WYBRANE ASPEKTY SUPLEMENTACJI BRZECZEK

Transkrypt

1 WYBRANE ASPEKTY SUPLEMENTACJI BRZECZEK Dr. habil. Anna Sałek International Bio-Consulting, Germany & Domatec GmbH, Niemcy & Streszczenie Dla drożdży Saccharomyces sp., zdolność fermentacji w brzeczkach o wysokim stężeniu substratu (HG, High Gravity) jest zależna od wysokiej koncentracji wewnątrzkomórkowych węglowodanów. Najbardziej znaczącym węglowodanem z uwagi na w.w. aspekty osmofilości jest trehaloza i glikogen. Podwyższona zawartość węglowodanów w komórce to pożądana właściwość drożdży Saccharomyces cerevisiae, ponieważ chroni komórki przed ich autolizą oraz zwiększa zdolności życiowe kultur w procesie suszenia i zamrażania (w wyniku ochrony enzymu fosfofruktokinazy). Szybkie procesy kataboliczne (fermentacja) prowadzone np. przez drożdże długo przechowywane, suszone lub przez drożdże po ich rozmrożeniu, zależą od aktywności życiowej szczepionki starterowej (inoculum). Właściwości fizjologiczne inoculum muszą być dobrane do środowiska fermentacji, w przeciwnym wypadku obserwuje się brak odpowiedniego wzrostu komórek, bądź pojawia się zbyt długa lag-faza (faza opóźnionego wzrostu). Dobranie tych parametrów jest bardzo trudne, gdyż właściwości osmofilne drożdży, dzięki podwyższonej zawartości wewnątrzkomórkowej trehalozy, stopniowo zmniejszają się w miarę upływu czasu przechowywania, za co odpowiedzialne są enzymy V- trehalaza i C-trehalaza. Sposób zahamowania ubytku trehalozy i utrzymania jej podwyższonej zawartości oraz metoda otrzymania drożdży, zapewniających szybki start kultur w środowisku osmotycznie aktywnym, opisano w patentach (United States Patent ; European Patent EP ). Abstract In Saccharomyces sp. yeast, the ability to ferment high concentrations of substrates (HG, High Gravity) correlates with a high carbohydrate content. The most significant carbohydrate in these respects is trehalose and glycogen. A high carbohydrate content is a desirable property of baker's yeast, because it protects the cells from autolysis and increases leavening capacity after drying or freezing (by protection of the enzyme phosphfructokinase). Rapid leavening (anabolic processes) by dried or frozen yeast, and rapid fermentation (catabolic processes) after storage cultures, depend upon the availability of an active starter inoculum. The physiology of the inoculum must be matched to the properties of the fermentation, otherwise no growth, or else a very long lag phase occur. This matching is very difficult to achieve with preserved osmophilic yeast, because their initially high trehalose content decreases during storage (due to the presence of the enzymes V-trehalase and C-trehalase). The novel way to prevent this decrease and so give yeast that exhibits immediate activity in osmophilic conditions are described in two patents (United States Patent ; European Patent EP ).

2 Innowacje technologiczne w browarnictwie Rozwój i doskonalenie procesów biotechnologicznych (w tym produkcji piwa) oraz preferowanie technologii bezściekowych i małoodpadowych wymaga pewnych zmian technologicznych, do których należy, m.in. fermentacja drożdży w brzeczkach wzbogaconych solami mineralnymi, bądź w brzeczkach zagęszczonych (HG, High Gravity) o wysokim ciśnieniu osmotycznym. Suplementacja brzeczek OG (Oryginal Gravity) do HG, np. przez dodatek ekstraktów słodowych lub syropów glukozowych, wprawdzie ma wiele zalet, ale wywołuje też pewne problemy technologiczne, szczególnie przy propagacji drożdży oraz wady organoleptyczne piwa (m.in. potęgownie się gorzkiego, smaku pochodzącego z chmielu lub pojawianie się obcego zapachu, tworzonego przez drożdże). Zagadnienie suplementacji brzeczek pewnymi składnikami mineralnymi, które w nadmiarze mogą być czynnikami stresowymi dla komórek drożdżowych (jakkolwiek drożdże Saccharomyces sp. posiadają wewnątrzkomórkowy system detoksykacji, utrzymujący stan homeostazy dzięki kontroli poziomu dopływających jonów [Vido i in., 2001]), szeroko omówiono w pracach Poredy i wsp. [2006 i 2007]. Określono zależność fermentacji brzeczki piwnej od jonów metali Mg +2, Zn +2 i Ca +2, a także ich wpływ na zmiany w ogólnej gospodarce jonowej, na przebieg i wydajność procesów anabolicznych oraz katabolicznych drożdży. Analiza przebiegów fermentacji wzbogacanych brzeczek wykazała zależność pomiędzy steżęniem ekstraktu słodowego, a zapotrzebowaniem drożdży na jony Mg +2, przy czym wzrost ekstraktu pociągał za sobą konieczność zwiększonej, przemiennej suplementacji pożywki jonami magnezu (Mg +2 ) i cynku (Zn +2 ) w kolejnych repasażach biomasy. Wykazano, że podwyższenie steżenia Mg +2 do 300 ppm, ogranicza bioakumulację cynku, stymulujac jednocześnie przyrost drożdży [Poreda, 2006]. Stąd nasuwa się uwaga, że wzbogacanie brzeczki słodowej makro- i mikroelementami powinno być starannie zaplanowane, z uwzględnieniem warunków fermentacji, gęstości brzeczki, stanu fizjologicznego gęstwy drożdżowej oraz krotności jej użycia. Z uwagi na powyższe, cechę osmofilności drożdży Saccharomyces sp., pożądaną podczas stosowania wzbogacanych podłóż (suplementacji związkami 2

