Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA izolowanego z różnych materiałów

Transkrypt

1 Rocznik Świętokrzyski. Ser. B Nauki Przyr. 35: 9 20, 2014 Polska Akademia Nauk Oddział w Krakowie, Kieleckie Towarzystwo Naukowe Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA izolowanego z różnych materiałów 16S rrna sequences used to identification of bacterial DNA isolated from various materials WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK 1, MONIKA WAWSZCZAK 2 Summary. The aim of this study was the genetic analysis of two different material. The whole DNA was isolated from the air filter, located in Integrated Environmental Monitoring Station on Swiety Krzyz in the Swietokrzyskie Mountains. The second sample of whole DNA was obtained from sludge. Total DNA was extracted by two method temperature isolation and column isolation kit. Genetic analysis revealed presence only Eubacteria. The confirmation of the presence of Archaea can be possible during further optimization of the used techniques. Presented results confirmed that air filters and sludge are the useful materials to isolate bacterial DNA to identification and to look for microorganisms which could possess some unique factors for adapt to environment. Air filters or sludge can be use to metagenomic analysis of microorganisms present in different environment, especially to the identification of uncultured bacteria from environment. Słowa kluczowe: metagenomika, 16S rrna, PCR, Eubacteria, Archaea Key words: metagenomics, 16S rrna, PCR, Eubacteria, Archaea 1 Wioletta Adamus-Białek, Katedra Ochrony i Kształtowania Środowiska, Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach, ul. Świętokrzyska 15, Kielce, wioletta.adamus-bialek@ ujk.edu.pl. 2 Monika Wawszczak, Studia magisterskie Biotechnologia, Instytut Chemii, Uniwersytet Jana Kochanowskiego w Kielcach, ul. Świętokrzyska 15, Kielce.

2 10 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK Wprowadzenie Diagnostyka mikrobiologiczna obejmuje szereg metod służących do identyfikacji mikroorganizmów w złożonych ekosystemach (Bal 2001). Różnią się one m.in. powtarzalnością uzyskiwanych wyników czy wymaganym nakładem pracy. Ich wspólnym zadaniem jest jak najbardziej precyzyjne określenie struktury populacji, która tworzy dany ekosystem (Libudzisz i in. 2007). Metody te można podzielić na konwencjonalne i niekonwencjonalne. Metody konwencjonalne, wykorzystujące hodowle mikroorganizmów, polegają na oznaczeniu cech fenotypowych komórek drobnoustrojów. Metody niekonwencjonalne wykorzystują techniki biologii molekularnej do oznaczenia cech genotypowych, bez konieczności prowadzenia wstępnej hodowli (Libudzisz i in. 2007, Schmidt, Relman 1994, Więckowicz 2009). Metagenomka to zaawansowana dziedzina nauki zajmująca się badaniem mikroorganizmów, która w swojej pracy pomija proces hodowli bakterii. Zakres jej badań to genomika środowiskowa, ekogenomika lub genomika populacji drobnoustrojów (Freeland 2008). Zasadniczą różnicą między standardową mikrobiologią a ekogenomiką jest to, że genomika środowiskowa polega na klonowaniu kwasu dezoksyrybonukleinowego pobranego bezpośrednio z naturalnego środowiska oraz w kolejnym etapie sekwencjonowaniu pokaźnych bibliotek genomowych. Mikrobiologia jako dziedzina nauki jest ukierunkowana na prowadzenie badań nad poszczególnymi rodzajami bakterii. Minusem takiego podejścia jest to, że badania mogą być prowadzone na bakteriach, które można wyhodować i obserwować pod mikroskopem. Takie podejście daje nam tylko połowiczne możliwości zdobycia wiedzy, gdyż ogromna ilość drobnoustrojów wykazuje ekspresję genów specyficznych dla swego gatunku w naturalnym środowisku życia w populacji, często w postaci biofilmów (Błaszczyk 2009). Metagenomika daje nam możliwość