spektrum mutacji obserwowane w nowotworach głowy i szyi jest w dużym stopniu podobne do tego, które charakteryzuje raki płaskonabłonkowe w innych lokalizacjach. Kodony (ekson 7) oraz (ekson 8) to tak zwane gorące miejsca (hot-spots), w obrębie których występowanie mutacji jest bardzo charakterystyczne. Wspomniane gorące miejsca zlokalizowane są w obrębie domeny wiązania DNA. W przypadku występowania mutacji w tym regionie, białko traci zdolność wiązania sekwencji promotorowych genów aktywowanych przez TP53. Badania dowiodły, że ekspozycja komórki na benzopireny zawarte w dymie tytoniowym wywołuje mutacje w kodonach 157, 248 oraz 273 i w znacznej większości są to transwersje G T [7]. Rak płaskonabłonkowy głowy i szyi stanowi bardzo dobry model do badania spektrum mutacji w TP53 ze względu na istotną ekspozycję i oczywisty związek ze spożywaniem alkoholu i paleniem tytoniu. Z klinicznego punktu widzenia, obecność mutacji w obrębie genu TP53 jest ważnym czynnikiem prognostycznym i ma istotny wpływ na długość przeżycia. Celem pracy była ocena roli mutacji genu TP53 jako czynnika rozwoju raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Badano częstość występowania mutacji somatycznych w obrębie genu TP53 w tkance guza u chorych na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi. Probowano także określić związek pomiędzy występowaniem mutacji, a cechami nowotworu, takimi jak: lokalizacja anatomiczna guza, stopień zaawansowania klinicznego wyrażony klasyfikacją TNM, stopień dojrzałości nowotworu G, oraz narażeniem chorych na środowiskowe czynniki ryzyka. Przedmiotem badań była tkanka nowotworowa oraz krew pochodząca od 50 chorych na raka płaskonabłonkowego regionu głowy i szyi leczonych na Oddziale Chirurgii Głowy i Szyi i Onkologii Laryngologicznej Wielkopolskiego Centrum Onkologii w Poznaniu w latach Wszyscy chorzy poddani zostali pierwotnemu leczeniu chirurgicznemu bądź leczeniu chirurgicznemu uzupełnionemu o radioterapię. Wiek chorych mieścił się w przedziale od 36 do 80 lat w chwili rozpoznania choroby. Średnio wynosił 60,06 roku (SD 12,4; mediana 58,5). W badanej grupie chorych było 36 mężczyzn (75%) i 12 kobiet (25%). U 31 chorych guz zlokalizowany był w obrębie jamy ustnej, u 10 w obrębie gardła środkowego, natomiast u 9 w krtani. Jako kryteria wyłączające z badania przyjęto wznowy nowotworu, ogniska będące drugimi pierwotnymi nowotworami, a także guzy leczone pierwotną radioterapią. Chorzy, u których zabieg operacyjny stanowił uzupełnienie nieradykalnego zabiegu pierwotnego, cytoredukcję guza lub zabiegi chirurgii ratującej, również nie kwalifikowali się do niniejszej analizy. Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Uniwersytetu Medycznego w Poznaniu. Materiał tkankowy bezpośrednio po wykonaniu zabiegu operacyjnego zamrażano i przechowywano w temperaturze -80 C. DNA izolowano z mrożonej tkanki nowotworowej oraz z krwi obwodowej przy użyciu zestawu Wizard Genomic DNA purification Kit (Promega Wi, USA), zgodnie z zaleceniami producenta. W celu analizy PCR-SSCP (single strand conformation polimorphism) gen TP53 podzielono na 6 fragmentów zawierających zarówno introny jak eksony, w których najczęściej opisywano mutacje w nowotworach u ludzi (hot spots) Badano fragmenty genu TP53 zawierające odpowiednio eksony 4 10 oraz fragment eksonu 11. Fragmenty te amplifikowano przy zastosowaniu zestawów starterów zaprojektowanych na podstawie sekwencji uzyskanej z GenBanku (nr NM_ ) (Tab. I). Przeprowadzono analizę DNA wyizolowanego z tkanki nowotworowej oraz z krwi obwodowej pochodzących od 50 chorych. W każdej próbie oddzielnie analizowano każdy z 6 fragmentów genu TP53. Startery do analizy PCR-SSCP znakowano na końcu 5 z użyciem gatp-p32(3000ci/ mmol, Amersham). Reakcję przeprowadzono w objętości 5 μl zawierającej 1 bufor PCR, 1,5 mm MgCl2, 0,8 mm dntps, 1 μm odpowiednich starterow, 0,125 U