3 mineralnymi i ekstraktem słodowym) należy rozpatrywać z dwu punktów widzenia, tj. od strony możliwości wzrostowych (aktywności procesów anabolicznych) różnych szczepów w warunkach o podwyższonej osmotyczności i od ich zdolności fermentacyjnych (aktywności procesów katabolicznych) w brzeczkach HG. Reperkusje suplementacji brzeczek rola membran komórkowych Wiadomo, że intensywność rozmnażania drożdży w dużym stopniu zależy od właściwości środowiska hodowlanego, przy czym dla każdego składnika podłoża propagacyjnego istnieje pewne krytyczne, minimalne jego stężenie, począwszy od którego komórka zdolna jest ten związek metabolizować. W miarę podwyższania stężenia składników w podłożu, tempo przyrostu biomasy zwiększa się do określonego poziomu. Dalszy wzrost zawartości składników prowadzi do hamowania procesów życiowych drożdży (rozmnażanie, fermentacja), na skutek wysokiego ciśnienia osmotycznego środowiska. W optymalnych warunkach hodowlanych ciśnienie osmotyczne wewnątrz komórki drożdży waha się w granicach 0,12-0,80 MPa (1,2-8 atn); wartość ta podwyższa się wraz ze wzrostem stężenia rozpuszczalnych składników brzeczki [Converti i in., 1984]. W aspekcie fizjologii komórki, z cechą osmofilności wiąże się odbiór sygnałów o podwyższonym ciżnieniu osmotycznym, za który odpowiedzialne są specjalne białka membranowe, umieszczone w podwójnej warstwie fosfolipidowej (Rys. 1). Rys. 1. Białka membranowe do odbioru sygnałów o ciśnieniu osmotycznym (model) [Beckmann Institute, University of Illinois]. 3

4 W hodowlach drożdży na brzeczkach o podwyższonym stężeniu, niezwykle istotna jest przepuszczalność membran komórkowych drożdży oraz transport substancji przez błony na zasadzie dyfuzji lub też za pośrednictwem specyficznych przenośników [Hohmana, 2002; Rodriguea-Pousada i in., 2005]. Szczególnie ważny dla prawidłowego funkcjonowania komórek jest transport aktywny, zdeterminowany budową membran komórkowych, wymagający dostarczenia energii i umożliwiający gromadzenie metabolitów wbrew gradientowi stężeń, np. cukrów zapasowych, jak trehaloza oraz glikogen [Bottema i in., 1983; de Lima Paulillo i in., 2003]. Problemowi składu chemicznego, strukturze i funkcji tych membran poświęcono wiele prac [Albrecht i in., 1988; Bottema i in., 1983]. Szczegółowo przebadano wielowarstwowo zbudowaną ścianę komórkową Saccharomyces cerevisiae, której głównym składnikiem, w ok. 90%, są polisacharydy, przy czym należy rozróżnić dwie warstwy strukturalne, wewnętrzną - glukanu i zewnętrzną mannanu, pomiędzy którymi rozmieszcone jest 5-13% białek, ponad 8% tłuszczu oraz 1-3% chityny. Ilość tych komponentów zależy od gatunku drożdży, jak również od ich wieku. Na przepuszczalność membran cytoplazmatycznych drożdży szczególnie wpływa ilość i rodzaj umieszczonych w nich łańcuchów kwasów tłuszczowych, zawartych w fosfolipidach (Rys. 2 i 3). Rys. 2. Dwuwarstwowa budowa membrany cytoplazmatycznej z częścią hydrofilną i hydrofobową fosfolipidów [Zellbiologie für Bioinformatiker, SoSe, 2005]. 4