zbadania całych genomów reprezentujących populacje mikrobów żyjących w swym naturalnym środowisku, co pozwala na pominięcie etapu ich hodowli w warunkach laboratoryjnych. Wszelkiego rodzaju prace metagenomiczne opierają się na schemacie złożonym z czterech podstawowych etapów. Pierwszym z nich i bardzo istotnym etapem jest wyizolowanie DNA. Próbki badawcze, pobierane z naturalnych środowisk, zawierają materiał DNA pochodzący od różnych gatunków organizmów. Proces izolacji DNA musi być dostosowany do rodzaju prowadzonych badań. W powszechnym użytku stosuje się metody fizyczne (bonifikacja), a także chemiczne (utworzenie silnie alkalicznych warunków). Wyizolowane całkowite DNA można poddać wielu technikom badawczym w celu określenia różnorodnych właściwości i cech badanego lub badanych organizmów. Jedną z bardziej popularnych metod jest analiza restrykcyjna całkowitego DNA i porównywanie uzyskanych fragmentów DNA. Poszczególne fragmenty DNA można wklonować w wektory, które

3 Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA 11 dzięki zdolności do autoreplikacji można wprowadzić do tzw. organizmu modelowego (np. E. coli). Komórki, które uległy procesowi transformacji zostają poddane hodowli. Wszystkie nowo powstałe komórki posiadają identyczny rodzaj metagenomowego kwasu dezoksyrybonukleinowego, który podlega dokładnym analizom genetycznym (sekwencjonowanie) w celu otrzymania biblioteki genomowej (Baj, Markiewicz 2006, Schmidt, Relman 1994). Biologia molekularna już od dawna pełni ważną rolę w taksonomii drobnoustrojów. Największe zasługi w tej dziedzinie przypisuje się głównie badaniu enzymatycznych białek oraz kwasów nukleinowych. W zależności od rodzaju analizy i makrocząsteczki (białko strukturalne, białko enzymatyczne, DNA, RNA) uzyskuje się wyniki o różnym stopniu przydatności. Niektóre metody służą do szybkiej identyfikacji drobnoustrojów najczęściej do celów klinicznych a inne, bardziej pracochłonne, wykorzystywane są do szczegółowej analizy powiązań filogenetycznych (Krawczyk, Kur 2008, Schmidt, Relman 1994). W technikach diagnostycznych i epidemiologicznych dużą uwagę koncentruje się na różnicowaniu genomowego DNA (Adamus-Bialek i in. 2009). Analizy tego typu często oparte są na stabilnych sekwencjach DNA, takich jak geny kodujące produkty białkowe, które mają istotne znaczenie w metabolizmie bakterii (tzw. housekeeping genes) lub sekwencje wysoce konserwatywne, specyficzne dla każdego gatunku bakterii. Do poszukiwania takich charakterystycznych sekwencji w genomie bakterii wykorzystuje się sondy genetyczne o wysoce konserwatywnych sekwencjach lub oligonulkoetydowe fragmenty DNA, tzw. startery, flankujące poszukiwaną sekwencję fragmentu genu, amplifikowaną w trakcie reakcji PCR (Clarridge 2004). Zastosowanie techniki PCR oraz wielu jej modyfikacji umożliwia powielenie w zasadzie każdego znanego pod względem sekwencji fragmentu DNA. Czułość i swoistość amplifikowanego fragmentu DNA zwiększa dokładna znajomość jego sekwencji, co jest istotne w przypadku zastosowania tej metody w diagnostyce mikrobiologicznej. Reakcje PCR są wykorzystywane do identyfikacji genów kodujących lekooporność lub czynniki patogenności bez konieczności hodowli niebezpiecznych dla zdrowia patogenów. Globalny serwer genetyczny, jakim jest Gene Bank, pozwala na analizę porównawczą całych genomów bakteryjnych w kontekście do szczepów referencyjnych lub planować ich różnicowanie. W tym celu najczęściej stosuje się analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Często również porównuje się zróżnicowanie produktów amplifikacji fragmentów DNA, stosując startery hybrydyzujące jedynie z ograniczoną liczbą wybranych sekwencji. W chromosomach wielu drobnoustrojów, również patogennych, stwierdzono obecność rozproszonych sekwencji powtórzonych lub sekwencji inercyjnych występujących w określonej i ograniczonej liczbie. Sekwencje