3 116 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela II. 7 Tabela III. polimerazy Taq DNA i 50 ng genomowego DNA jednorazowo dla 40 próbek. DNA powielano, stosując 35 cykli o następującym profilu termicznym: 94 C/2 min; 94 C/30 sek; 55 C/30 sek; 72 C/15 sek; 72 C/5 min. Po przeprowadzeniu PCR do każdej z probówek dodawano 20 μl mieszaniny 95% formamidu z ksylenocyjanolem i bromofenolem (barwniki), a następnie poddawano denaturacji w temperaturze 94 C przez 5 minut. Żel do elektroforezy w składzie 6% PAG, akrylamid/bisakrylamid 19:1, 10% glicerol, 1x TBE, wylewano między szyby i umieszczano w nim grzebienie typu zęby rekina o grubości 0,3 mm. Po spolimeryzowaniu żelu szyby umieszczano w aparacie do elektroforezy. Rozdział SSCP prowadzono w temperaturze pokojowej przez noc przy stałym napięciu 250 V. Po zakończeniu rozdziału żel przenoszono na bibułę typu Whatmann 3MM, suszono i poddawano autoradiografii. Pasma wykazujące odmienną w stosunku do pozostałych migrację wycinano z żelu i umieszczano w probówkach zawierających 100 μl wody. Po 24-godzinnej elucji poddawano je reamplifikacji. W tym celu przeprowadzano reakcję PCR w 50 μl o standardowych, opisanych powyżej parametrach. Stosowano startery takie same, jak podczas pierwotnej amplifikacji. Do produktu dodano 10 μl obciążacza. Próbki nanoszono na 1,2% żel agarozowy i poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu wobec markera DNA wielkości 100 pz. Fragmenty żelu po reamplifikacji, zawierające prążki DNA, widoczne w świetle UV wycinano z żelu agarozowego za pomocą jałowego skalpela i umieszczano w probówkach. Produkt oczyszczano na kolumnie, korzystając z zestawu QIAquick PCR Purification Kit firmy QIAGEN, zgodnie z zaleceniami producenta. Sekwencjonowanie wykonano, stosując zestaw odczynników BigDye Terminator v 3.1 (Applied Biosystems). Produkty sekwencjonowania oczyszczano przez strącanie etanolem, a następnie rozdzielano w aparacie ABI Prism 3130XL (Applied Biosystems), stosując polimer POP7 i kapilary o długości 36 cm. Chromatogramy edytowano w programie FinchTV (Geospiza Inc.) i GenDoc (Nicholas and Nicholas, 1997). W badaniu histopatologicznym we wszystkich przypadkach stwierdzono utkanie raka płaskonabłonkowego: carcinoma planoepitheliale keratodes (26 chorych), carcinoma planoepitheliale akeratodes (13 chorych) lub carcinoma planoepitheliale partim keratodes (11 chorych). Dominowały raki średnio dojrzałe G2, które stwierdzono u 34 chorych (68%). U 9 chorych (18%), rozpoznano raki o wysokim stopniu dojrzałości G1. U pozostałych 7 chorych (14%) występowały guzy o niskim stopniu dojrzałości G3. Stopień zaawansowania narządowego określany przez cechę T w badanej populacji występował według następującego rozkładu: postać T2 25 przypadków (50%), T1 14 chorych (28%), T3 8 chorych (6%) oraz T4 3 chorych (6%). Przerzuty do regionalnych węzłów chłonnych występowały u 64% badanych. 27 chorych (54%) sklasyfikowano jako N1, 5 chorych (10%) jako N2.