5 Rys. 3. Struktura wybranego fosfolipidu, np. fosfatydylocholiny [Zellbiologie für Bioinformatiker, SoSe 2005]. Podwyższony poziom nienasyconych kwasów tłuszczowych w błonie cytoplazmatycznej często zwiększa jej przepuszczalność, co związane jest z pewnym stopniem hydaratacji łańcuchów tłuszczowych oraz z ich luźniejszym ułożeniem. Dotychszas tylko pośrednie obserwacje wskazywały na związek między składem fosfolipidów i membran drożdżowych a ich przepuszczalnością. Rose [1981] stwierdził, że procent nienasyconych kwasów tłuszczowych w fosfolipidach błony komórkowej oraz w całych komórkach drożdżowych ulega podwyższeniu, gdy proces hodowli przebiega w warunkach tlenowych, w przeciwieństwie do warunków anaerobowych. Ta różnica w składzie fosfolipidów membran może tłumaczyć fakt szybkiego przenikania związków rozpuszczalnych w wodzie do komórek inkubowanych aerobowo. Poza składem chemicznym i strukturą membran, które są czynnikami pełniącymi istotną funkcję w mechanizmie osmofilności, ważną i ściśle określoną rolę pełnią też jony Na +, które aktywują wymianę substancji między komórką a środowiskiem. Jony sodu zapewniają transport cukrów i aminokwasów do wnętrza komórki, nawet przeciw gradientowi ich stężeń i potencjałów. Enzymem przenoszącym jest ATP-aza membranowa, stymulowana przez K +, Na + i Mg +2 [Sampedro i in., 2002]. Należy podkreślić, że korzystny wpływ jonów Na + na metabolizm komórki ustaje przy 5

6 niedoborze jonów K + w środowisku, ze względu na transport aktywny. W związku z tym pożywki są często suplementowane jonami potasu. Z powyższym wiąże się fakt, iż jony Na + (np. w stężeniu 0,9 M NaCl) wpływają na wzrost zawartości trehalozy w drożdżach, która jest regulatorem ciśnienia osmotycznego w środowisku i wewnątrz komórki [Dafour i in., 1987]. Rozpatrując problem hodowli drożdży w środowisku o podwyższonym ciśnieniu osmotycznym, należy zwrócić uwagę na konieczność zachowania optymalnych warunków napowietrzania, ph i temperatury, przy racjonalnym, zgodnym z krzywą wzrostu, dopływie brzeczki i jej suplementacji odpowiednimi związkami mineralnymi oraz ekstraktem słodowym. Wymienione wyżej parametry fizyko-chemiczne mają wyraźny wpływ na cechy użytkowe drożdży osmofilnych, m.in. na ich żywotność oraz trwałość. Podwyższone ciśnienia osmotycznego, wywołane wysokim stężeniem składników pożywki wpływa również na obniżenie zawartości wody wewnątrzkomórkowej drożdży (dehydratacja) [Laroche & Gervais, 2003]. Fakt ten, łącznie z zależnością trwałości technologicznej kultur drożdżowych od poziomu trehalozy, pozwala na stwierdzenie, między innymi, że do produkcji piwa z brzeczek HG, drożdży suszonych, bądź do drożdży poddawanych mrożeniu, najlepiej nadają się szczepy osmofilne, uprzednio hodowane (adaptowane) w tzw. gęstych brzeczkach [Hino i in., 1990]. W celu otrzymania drożdży o podwyższonej zawartości trehalozy proponuje się wiele technologicznych rozwiązań, zwiększających jej ilość w biomasie, co m.in. podano w pracach Salek & Arnold [1994 i 1995]. Regulatory osmofilności i termotolerancji - rola trehalozy Wraz ze wzrostem ciśnienia osmotycznego w środowisku (np. w brzeczkach stężonych, Blg) odpowiednie szczepy drożdży wykazują wzmożoną syntezę trehalozy (od 0,1% do 8%, a nawet do 12% w suchej masie), co zapewnia aktywniejszy proces wzrostu komórek oraz zwiększa wydajność biomasy z cukru. Przypuszcza się, że trehaloza blokuje α-glukozydazę, gdyż dodana do hodowli początkowych generacji obniża szybkość fermentacji maltozy, ale nie hamuje fermentacji glukozy [Grba i in., 1976]. 6