4 12 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK te znalazły zastosowanie jako sekwencje docelowe dla sond genetycznych lub starterów amplifikujących obszary ich obecności podczas reakcji PCR (Baj, Markiewicz 2006, Bal 2001, Krawczyk, Kur 2008). Materiał badawczy Materiały i metody Materiałem wykorzystanym do badań były 2 filtry powietrza krążki PTFE (politetrafluoroetylen; teflon) absorbujące pył powietrza, o wymiarach 54 mm/0,1 mm, równoważna średnica porów to 0,1 mikrometra. Badane filtry umieszczane były uprzednio w analizatorze o sile zasysania powietrza l/miesiąc na wysokości 30 m od gruntu w Stacji Monitoringu Katedry Ochrony i Kształtowania Środowiska na Świętym Krzyżu. Po okresie 1 miesiąca filtry były umieszczane w sterylnej szalce Petriego w celu dalszych badań w laboratorium. Materiał badawczy pochodził z okresu zimowo-wiosennego. Wykorzystano także dwie różne próby osadu czynnego, otrzymanego z oczyszczalni ścieków przed procesem oczyszczania (osad mokry) i po procesie oczyszczania (osad suchy). Podłoża, odczynniki Sterylny płyn fizjologiczny (0,85% NaCl), sterylna woda dejonizowana, zestaw do izolacji kolumienkowej genomowego bakteryjnego DNA (Qiagen), zestaw do reakcji PCR: polimeraza Taq (Fermentas), bufor do polimerazy Taq (Fermentas), oligonukleotydowe startery (tab. 1), deoxynukleotydowe trifosforany (datp, dgtp, dctp i dttp) (Fermentas), matryca genomowego DNA, ultraczysta woda 3D, zestaw do elektroforezy: bufor do rozdziału elektroforetycznego 1x stężony TAE, agaroza (Serva) 1%, roztwór bromku etydyny (0,5 µg/ml), wzorzec mas DNA ( bp, DNA Gdańsk). Sprzęt Pipety automatyczne, końcówki do pipet (Eppendorf), łaźnia wodna, mikrowirówka (Eppendorf), termocykler (Biometra),

5 Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA 13 aparat do elektroforezy BIO-RAD, transiluminator UV (G-Box, Syngene). Tabela 1. Oligonukleotydowe startery zastosowane w badaniach, oznaczenia sekwencji K = G lub T; M = A lub C; R = A lub G; W = A lub T, pz pary zasad (Lane i in. 1985, Leffers, Garrett 1984) Table 1. Description of primers used in the studies, sequence marks: K = G or T, M = A or C, R = A or G, W = A or T, bp base pair, (Lane et al. 1985, Leffers, Garrett 1984) Nazwa Name Com1 Com2 1100A 1A Sekwencja nukleotydów (5-3 ) Oligonucleotide sequence (5-3 ) CAGCNGCCGCG- GTAATWC CCGTCAATTC- MTTTRAGTTT TGGGTCTCGCTC- GTTG TCYGKTTGATC- CYGSCRGAG Temperatura mięknięcia (ºC) Melting temperature (ºC) Wielkość produktu reakcji PCR (pz) Size of amplicons (bp) Amplifikowany region Region ampified 52,6 54,9 401 fragment genu kodującego16s 43,6 47,7 rrna Eubacteria 48, fragment genu kodującego 16S 51,8 60 rrna Archaea Metody badań Izolacja DNA metodą termiczną z osadu czynnego: Materiał badawczy stanowiły próbki osadu czynnego (suchego i mokrego). Próbkę materiału zawieszano w 500 μl sterylnej wody. Przygotowaną zawiesinę poddawano ogrzewaniu przez 7 minut w 100ºC. Lizat wirowano przez 5 minut w 10 tys. obrotów/min. Tak otrzymany supernatant zbierano do osobnej probówki i zamrażano w 20ºC. Uzyskany materiał posłużył jako matrycowy DNA, wyizolowany z mikroorganizmów badanego osadu czynnego. Izolacja DNA metodą termiczną z filtrów powietrza: Filtry badawcze rozdrabniano i umieszczano w probówkach typu Eppendorf. Następnie do probówki dodawano 1 ml 0,85-procentowego NaCl i wytrząsano przez dwie godziny. Po opadnięciu fragmentów filtra na dno probówki supernatant odsączano do osobnej probówki i ogrzewano przez 5 minut w 100ºC. Lizat wirowano przez 3 minuty w 10 tys. obrotów/min. Uzyskany supernatant zbierano do osobnej probówki i mrożono w 20ºC jako materiał DNA wyizolowany z drobnoustrojów filtra badawczego.