4 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 117 Ryc.2. Ryc.1. W badanej grupie nie było przypadków określonych jako N3. W badanym materiale tylko w jednym przypadku stwierdzono przerzut do płuc, określony jako M1. U wszystkich chorych przeprowadzono wywiad w kierunku uzyskania szczegółowych informacji dotyczących palenia tytoniu i spożywania napojów alkoholowych. Za chorych regularnie spożywających alkohol uznawano osoby spożywające co najmniej 2 jednostki alkoholu dziennie lub ponad 14 jednostek tygodniowo. Za chorych palących uznawano osoby wypalające co najmniej 10 papierosów dziennie. Zaliczano tu także osoby, które zerwały z nałogiem w okresie krótszym niż 3 lata. Dwudziestu dziewięciu chorych (58%) spożywało co najmniej 2 jednostki alkoholu dziennie lub powyżej 14 jednostek tygodniowo. Dwudziestu sześciu badanych (52%) paliło papierosy w ilości co najmniej 5 sztuk dziennie. Dwudziestu chorych (40%) zarówno spożywało napoje alkoholowe, jak i paliło papierosy. 15 chorych (30%) nie było narażonych na działanie żadnego spośród wyżej wymienionych czynników kancerogennych. W populacji kobiet 6 wyłącznie paliło papierosy, 5 regularnie spożywało alkohol oraz 3 zarówno spożywało alkohol i paliło papierosy. Wśród mężczyzn 20 chorych paliło papierosy, 24 regularnie spożywało napoje alkoholowe, a 17 paliło papierosy i spożywało napoje alkoholowe (Tab. II). Poszukiwanie mutacji w obrębie genu TP53 W guzach pochodzących od ośmiu chorych (16%), w genie TP53 stwierdzono obecność prążków o zmienionej migracji (Ryc. 1, Ryc. 2). W czterech guzach zmienione prążki występowały we fragmencie B, w jednym we fragmencie C, w jednym we fragmencie E oraz w dwóch w obrębie fragmentu F (Tab. III). U największej liczby chorych (4) obecność mutacji odnotowano w obrębie fragmentu B, co odpowiada eksonowi 4. U jednego chorego, u którego znaleziono prążek o zmienionej migracji we fragmencie C, mutacje były obecne w eksonie 5 lub 6, natomiast u chorego, u którego zmienioną migrację stwierdzono we fragmencie E w eksonie 8 lub 9. W dwóch przypadkach zmienione prążki stwierdzono we fragmencie F, co wskazuje na obecność mutacji w eksonie 10. W badanym materiale nie odnotowano prążków o zmienionej migracji we fragmentach D oraz G zawierających eksony 7 i 11 genu TP53. W czterech przypadkach obecność prążków o zmienionej migracji odnotowano w guzach pochodzących z gardła środkowego, a w czterech z jamy ustnej. W żadnym przypadku guza pochodzącego z krtani nie zaobserwowano prążków o zmienionej migracji. We wszystkich przypadkach, w których stwierdzono obecność mutacji w TP53, wykonano analizę PCR-SSCP DNA wyizolowanego z krwi obwodowej, celem wykluczenia obecności mutacji zarodkowych. Korelacja obecności mutacji w TP53 z cechami klinicznymi procesu nowotworowego Obecność mutacji występujących w genie TP53 porównano z lokalizacją nowotworu, stopniem zaawansowania choroby wyrażonym klasyfikacją TNM, stopniem dojrzałości nowotworu G, narażeniem na środowiskowe czynniki ryzyka (palenie tytoniu i spożywanie alkoholu) (Tab. IV). Bardzo silną zależność odnotowano między występowaniem mutacji oraz paleniem tytoniu (test dokładny Fishera p=0,004 na poziomie istotności p<0,05; OR 24,77 95% CI:1,34 457,9). Również w przypadku chorych narażonych równocześnie na skutki palenia tytoniu i spożywania napojów alkoholowych stwierdzono statystycznie istotną zależność z obecnością mutacji w TP53 (test dokładny Fishera p=0,033 na poziomie istotności p<0,05; OR 27,3 95% CI:1,47 505,41). Zależność ta charakteryzowała się jednak mniejszym poziomem istotności. W przypadku zestawienia obecności mutacji z lokalizacją guza stwierdzono zależność (test dokładny Fishera p=0,060 na poziomie istotności p<0,05) nie osiągającą jednak poziomu istotności statystycznej. Również pomiędzy

5 118 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS Tabela IV. OR stopniem dojrzałości nowotworu G i mutacjami w TP53 odnotowano zależność bliską istotności statystycznej (test Manna-Whitney a p=0,069 na poziomie istotności p<0,05) (Tab. III). Sekwencjonowanie Matryce przygotowane z wyciętych z żelu pasm wykazujących odmienną w stosunku do pozostałych migrację poddano procesowi sekwencjonowania. Pomimo zastosowania zarówno techniki manualnej, jak i automatycznej, miarodajne wyniki uzyskano tylko w 2 spośród 8 analizowanych przypadków. Znalezione mutacje dotyczyły u 1 chorego fragmentu B i były to substytucje: CÖG oraz TÖC. W drugim przypadku mutacje odnotowano we fragmencie F i były to substytucje CÖG, CÖG (Ryc. 3). Obecność mutacji w obrębie genu TP53 należy do najczęstszych zjawisk obserwowanych w nowotworach złośliwych u człowieka. Poszczególne lokalizacje anatomiczne umiejscowienia nowotworu w obrębie głowy i szyi, różnią się w sposób znaczący częstością zanotowanych mutacji. Bosch i wsp. [8] przeanalizowali materiał 256 chorych na raka płaskonabłonkowego głowy i szyi pochodzący z różnych lokalizacji.