7 Drożdże Saccharomyces sp. zawierają dwa węglowodany zapasowe, trehalozę i glikogen oraz dwa węglowodany strukturalne, jak mannan i glukan [Suomalainen & Pfiffli, 1961]. Zawartość tych węglowodanów ulega znacznym wahaniom, uzależnionym warunkami hodowli i fermentacji (np. zmiennością składu pożywek, ich stężeniem oraz stopniem napowietrzania kultury) [Panek & Matton, 1977; Winkler i in., 1991; de Lima Paulillo i in., 2003], jak również temperaturą hodowli podczas stacjonarnej fazy wzrostu [Mansure i in., 1994]). Ilość węglowodanów strukturalnych pozostaje z reguły na stosunkowo stałym poziomie. Trehaloza (α-d-glucopyranosyl-α-d-glucopyranoside, dwucukier nieredukujący, CAS: ) jest kumulowana wewnątrz pęcherzyków (vesicles), rozmieszczonych w cytozolu komórki drożdżowej i łączy się z unilamelarną warstwą lipidową błony cytoplazmatycznej [Reed i in., 1991; Othake i in., 2006]. Grupy hydroksylowe ( OH) trehalozy są związane z grupami fosforowymi fosfolipidów, zawartych w dwuwarstwowej strukturze membrany [Tang i in., 2007], utrzymując ją tym samym w stanie "płynnym" (fluidalnym, Rys. 4). Rys. 4. Mozaikowy (fluidalny) model błony cytoplazmatycznej drożdży Saccharomyces cerevisiae [Zellbiologie für Bioinformatiker, SoSe 2005]. 7

8 W ten sposób membrana poddana jest ochronie przed osuszaniem podczas procesów odwadniania (dehydratacji) oraz przemian fazowych przy rehydratacji [Crowe i in., 1983; Crowe i in., 1984]. Reasumując, trehaloza stabilizuje membranę i całą komórkę, wykazując swoje właściwości ochronne, szczególnie podczas przechowywania drożdży w warunkach stresowych [Hohmann, 2002; Elbein i in., 2003; Pereira i in., 2004; Skibinsky i in., 2005]. W czasie stacjonarnej fazy wzrostu drożdży Saccharomyces sp. na pożywce z glukozą, akumulacja trehalozy zaczyna się znacznie później aniżeli glikogenu. W fazie, tzw. głodu, metabolizm trehalozy rozpoczyna się tylko wtedy, gdy glukoza jest na wyczerpaniu. Wyraźne nagromadzenie trehalozy w komórce drożdżowej można osiągnąć podczas stacjonarnej fazy wzrostu w wyniku silnej aeracji, bądź suplementacji pożywki maltozą lub galaktozą, jako jedynymi źródłami węgla. W przypadku maltozy, nagromadzanie się trehalozy zachodzi w sposób ciągły, przez całą fazę logarytmicznego wzrostu [Hohmann, 2002; Elbein i in., 2003]. Kumulacja trehalozy może przebiegać również w warunkach braku proliferacji, na przykład w środowisku zawierającym glukozę, ale z limitacją źródła azotu [Panek & Matton, 1977]). Ponadto, wywoływanie różnego rodzaju stresów, jak ekstremalnych temperatur (wysokich i stanu mrożenia), bądź dehydratacji osmotycznej (odwodnienie), zwiększa w komórkach Saccharomyces sp. poziom trehalozy [Hottiger i in., 1987a,b; Panek i in., 1990]. Stwierdzono istotną korelację pomiędzy zawartością trehalozy a odpornością na ww. formy stresu. Można powiedzieć, że metabolizm trehalozy w drożdżach jest wskaźnikiem stresu hodowlanego. Studia nad rolą trehalozy w odporności Saccharomyces sp. na warunki dehydratacyjne wykazały, że efektywne zatrzymywanie rozpuszczalnych substancji w cytoplazmie w trakcie suszenia, wymagało obecności trehalozy po obu stronach podwójnej warstwy membrany fosfolipidowej [Crowe & Crowe, 1986; Eleutherio i in., 1993; Mansure i in., 1994]. Tak więc wysoki endogenny poziom trehalozy wzmaga odporność komórki drożdżowej na odwodnienie, ale wówczas, gdy zwiększona jest ilość trehalozy egzogennej. Zewnętrzna trehaloza jest transportowana do wewnętrza komórki za pomocą specyficznego przenośnika, który być może, odgrywa równie istotną rolę przy przenoszeniu trehalozy wewnątrzkomórkowej na zewnątrz błony, tj. do środowiska hodowlanego, podczas cyklu rehydratacji [Eleutherio i in., 1993; Laroche & Gervais, 8

9 2003]. Obecność trehalozy chroni również drożdże przed utleniaczami, wpływającymi stresująco na stan fizjologiczny mikroorganizmu [Herdeiro i in., 2006]. Nagromadzona, endogenna trehaloza w komórce drożdżowej może być hydrolizowana do glukozy przez enzymy (jako prekursory), trehalazę V i tehalazę C (trehalaza, EC ), zlokalizowane w wakuoli. Połączenie magnezu z ATP (Mg- ATP) w obecności camp, wywołuje nie tylko aktywację tych enzymów, lecz inicjuje również ich przenoszenie do cytozolu, a konkretnie do wodniczek [Valle i in., 1986; Elbein i in., 2003]. Komórki drożdży w buforze octanowym przy ph 5.5 mają zdeaktywowaną trehalazę V [Panek & Souza, 1964]. Ponadto, obecność 0.1 mm ZnCl 2 [Londesborough & Varimo, 1984; Crowe i in., 1987], czy 1 mm EDTA [Panek & Souza, 1964], lub 50 mm MgCl 2 [Panek & Souza, 1964; Londesborough & Varimo, 1984] w zawiesinie komórek Saccharomyces sp. kompletnie hamuje aktywność trehalazy C. Stąd endogenna trehaloza mogłaby być zachowana przez użycie buforu o ph 5.5, z jedną z ww. substancji. Ponadto, w warunkach szoku cieplnego (np. podwyższona temperatura hodowli, czy mrożenie kultur drożdżowych), ewentualnie szoku dehydracyjnego (mrożenie, suszenie, obecność podwyżonego poziomu etanolu), dodatek około 100 mm egzogennej trehalozy działa stabilizująco na błonę komórkową, tj. na jej podwójną warstwę fosfolipidową [Crowe i in., 1987; Andre i in., 1991; Mansure i in., 1994]. W warunkach silnej dehydratacji osmotycznej, np. podczas fermentacji alkoholowej w zagęszczonych brzeczkach, niejednokrotnie obserwuje się skutki perforacji błony i wycieku zawartości komórki (efekt lizy) [Hohmann, 2002; Elbein i in., 2003]. Równie wiele badań wiąże się z poznaniem mechanizmu tolerancji drożdży na etanol [np. D Amore i in., 1987 ; Jimenez i in., 1987]. Stwierdzono, że fosfolipidy błony cytoplazmatycznej oraz podwyższony w niej poziom jednonienasyconych kwasów tłuszowych, jak kwas oleinowy, determinują alkoholooporność. Suplementacja środowiska fermentacyjnego określonymi nienasyconymi kwasami tłuszczowymi, witaminami, białkami i niezbędnymi związkami mineralnymi wyraźnie podwyższa tolerancję alkoholową drożdży, natomiast wzrost temperatury i ciśnienia osmotycznego w pożywkach sprzyja nagromadzeniu się wewnątrzkomórkowego etanolu, a tym samym zmniejszaniu alkoholooporności. 9

10 W wyniku cytologicznych badań in vitro [Crowe i in., 1987] oraz in vivo [Eleuthrio i in., 1993; Mansure i in., 1994] stwierdzono, że funkcją podstawową trehalozy w drożdżach nie jest jedynie kumulacja materiału zapasowego w postaci źródła węgla. Trehalozie przypisuje się również rolę osłaniającą w stosunku do błony komórkowej, zbudowanej z podwójnej warstwy fosfolipidowej, inkrustowanej białkami (Rys. 5 i 6). Rys. 5. Trzy różne spojrzenia na błonę (membranę) cytoplazmatyczną drożdży Saccharomyces sp. [Zellbiologie für Bioinformatiker, SoSe 2005]. Rys. 6. Komputerowy model lipoproteiny membranowej w postaci tzw. nanodysku [Beckmann Institute, University of Illinois]. 10

11 W związku z powyższym opracowano metody stabilizacji cechy osmofilności w drożdżach Saccharomyces sp. (patrz Załączniki 1-4), które opisano w artykule [Salek & Arnold, 1995] i w patencie [United States Patent ]. W drożdżach Saccharomyces cerevisiae cecha osmofilności zależy nie tylko od wewnątrzkomórkowego stężenia trehalozy, lecz także od glicerolu, który, jak stwierdzono stabilizuje natywne formy białek enzymatycznych w warunkach stresu osmotycznego. Tak więc, trehaloza i glicerol są przyjęte jako regulatory wewnątrzkomórkowego ciśnienia osmotycznego [Hohmann, 2002; Zancan & Sola- Penna, 2005]. Cechę osmofilności, a więc zawartość trehalozy czy glicerolu można też regulować genetycznie [Hohmann, 2002; Motshwene i in., 2004 ]. W tym celu wykorzystano na przykład fakt, że trehaloza gromadzi się w drożdżach po szoku cieplnym, w wyniku czego syntetyzowane są specyficzne białka hsps (heat shock proteins), pełniące rolę ochronną dla komórki w przypadku narażenia jej na ekstremalne temperatury [Panek, 1975; Elliott i in., 1996; Motshwene i in., 2004]. Stwierdzono, że poziom trehalozy jest wyraźnie skorelowany z cechą tolerancji na podwyższoną, bądź obniżoną temperaturę, sugerując, że trehaloza to nie tylko czynnik osmoochronny, lecz także termoochronny, zapewniający komórce zarówno osmofilność, jak również termotolerancję i termooporność w warunkach stresu fizycznego lub chemicznego [Plesset i in., 1982; Hottiger i in., 1987a; Hottiger i in., 1987b; Hottiger i in., 1989; Hottiger i in., 1992; Virgilio i in., 1994; Elliott i in., 1996]. Zmian genetycznych w przemysłowych szczepach drożdży Saccharomyces cerevisiae można dokonywać na drodze mutacji, hybrydyzacji, bądź transformacji. Punktem zainteresowania są geny odpowiedzialne za syntezę neutralnej trehalazy oraz syntazy/fosfatazy trehalozy-6-fosforanu (TPS i TPP). Enzymy te tworzą kompleks i przy udziale UDP-glukozy przekształcają glukozę-6-fosforan do trehalozy (Rys. 7) [Bell i in., 1998]. Delecja lub unieczynnienie genu TPS1 (sekwencja open reading frame, ORF, 1485 bp) czy genu TPS2, wchodzących w skład kompleksu genetycznego syntazy trehalozy-6-fosforanu (TPS) oraz fosfatazy trehalozy-6-fosforanu (TPP), powoduje niezdolność gromadzenia trehalozy przez komórkę po łagodnym szoku cieplnym, bowiem syntaza trehalozy-6-fosforanu (białko o masie 630 kda) jest kluczowym 11

12 enzymem w biosyntezie trehalozy, izolowanym z wakuoli komórek drożdżowych, pozbawionych proteaz. Rys. 7. Biosynteza trehalozy [Elliot i in., 1996]. Stwierdzono, że gen TPR1, jako podjednostka kompleksu genetycznego syntazy trehalozy-6-fosforanu, pełni rolę centralnego regulatora metabolizmu węglowodanów w drożdżach i jest konieczny oraz wystarczający dla wzrostu komórek na glukozie i fruktozie. Inaktywacja innych genów, np. TPS2, całkowicie hamuje aktywność genu fosfatazy trehalozy-6-fosforanu (TPP). Tak więc delecja obu podjednostek genetycznych (TPS1 i TPS2), a w szczególności TPS1 destabilizuje kompleks syntazy trehalozy. Oprócz problemów bioinżynieryjnych, jakie pojawiają się w browarnictwie podczas modyfikacji technologicznych z użyciem brzeczek HG, z jednoczesną suplementacją wybranymi związkami mineralnymi (magnezu, cynku, potasu i sodu), czy 12

13 witaminami (bityną), istnieje konieczność otrzymania i dostosowania do nowych warunków odpowiednich szczepów drożdży osmofilnych lub jednocześnie osmoaktywnych i alkoholoopornych. O dużej aktualności problemu świadczą liczne prace nad otrzymywaniem odpowiednich krzyżówek drożdży. Mówi się także o wyszukiwaniu bardziej skutecznych metod selekcji, adaptacji i rekombinacji genetycznej. Często stanowią one splot technik klasycznej mikrobiologii i genetyki, których efekt działania jest sprawdzany stopniowo, począwszy od skali laboratoryjnej, poprzez mikrotechniczną, aż do przemysłowej. Literatura Albrecht Ch., Keil P., Chalupka W., A new approach for the control of baker s yeast fed-batch fermentation, 1988, 4 th Int. Congress on Computer Applications in Fermentation Technology, England. Andre L., Hemming A., Adler L., Osmoregulation in Saccharomyces cerevisiae, 1991, FEBS, 286: Bell W., Sun W., Hohmann S., Wera S., et al., Composition and functional analysis of the Saccharomyces cerevisie trehalose synthase complex, 1998, The Journal of Biol. Chemistry, 273 (50): Bottema C.D.K., McLean-Bowen C.A., Parks L.W., Role of sterol structure in the thermotropic behaviour of plasma membranes of Saccharomyces cerevisiae, 1983, Biochim. et Biophys. Acta, 734 : Converti A., Perego P., Lodi A., A kinetic study of Saccharomyces strains: performance at high sugar concentrations, 1984, Biotechnol. & Bioeng., 27 (8): Crowe J.H., Crowe L.M., Jackson S.A., Preservation of structural and functional activity in lyophilized sarcoplasmic reticulum, 1983, Arch Biochem. Biophys., 220: Crowe J.H., Crowe L.M., Chapman D., Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms: The role of trehalose, 1984, Science, 223 (4637): Crowe L.M., Crowe J.H., Membranes, Metabolism and Dry Organisms (Leopold A.C., ed.), 1986, , Cornell University Press, New York. Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F., Wistrom A.C., Stabilisation of dry phospholipids bilayers and proteins by sugars, 1987, Biochemical Journal, 242:1-10. Dafour J.P., Goffeau A., Transport actif de metabolites dans la cellule de levure pendant la fermentation : Quelle est la force qui permet le transport actif dans la levure et comment est-elle cree, 1987, BIOS, 18 (4) :12. D Amore T., Stewart G.G., Ethanol tolerance of yeast, 1987, Enzyme and Microbial Technology, 9 (6): Elbein A.D., Pan Y.T., Pastuszak I., Carroll D., New insights on trehalose: a multifunctional molecule, 2003, Glycobiology, 13 (4):17R-27R. 13