6 14 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK Izolacja kolumienkowa genomowego bakteryjnego DNA: Filtr badawczy rozdrabniano i umieszczano w probówce typu Eppendorf. Następnie do probówki dodawano 1 ml 0,85-procentowego NaCl i wytrząsano przez dwie godziny. Po opadnięciu fragmentów filtra na dno probówki supernatant odsączano do osobnej probówki i poddawano dalszym etapom według instrukcji producenta zestawu (Qiagen). Identyfikacja bakterii należących do Eubacteria techniką reakcji amplifikacji PCR fragmentu genu 16S rrna: Technika PCR po uprzednim zoptymalizowaniu na podstawie danych źródłowych (Lane i in. 1985, Macrae 2000, Clarridge 2004) została przeprowadzona w celu wykrycia fragmentu genu kodującego podjednostkę rybosomu 16S rrna specyficzną dla Eubacteria. Reakcję amplifikacji poszukiwanych fragmentów DNA przeprowadzono w objętości 50 µl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 5 µl 10x stężonego buforu do polimerazy, 1 µl 10 pmol każdego startera (com1, com2), 1 µl zawierający mieszaninę 0,2 mm każdego deoxynukleotydowego trifosforanu (datp, dgtp, dctp i dttp), 3 µl matrycy genomowego DNA oraz 1 jednostkę polimerazy Taq. Zawartość mieszaniny reakcyjnej uzupełniano ultraczystą wodą do objętości 50 µl. Warunki reakcji amplifikacji zostały przeprowadzone w kolejnych etapach, rozpoczynając 3-minutową denaturacją w 94ºC, następnie 35 cykli: 94ºC przez 1 minutę, 55ºC przez 0,5 minuty i 72ºC przez 3 minuty, końcowym etapem była 5-minutowa elongacja w 72ºC. Identyfikacja bakterii należących do Archaea techniką reakcji amplifikacji PCR fragmentu genu 16 s rrna: Technika PCR po uprzednim zoptymalizowaniu na podstawie danych źródłowych (Leffers, Garret 1984, Macrae 2000, Clarridge 2004) została przeprowadzona w celu wykrycia fragmentu genu kodującego podjednostkę rybosomu 16S rrna specyficzną dla Archaea. Reakcję amplifikacji poszukiwanych fragmentów DNA przeprowadzano w objętości 50 µl mieszaniny reakcyjnej, zawierającej 10 µl 10x stężonego buforu do polimerazy, 1 µl 10 pmol każdego startera (1A, 1100A), 1 µl zawierający mieszaninę 0,2 mm każdego deoxynukleotydowego trifosforanu (datp, dgtp, dctp i dttp), 3 µl matrycy genomowego DNA oraz 1 jednostkę polimerazy Taq (Fermentas). Zawartość mieszaniny reakcyjnej uzupełniano ultraczystą wodą do objętości 50 µl. Warunki reakcji amplifikacji zostały przeprowadzone w kolejnych etapach, rozpoczynając 30-sekundową denaturacją w 98ºC, następnie 35 cykli: 98ºC przez 15 sekund, 55ºC przez 30 sekund i 72ºC przez 60 sekund, końcowym etapem była 5-minutowa elongacja w 72ºC. Analiza produktów amplifikacji PCR techniką elektroforezy w żelu agarozowym: Uzyskane produkty amplifikacji oraz wzorzec mas DNA nanoszone były na 1,5-procentowy żel agarozowy zanurzony w 1x stężonym buforze TAE, pod wpływem napięcia 100 V. Po upływie około 40 minut żel płukano w roztworze bromku etydyny, a następnie obserwowano w świetle UV i fotografowano.