6 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 119 Ryc.3. Aż w 66,2% raków zlokalizowanych w obrębie gardła dolnego zidentyfikowano mutacje w TP53. Wśród raków krtani mutacje zaobserwowano tylko w 35,4%. Udział raków, z mutacjami w TP53, pochodzących z innych lokalizacji, takich jak jama ustna i gardło środkowe, wynosił 37,5%. Podobny trend zdaje się występować w badanym materiale. Mutacji w TP53 nie zaobserwowano w żadnym przypadku raka krtani. Natomiast wśród guzów gardła środkowego, 40% zawierało mutacje w TP53, a jamy ustnej 12,9%. W badanym materiale nie stwierdzono raków gardła dolnego. Zależność występowania mutacji w stosunku do lokalizacji plasowała się na granicy istotności statystycznej (p=0,06). W wynikach uśrednionych dla wszystkich lokalizacji anatomicznych w obrębie głowy i szyi różni autorzy podają, iż występowanie mutacji w TP53 wynosi średnio od 30% [9] do ponad 60% [10]. Partridge i wsp. [11] uważają, że takie rozbieżności mogą być spowodowane zastosowaniem różnych technik, a także analizą różnych fragmentów badanego genu. Istnieją prace, które podają zdecydowanie wyższy udział mutacji w obrębie genu TP53. Może być to jednak efektem włączenia do analizy prób fałszywie dodatnich. Jedną z głównych przyczyn detekcji nadmiernej ilości wcześniej niepotwierdzonych mutacji może być zainfekowanie sekwencjonowanej nici obcym, genomowym DNA. Niespotykana ilość mutacji bywa również odnotowywana w przypadku tak zwanej infekcji krzyżowej, w rezultacie której dochodzi do pojawienia się tych samych mutacji w kilku badanych próbach w grupie o niewielkiej liczebności [11]. W badanym materiale stwierdzono obecność mutacji u 8 chorych, co stanowiło 16% grupy badanej. Liczba mutacji niższa niż prezentowana w piśmiennictwie może wynikać z faktu, iż większość analiz na dużych populacjach chorych obejmuje badanie całego genu, poprzez sekwencjonowanie nici cdna, będącej transkryptem z mrna i zawierającej wyłącznie sekwencje kodujące. Prace te charakteryzują się nieznacznie wyższym odsetkiem odnotowywanych mutacji [12 14]. Materiał badany w niniejszej pracy obejmował natomiast jedynie określone fragmenty genu: eksony 4 10 oraz fragment eksonu 11. W swojej metaanalizie poświęconej TP53, Partridge i wsp. [11] podkreślają, iż ze względu na obecność gorących miejsc w eksonie 7 i 8 większość prac dotyczących poszukiwania mutacji w TP53 obejmuje analizę eksonów 5 8, 5 9 lub 4 9. Zmiany w pozostałych eksonach opisywane są rzadko i nie są istotne prognostycznie. Można więc uznać spektrum mutacji badane w niniejszej pracy za kompleksowe. W celu identyfikacji mutacji w badanym materiale zastosowano technikę PCR-SSCP opisaną przez Hayashi [15]. Metoda PCR-SSCP jest jedną z najczęściej używanych technik służących do przesiewowego wykrywania mutacji punktowych. W analizie PCR-SSCP konformacja przestrzenna jednoniciowego DNA zależy od wielkości fragmentu i od jego sekwencji. Nici o zmienionej sekwencji (zawierające mutacje) migrują w żelu poliakrylamidowym z odmienną prędkością. Już pojedyncza substytucja nukleotydu skutkuje zmianą prędkości migracji w stosunku do fragmentu o prawidłowej sekwencji. Sprawia to, że jest to technika stosunkowo prosta i chętnie wykorzystywana. PCR-SSCP posiada jednak pewne ograniczenia. Warunkiem dobrej czułości metody jest analiza fragmentów nieprzekraczających 400 pz. We fragmentach krótszych metoda pozwala na wykrycie do 90% mutacji. Jeżeli długość badanych fragmentów przekracza 400 pz, wykrywalność mutacji zdecydowanie spada. W związku z powyższym, startery zostały zaprojektowane, tak by powstawał jak najmniejszy produkt. Ponadto należy wspomnieć, że