14 Eleutherio E.C.A., Araujo P.S., Panek A.D., Role of the trehalose carrier in dehydration resistance of Saccharomyces cerevisiae 1993, Biochim. et Biophys. Acta, 1156: Elliott B., Haltiwanger R.S., Futcher B., Synergy between trehalose and Hsp104 for termotolerance in Saccharomyces cerevisiae, 1996, Genetics, 144: Grba S., Oura E., Suomalainen H., On the formation of glycogen and trehalose in baker s yeast, 1976, J. of Appl. Microbiol.,2 (1): Herdeiro R.S., Pereira M.D., Panek A.D., Eleutherio E.C.A., Trehalose protects Saccharomyces cerevisiae from lipid peroxidation during oxidative stress, 2006, Biochimica et Biophysica Acta, 1760 (3): Hino A., Mihara K., Nakashima K., Takano H., Trehalose levels and survival ratio of freeze-tolerant versus freeze-sensitive yeasts, 1990, Appl. Environ. Microbiol., Hohmann S., Osmotic stress signalling and osmoadaptation in yeast, 2002, Microbiol. and Molecular Biology Reviews, Hottiger T., Schmutz P., Wiemken A., Heat-induced accumulation and futile cycling of trehalose in Saccharomyces cerevisiae, 1987a, J. Bacteriol., 169: Hottiger T., Boller T., Wiemken A., Rapid changes of heat and desiccation tolerance correlated with changes of trehalose content in Saccharomyces cerevisiae cells subjected to temperature shifts, 1987b, FEBS Letters, 220: Hottiger T., Boller T., Wiemken A., Correlation of trehalose content and heat resistance in yeast mutants altered in the RAS/adenylate cyclase pathway: is trehalose a thermoprotectant?, 1989, FEBS letters, 225: Hottiger T., de Virgilio C., Bell W., Boller T., Wiemken A., HSP70 promotes recovery from thermal stress and negatively regulates trehalose levels in heat-shocked cells of Saccharomyces cerevisiae, 1992, Yeast, 8 special Issue, Abstract 1-56A. Jimenez J., Benitez T., A adaptation of yeast cell membranes to ethanol, 1987, Appl. Environ. Microbiol., 53: Laroche C., Gervais P., Achievment of rapid osmotic dehydration at specific temperatures could maintain high Saccharomyces cerevisiae viability, 2003, 60: de Lima Paulillo S.C., Yokoya F., Basso L.C., Mobilization of endogenous glycogen and trehalose of industrial yeasts, 2003, Brazilian Journal of Microbiology, 34: Londesborough J., Varimo K., Characterization of two trehalase in baker's yeast, 1984, Biochem. J., 219: Mansure J.J.C., Panek A.D., Crowe L.M., Crowe J.H., Trehalose inhibits ethanol effects on intact yeast cells and liposomes, 1994, Biochimica et Biophysica Acta, 1191: Motshwene P., Karreman R., Kgari G., Brandt W., Lindsey G., LEA-like protein Hsp 12 (heat-shock protein 12) is present in the cell wall and enhances the barotolerance of yeast Saccharomyces cerevisiae, 2004, Biochem. J., 377: Nagel M., Hefepropagation mit High-Gravity Würzen, 2004, Department für Lebensmittel und Ernährung, Technische Universität München. Othake S., Schebor C., de Pablo J., Effects of trehalose on the phase behavior of DPPC-cholesterol unilamellar vesicles, 2006, Biochim. Biophys. Acta, 1758 (1):

15 Panek A.D., Souza N.O., Purification and properties of baker's yeast trehalase, 1964, J. Biol. Chem., 239: Panek A., Trehalose synthesis during starvation of baker s yeast, 1975, J. Appl. Microbiol., 2: Panek A.D., Matton J.R., Regulation of energy metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Relationship between catabolite repression, trehalose synthesis, and mitochondrial development, 1977, Arch. of Biochem. and Biophysics, 183: Panek A.C., Bernardes E., Panek A.D., Membrane metabolism and dry organisms, 1986, Ed. Leopold A.C., Cornell University Press, New York, Panek A.C., Mansure J.J., Paschoalin V.M.F., Panek A.D., Regulation of trehalose metabolism in Saccharomyces cerevisiae mutants during temperature shifts, 1990, Biochemie, 72: Patent USA: United States Patent Pereira C.S., Lins R.D., Chandrasekhar I., Freitas L.C.G., Hünenberger P.H., Interaction of the disaccharide trehalose with a phosphlipid bilayer: A molecular dynamics study, 2004, Biophysical Journal, 86: Plesset J., Palm C., Mc Langhlin C.S., Induction of heat shock proteins and thermotolerance by ethanol in Saccharomyces cerevisiae, 1982, Biochem. Biophys. Res. Com., 108: Poreda A., Oddziaływanie wybranych jonów metali na fermentację brzeczki piwnej, 2006, Praca doktorska, Akademia Rolnicza, Kraków. Poreda A., Antkiewicz P., Makarewicz M., Jony metali, ich rola i regulacja wewnątrzkomórkowego stężenia w drożdżach piwowarskich, 2007, Materiały z XII Szkoły Technologii Fermentacji, Wrocław. Reed G., Nagodawithana T.W., Yeast Technology, 1991, An AVI Book. Published by Van Nostrand Reinhold. Rodrigues-Pousada C., Nevitt T., Menezes R., The yeast stress response: Role of the Yap family of b-zip transcription factors, 2005, FEBS Journal, 272 : Rose A.H., Symposium on over production of microbial products (FEMS), 1981, Hradec Kralove. Salek A., Arnold W.M., Obtaining and testing osmophilic yeasts, 1994, Chemie, Mikrobiologie, Technologie der Lebensmittel, Nr. 1-2, Salek A., Arnold M., Trehalose-stabilisation of osmophilicity and viability of baker s and distiler s yeast: Applications to storage and drying, 1995, Chemie, Mikrobiologie, Technologie der Lebensmittel, Nr. 1-2, Sampedro J.G., Munoz-Clares R.A., Uribe S., Trehalose-mediated inhibition of the plasma membrane H + - ATPase from Kluyveromyces lactis: Dependence on viscosity and temperature, 2002, Journal of Bacteriology, Skibinsky A., Venable R., Pastor R.W., A molecular dynamics study of the response of lipid bilayers and monolayers to trehalose, 2005, Biophysical Journal, 89: Suomalainen H., Pfiffli S., Changes in the carbohydrate reserves of baker's yeast during growth and on standing, 1961, J. Inst. Brew., 67:

16 Tang M., Waring A.J.,Hong M., Trehalose-protected lipid membranes for dtermining membrane protein structure and insertion, 2007, Journal of Magnetic Resonance, 184: Valle E., Bergillos L., Gascon S., Parpa F., Ramos S., Trehalase activation in yeast is mediated by an internal acidification, 1986, Europ. J. Biochem., 154: Vido K., Spector D., Lagniel G., Lopez S., Toledano M.B., Labarre J., A proteome analysis of the cadmium response in Saccharomyces cerevisiae, 2001, J. Biol. Chem., 276: de Virgilio C., Hottiger T., Dominguez J., Boller T., Wiemken A., The role of trehalose for the acquisition of thermotolerance in yeast. I. Genetic evidence that trehalose is a thermoprotectant, Eur. J. Biochem., 219: Winkler K., Kienle I., Burgert M., Wagner J.C., Holzer H., Metabolic regulation of the trehalose content of vegetative yeast, 1991, FEBS, 291: Zancan P., Sola-Penna M., Trehalose and glycerol stabilize and renature yeast inorganic pyrophosphatase inactivated by very high temperatures, 2005, Arch. Biochem. Biophys., 444 (1):

17 Załącznik 1. Izolacja ofmofilnych drożdży Saccharomyces cerevisiae.

18 Załącznik 2. Schemat izolacji alkoholoopornych szczepów drożdży.

19 Załącznik 3. Przygotowanie inoculum do izolacji i selekcji osmofilnych klonów drożdży Saccharomyces cerevisiae.

20 Załącznik 4. Schemat przygotowania inoculum osmofilnych drożdży Saccharomyces cerevisie. Badanie wzrostu biomasy w brzeczkach o wysokim stężeniu (HG).