7 Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA 15 Wyniki i dyskusja Celem pracy była analiza genetyczna DNA wyizolowanego z osadu czynnego oraz z wkładek filtracyjnych asymilujących powietrze z wysokości 30 m od gruntu na Stacji Monitoringu Katedry Ochrony i Kształtowania Środowiska UJK na Świętym Krzyżu. W pierwszym etapie przeprowadzono izolację DNA bakteryjnego z materiału badawczego (osad czynny, wkładki filtrujące) dwoma różnymi metodami. Metodą PCR dokonano analizy DNA pod względem występowania sekwencji 16S rrna specyficznych dla bakterii należących do Archaea i Eubacteria (Macrae 2000). Identyfikacja mikroorganizmów metodą amplifikacji 16S rrna jest jedną z technik biologii molekularnej (Schmidt, Relman 1994). Oparta jest na analizie genu kodującego podjednostkę rybosomu 16S rrna (Bąkowska 2005). Cząsteczka ta jest obok 21 białek (S1 S21) zasadniczym elementem składu małej podjednostki 30S. Natomiast 30S stanowi jedną z dwóch podjednostek budujących rybosom prokariotyczny. Struktura 16S rrna obejmuje w swoim składzie 4 domeny: 3 większa, 5 centralna i 3 mniejsza (Bąkowska 2005). Ze względu na małą zmienność genów 16S rrna analiza tych sekwencji pozwala na identyfikację składu gatunkowego bakterii występujących w danym środowisku (Clarridge 2004, Deja-Sikora 2007). Gen kodujący 16S rrna jest obecny u wszystkich organizmów prokariotycznych, a stopień zróżnicowania jego sekwencji rośnie ze wzrostem dystansu filogenetycznego między badanymi mikroorganizmami, dlatego też pozwala to na precyzyjne określenie udziału danego drobnoustroju w klasyfikacji gatunkowej, rodzajowej, a także i szczepowej. DNA bakterii, które koduje rrna, zbudowane jest z operonu rrn, a jego poszczególnymi składowymi są trzy geny kodujące kolejno: 16S, 23S oraz 5S RNA. Liczba operonów jest różna i uzależniona od gatunku danej bakterii, np. Escherichia coli posiada 7 kopii operonu rrn, a znacznie więcej spotyka się np. u Bacillus subtilis. Sekwencja nukleotydowa tych genów może posiadać fragmenty o wysokim stopniu zakonserwowania, które można wykorzystać do hybrydyzacji z obszarami DNA identycznych genów innych grup bakterii. Ponadto reakcja PCR pozwala na amplifikację regionu zmiennego wewnątrz genu kodującego 16S rrna, jak również na amplifikację regionu zmiennego między genami kodującymi 16S i 23S rrna, poprzez zastosowanie starterów o sekwencji regionu 3 genu 16S i stałego regionu 5 genu 23S RNA (Clarridge 2004, Raszka i in. 2009). Badaniom poddano 2 filtry pochodzące z okresu zimowego oraz wiosennego oraz dwie próbki osadu czynnego (tzw. osad mokry i osad suchy). Uzyskano potwierdzenie obecności bakterii należących tylko do Eubacteria (ryc. 1, ryc. 2). W przypadku filtra powietrza (ryc. 1) oznaczenia 1a, 2a, 3a dotyczyły DNA izolowanego metodą kolumienkową z filtra zimowego, a oznaczenia 4a i 5a dotyczyły DNA izolowanego metodą termiczną. Oznaczenia 1b, 2b, 3b dotyczyły DNA izolowanego metodą kolumienkową

8 16 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK z filtra wiosennego, a oznaczenia 4b i 5b dotyczyły DNA izolowanego metodą termiczną. Produkty na rycinie 2 oznaczone jako 1 stanowiły próbki osadu mokrego, natomiast produkty o oznaczeniu 2 pochodziły z próbek osadu suchego, a izolacja metodą kolumienkową, b, c izolacja DNA metodą termiczną. Obie metody izolacji DNA dały wynik pozytywny, ponadto reakcje PCR przeprowadzone na DNA izolowanym metodą termiczną pozwoliły uniknąć produktów niespecyficznych reakcji. Izolacja DNA metodą termiczną daje zazwyczaj większą wydajność otrzymywanej ilości DNA, ale o znacznie gorszej czystości. W przypadku identyfikacji gatunków poprzez sekwencje 16S rrna termiczna izolacja DNA wydaje się bardziej przydatna. Duża ilość DNA jest tracona podczas jego oczyszczania w kolumnie, co może negatywnie wpływać na poziom wykrywalności gatunków podczas sekwencjonowania sklonowanych produktów reakcji PCR. Z drugiej strony termiczna izolacja DNA jest prawdopodobnie niewystarczająca do izolacji gatunków należących do Archaea ze względu na skomplikowaną budowę ściany komórkowej. Można także przypuszczać, że izolacja DNA metodą kolumienkową także nie jest dostosowana do Archaea. Ze względu na brak kontroli pozytywnej można jedynie przypuszczać, że w analizowanym filtrze 401 pz Ryc. 1. Elektroforeza żelowa produktów reakcji PCR specyficznej dla genu 16s rrna Eubacteria otrzymanych z próbek DNA wyizolowanych z filtra powietrza, wz wzorzec mas DNA pz Fig. 1. Gel electrophoresis of the PCR products specific for 16S rrna Eubacteria gene obtained from DNA samples isolated from the air filter, wz molecular weight marker 100 bp ladder Ryc. 2. Elektroforeza żelowa produktów reakcji PCR specyficznej dla genu 16s rrna Archaea i Eubacteria otrzymanych z próbek DNA wyizolowanych z osadu czynnego, wz wzorzec mas DNA pz Fig. 2. Gel electrophoresis of the PCR products specific for 16S rrna Archaea and Eubacteria gene obtained from DNA samples isolated from the active sludge, wz molecular weight marker 100 bp ladder

9 Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA 17 powietrza nie występowały Archaea, co jest prawdopodobne. Ta grupa bakterii występuje w specyficznych miejscach o skrajnych wymaganiach środowiskowych, jak np. temperatura powyżej 100ºC, wysokie zasolenie czy obecność metanu (Kołwzan 2005). Z drugiej strony nietypowa budowa chemiczna ściany komórkowej mogła być powodem negatywnej izolacji DNA, co uniemożliwiło amplifikację oczekiwanych produktów w reakcji PCR. Z pewnością metoda PCR jest jedną z najlepszych technik w identyfikacji tej grupy organizmów (Krawczyk 2008). Podstawową zaletą techniki PCR, dzięki której uzyskała ona rzeszę zwolenników podczas prac nad identyfikacją drobnoustrojów, jest pominięcie etapu hodowli, dzięki czemu możliwa jest identyfikacja wszystkich drobnoustrojów znajdujących się w materiale badawczym. Na podłożach mikrobiologicznych w hodowli in vitro nie jest możliwe zidentyfikowanie wszystkich drobnoustrojów. Izolacja genomowego DNA bezpośrednio z materiału badawczego filtr membranowy, osad czynny pozwoliła wyizolować wystarczającej jakości materiał genetyczny przeznaczony do dalszej analizy PCR. Uzyskane wyniki z prowadzonych badań pozwoliły zidentyfikować w materiale badawczym bakterie wyłącznie należące do podkrólestwa Eubacteria. Produkty powstałe wyniku reakcji PCR mogą należeć do różnorodnych gatunków bakterii obecnych w materiale badawczym. Identyfikację gatunkową bakterii z produktu PCR można przeprowadzić poprzez proces klonowania do wektora plazmidowego, a następnie jego transformację do organizmu modelowego, jak np. E. coli. Po izolacji plazmidów następuje sekwencjonowanie rozdzielonych i wyizolowanych fragmentów DNA. Uzyskany produkt amplifikacji DNA to dobry materiał do identyfikacji gatunkowej bakterii wyizolowanych z pyłu badawczego powietrza zebranego na filtrze lub z osadu czynnego. Tego typu badania mogą być wykorzystane w poszukiwaniu drobnoustrojów o niezwykłych właściwościach adaptacyjnych (Krawczyk, Kur 2008, Raszka 2009). Stosowanie metod molekularnych w celu identyfikacji mikroorganizmów potwierdziło swoją wyższość nad metodami hodowlanymi (Kołwzan i in. 2005, Raszka 2009). Niehodowlane metody diagnostyki mikrobiologicznej charakteryzują się szybszą procedurą prowadzenia badań oraz dużą dokładnością w badaniu przynależności taksonomicznej organizmów (Więckowicz 2009). Najczęściej stosowane techniki bazują w ogromnym stopniu na analizie puli genowej. Przedstawiona wyżej analiza genowa odbywa się zazwyczaj in situ. Najczęściej prowadzi się analizę mającą na celu zidentyfikowanie bakterii, opierając się na dokładnym zidentyfikowaniu rdna, a w szczególności z genu kodującego 16S rrna. Dzisiejsze techniki badań molekularnych pozwalają określić przebieg ewolucji jaka następowała u mikrobów, ponadto techniki molekularne są zdolne do wykrywania wyselekcjonowanych mikroorganizmów w danym środowisku (Dixon i in. 2005). Metagenomika wykorzystywana jest obecnie w wielu dziedzinach naukowych. Znajduje swe zastosowanie m.in. w ekologii poprzez stosowanie analizy sekwencji genu

10 18 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK 16S rdna do identyfikacji mikroorganizmów glebowych (Deja-Sikora i in. 2007). W ten sposób pozwala na określenie funkcji, jakie pełnią one w środowisku glebowym. Ponadto z metagenomów glebowych wyizolowane zostały geny odpowiedzialne za syntezę nowego antybiotyku (turbomycyn A i B). Warte uwagi jest również to, że skonstruowane ogromne biblioteki metagenomowe pozwalają na otrzymanie enzymów, tj. pektynaz, lipaz czy dehydrogenaz (Krasowska, Łukaszewicz 2011). Poza mikroflorą środowiska glebowego analizie metagenomicznej poddane zostały organizmy występujące m.in. w osadzie czynnym oraz wodach morskich. Przykładowo sekwencjonowanie mikroorganizmów pochodzących z Morza Sargassowego było jak dotąd największym z przeprowadzonych analiz metagenomicznych (Venter i in. 2004). Metagenomika wykorzystywana jest także w badaniach ekologicznych, interakcji organizmów i ich środowiska. W dziedzinie ochrony środowiska umożliwia odkrycie nowych gatunków bakterii oraz badanie bioróżnorodności ekosystemów (Krasowska, Łukaszewicz 2011, Raszka i in. 2009). Ekogenomika w inżynierii środowiskowej wzbudziła wiele oczekiwań. Daje możliwości na wyszukanie nowych przydatnych enzymów, białek o właściwościach leczniczych (Nesce, Simonet 2014, Saylers, Witt 2003). Wobec tego coraz częściej posługuje się nią w technologii żywności, do badań nad składem i właściwościami dzikorosnących gatunków roślin (Wagner, Loy 2002). Dlatego właśnie zastosowanie metagenomiki potwierdziło, że jest ona doskonałą metodą do identyfikacji materiału genetycznego mikroorganizmów pobieranych wprost z naturalnych środowisk, bez konieczności ich hodowli w warunkach laboratoryjnych. Podsumowanie Zamierzeniem niniejszej pracy była próba optymalizacji metody izolacji bakteryjnego, genomowego DNA ze złożonego ekosystemu na przykładzie osadu czynnego i filtru asymilującego zanieczyszczenia powietrza. Zastosowano prostą metodę termicznej izolacji DNA w porównaniu z komercyjnym zestawem izolacji DNA metodą kolumienkową. Obydwie metody były skuteczne w przypadku identyfikacji bakterii należących do Eubacteria. Metoda termiczna okazała się ponadto szybszą i tańszą techniką izolacji całościowego, bakteryjnego DNA z tak złożonego materiału, jakim jest osad czynny czy filtr powietrza. Zidentyfikowana obecność Eubacteria dowodzi o ich powszechnym występowaniu w każdej biocenozie. Jest to również potwierdzenie odpowiednio przeprowadzonej izolacji materiału genetycznego. Wskazuje to także na możliwość stosowania jej w analizie złożonych ekosystemów pod względem ich składu gatunkowego. Ponadto istnieje szansa wykorzystania w przyszłości pozyskanego produktu amplifikacji PCR, specyficznego wobec Eubacteria do identyfikacji gatunkowej bakterii, wyizolowanych z badanych materiałów. Tę identyfikację gatunkową bakterii

11 Zastosowanie sekwencji 16S rrna w identyfikacji bakteryjnego DNA 19 z uzyskanych produktów reakcji PCR można otrzymać w procesie klonowania i kolejno sekwencjonowania rozdzielonych fragmentów materiału genetycznego. W pracy podjęto również próbę identyfikacji bakterii Archaea, wynik jednak okazał się negatywny. Może to świadczyć o niewystępowaniu w badanych materiałach tej grupy mikroorganizmów. Przyczyną mogło być również niewystarczające zoptymalizowanie warunków reakcji łańcuchowej polimerazy lub izolacji DNA. Prezentowane wyniki badań są propozycją kontynuowania i poszerzenia tego typu badań o identyfikację gatunkową mikroorganizmów występujących w badanych materiałach. Podziękowanie Projekt został sfinansowany ze środków na działalność statutową działalność celowa dla młodej kadry, nr: Acknowledgement The project was funded by statutory activities purposeful activities for young staff, no: Literatura Adamus-Bialek W., Wojtasik A., Majchrzak M., Sosnowski M., Parniewski P., 2009: (CGG)4-Based PCR as a Novel Tool for Discrimination of Uropathogenic Escherichia coli Strains: Comparison with Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-PCR, Journal of Clinical Microbiology, vol. 47, s Baj J., Markiewicz Z., 2006: Biologia molekularna bakterii, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. Bal J., 2001: Biologia molekularna w medycynie, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. Bąkowska K., 2005: Funkcja wybranych fragmentów 16S rrna małej podjednostki rybosomalnej w procesie biosyntezy białka, Biotechnologia vol. 2(69), s Błaszczyk M.K., 2009: Mikroorganizmy w ochronie środowiska, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa. Clarridge J.E., 2004: Impact of 16 S rrna Gene Sequence Analysis for Identification of Bacteria, Clinical Microbiology and Infectious Diseases, vol. 17(4). Deja Sikora E., Sikora M., Gołębiewski M., Tretyn A.,2007: Biblioteki metagenomowe jako źródło genów przydatnych w biotechnologii, Biotechnologia vol. 4(79), s , Dixon D., Jenkins I., Moody R., Zhuravlev A., 2005: Encyklopedia ewolucji, Wydawnictwo Debit, Bielsko-Biała, s Freeland J.R., 2008: Ekologia molekularna, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s

12 20 WIOLETTA ADAMUS-BIAŁEK, MONIKA WAWSZCZAK Krasowska A., Łukaszewicz M., 2011: Izolacja, identyfikacja oraz aktywność proteolityczna i lipolityczna mikroorganizmów arktycznych, Acta Sci. Pol., Biotechnologia 10(1), s Kołwzan B., Adamiak W., Grabas K., Pawełczyk A., 2005: Podstawy mikrobiologii w ochronie środowiska, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław. Krawczyk B., Kur J., 2008: Diagnostyka molekularna w mikrobiologii, Wydawnictwo Politechniki Gdańskiej, Gdańsk. Lane D.J., Pace B., Olsen G.J., Stahl D.A., Sogin M.L., Pace N.R., 1985: Rapid determination of 16S ribosomal RNA sequences for phylogenetic analyses, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 82, s Leffers H., Garrett R.A, 1984: The nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene of the archaebacterium Halococcus morrhua, The EMBO Journal, vol. 3(7), s Libudzisz Z., Kowal K., Żakowska Z., 2007: Mikrobiologia techniczna mikroorganizmy i środowiska ich występowania, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s Macrae A., 2000: The use of 16s rdna methods in soil microbial ecology, Brazilian Journal of Microbiology, 2000, vol. 31, s Nesme J., Simonet P., 2014: The soil resistome: a critical review on antibiotic resistance origins, ecology and dissemination potential in telluric bacteria, Environ. Microbiol. doi: / Raszka A., Ziembińska A., Wiechetek A., 2009: Metody i techniki biologii molekularnej w biotechnologii środowiskowej, Czasopismo techniczne Środowisko, Wydawnictwo Politechniki Krakowskiej, Kraków, vol. 2, s Saylers A.A., Witt Dixie D., 2003: Mikrobiologia: Różnorodność, chorobotwórczość i środowisko, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, s Schmidt T.M., Relman D.A., 1994: Phylogenetic identification of uncultured pathogens using ribosomal RNA sequences, Methods Enzymol. vol. 235, s Wagner M., Loy A., 2002: Bacterial community composition and function in sewage treatment system, Current Opinion Biotechnol., s Watson J.D., Berry A., 2005: DNA Tajemnica życia, Wydawnictwo CiS, Warszawa, s Więckowicz M., 2009: Molekularne metody identyfikacji drobnoustrojów w złożonych ekosystemach, Postępy Mikrobiologii, vol. 1, s Venter J.C., Remington K., Heidelberg J.F., Halpern A.L., Rusch D., Eisen J.A., Wu D., Paulsen I., Nelson K.E., Nelson W., Fouts D.E., Levy S., Knap A.H., Lomas M.W., Nealson K., White O., Peterson J., Hoffinan J., Parson R., Baden-Tilson H., Pfannkoch C., Rogers Y.H., Smith H.O., 2004: Enviromental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea, Science, vol. 304,