7 120 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS przy przeprowadzaniu elektroforezy w ściśle określonej temperaturze i pozostałych warunkach rozdziału istnieje ryzyko przeoczenia poszczególnych mutacji. Fakt ten również mógł wpłynąć na odnotowanie niższego odsetka mutacji niż w pracach o bardziej zaawansowanej metodologii. Golusiński i wsp. [16] przy zastosowaniu techniki PCR-SSCP w materiale 40 chorych na raka krtani, przeanalizowali eksony 5 8 genu TP53 i stwierdzili obecność mutacji w 13 przypadkach, co stanowiło 32%. Wielokrotnie udowodniono, że czynniki środowiskowe związane ze stylem życia mają istotne znaczenie w procesie rozwoju choroby nowotworowej. Najważniejszą rolę odgrywa tu palenie tytoniu oraz nadużywanie napojów alkoholowych. Wśród badanych chorych 52% paliło papierosy, 58% spożywało alkohol, a 40% było narażonych na działanie obu czynników jednocześnie. Wielu autorów podkreśla istotny wpływ palenia tytoniu [17, 18] i spożywania napojów alkoholowych [19, 20] na powstawanie mutacji w obrębie genu TP53. U badanych chorych stwierdzono istotną statystycznie zależność pomiędzy powstawaniem mutacji, a paleniem tytoniu. Wyłącznie spożywanie alkoholu nie zwiększało w sposób istotny ryzyka powstawania mutacji, jednakże oba te czynniki stosowane jednocześnie stanowiły najbardziej istotne statystycznie czynniki rozwoju mutacji. Brennan i wsp. [18] po przeanalizowaniu 129 pacjentów, u których w 54 przypadkach zidentyfikowano obecność mutacji, prezentują podobne dane. U 58% chorych, którzy palili papierosy i jednocześnie spożywali napoje alkoholowe, zaobserwowano obecność mutacji, w porównaniu z 33% chorych jedynie palących papierosy i 17% wyłącznie spożywających alkohol. Pfeifer i wsp. [17] w swoim materiale zauważyli, iż wyłącznie w przypadku raka krtani wzrasta istotnie ilość mutacji charakterystycznych dla palenia tytoniu (transwersje G-T), natomiast w pozostałych lokalizacjach w miarę ilości wypalanych papierosów wzrasta ogólna ilość mutacji, jednakże nie są one charakterystyczne dla palenia tytoniu. U 16% badanych występują mutacje w obrębie genu TP53. Jest to wartość niższa niż w większości danych prezentowanych w literaturze. Palenie tytoniu, a także równoczesne palenie tytoniu i spożywanie napojów alkoholowych w sposób istotny statystycznie wpływa na częstość występowania mutacji w TP53. Nie ma istotnych zależności pomiędzy występowaniem mutacji oraz stopniem zaawansowania klinicznego wyrażonym TNM. Występuje pewien związek mutacji ze stopniem dojrzałości guza G. Zależność ta nie osiągnęła jednak poziomu istotności statystycznej. Występuje również zależność bliska istotności statystycznej pomiędzy mutacjami w TP53 a lokalizacją nowotworu. 1. Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P. Global cancer statistics, CA Cancer J Clin 2005; 55: Blot WJ, McLaughlin JK, Winn DM. i in. Smoking and drinking in relation to oral and pharyngeal cancer. Cancer Res 1988; 48: Annertz K, Anderson H, Biorklund A. i in: Incidence and survival of squamous cell carcinoma of the tongue in Scandinavia, with special reference to young adults. Int J Cancer 2002; 101: Shiboski CH, Schmidt BL, Jordan RC. Tongue and tonsil carcinoma: increasing trends in the U.S. population ages years. Cancer 2005; 103: Nylander K, Nilsson P, Mehle C, Roos G. p53 mutations, protein expression and cell proliferation in squamous cell carcinomas of the head and neck. Br J Cancer 1995; 71: El-Diery WS, Kern SE, Pietenpol JA, Kinzler KW, Vogelstein B. Definition of a consensus binding site for p53. Nature Gen 1992; 1: Denissenko MF, Pao A, Tang M, Pfeifer GP. Preferential formation of benzo[a]pyrene adducts at lung cancer mutational hotspots in p53. Science 1996; 274: Bosch FX, Ritter D, Enders C, Flechtenmacher C, Abel U, Dietz A, Hergenhahn M, Weidauer H, Bosch FX. Head and neck tumor sites differ in prevalence and spectrum of p53 alterations but these have limited prognostic value. Int J Cancer 2004, 10; 111: Le Bihan ML, Douc-Rasy S, Duvillard P, Armand JP, Riou G. High incidence of p53 alterations (mutation, deletion, over expression) in head and neck primary tumors and metastases; absence of correlation with clinical outcome. Frequent protein over expression in normal epithelium and in early non invasive lesions. Oncogene 1995; 10: Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Haris CC. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer aetiology and molecular pathogenesis. Cancer Res 1994; 54: Partridge M, Costea DE, Huang X. The changing face of p53 in head and neck cancer. Int J Oral Maxillof Surg 2007; 36: Balz V, Scheckenbach K, Gotte K, Bockmuhl U, Petersen I, Bier H. Is the p53 inactivation frequency in squamous cell carcinomas of the head and neck underestimated? Analysis of p53 exons 2 11 and human papillomavirus 16/18 E6 transcripts in 123 unselected tumor specimens. Cancer Res 2003; 63: Kropveld A, Rozemuller EH, Leppers FG, Scheidel KC, de Weger RA, Koole R, Hordijk GJ, Slootweg PJ, Tilanus MG. Sequencing analysis of RNA and DNA of exons 1 through 11 shows p53 gene alterations to be present in almost 100% of head and neck squamous cell cancers. Lab Invest 1999; 79: Rozemuller EH, Kropveld A, Kreyveld E, Leppers FG, Scheidel K. Sensitive detection of p53 mutation: analysis by di-

8 PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS 121 rect sequencing and multisequence analysis. Cancer Detect Prev 2001; 25: Hayashi K. PCR-SSCP: a simple and sensitive method for detection of mutations in the genomic DNA. PCR Methods Appl 1991; 1: Golusinski W, Olofsson J, Szmeja Z, Szyfter K, Szyfter W, Biczysko W, Hemminki K. Alteration of p53 gene structure and function in laryngeal squamous cell cancer. Eur Arch Otorhinolaryngol 1997; 254 Suppl 1: S Pfeifer GP, Dennisenko MF, Olivier M. Tobacco smoke carcinogens, DNA damage and p53 mutations in smokingassociated cancers. Oncogene 2002; 21; Brennan JA, Boyle JO, Koch WM. Association between cigarette smoking and mutation of the p53 gene in squamous- -cell carcinoma of the head and neck. N Eng J Med 1995; 332; Boffetta P, Mashberg A, Winkelmann R. Carcinogenic effect of tobacco smoking and alcohol drinking on anatomic sites of the oral cvity and oropharynx. Int J Cancer 1992; 52: Lewin F, Norell SE, Johansson H. Smoking tobacco, oral snuff and alcohol in etiology of squamosus cell carcinoma of the head and neck: a population based case-referent study in Sweden. Cancer 1998; 82: