Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej na ich przeŝycie i potencjał proliferacyjny

Transkrypt

1 PRACA ORYGINALNA Original Article Acta Haematologica Polonica 2009, 40, Nr 3, str KRZYSZTOF ILNICKI, ELśBIETA URBANOWSKA 1 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej na ich przeŝycie i potencjał proliferacyjny Impact of the long term storage temperature on survival and proliferative potential of the cord blood nuclear cells Z Zakładu Genetyki, Centrum Zdrowia Dziecka w Warszawie Kierownik: Prof. dr hab. Małgorzata Krajewska-Walasek 1 Z Katedry i Kliniki Hematologii, Onkologii i Chorób Wewnętrznych Warszawskiego Uniwersytetu Medycznego Kierownik: Prof. dr hab. W.W. Jędrzejczak STRESZCZENIE Tematem pracy jest ocena przechowywania przez okres 4 lat komórek jądrowych krwi pępowinowej w ogólnie dostępnej zamraŝarce mechanicznej ( 80ºC) i fazie ciekłej ciekłego azotu ( 196ºC) oraz wpływ takiego sposobu przechowywania na ich właściwości klonogenne. Wydaje się, Ŝe główną przyczyną zmniejszania liczby Ŝywych komórek obdarzonych zdolnością tworzenia kolonii krwiotwórczych jest temperatura przechowywania komórek, a dopiero następną w kolejności zmniejszanie się liczby komórek jądrowych wskutek aglutynacji, w zaleŝności od ich początkowego stęŝenia w próbce. Nie stwierdzono jednak, by zamraŝanie komórek jądrowych krwi pępowinowej w wysokich stęŝeniach oddziaływało wybiórczo na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w obrębie komórek jądrowych pozostających w zawiesinie uŝytej po rozmroŝeniu do hodowli. Przechowywanie zamroŝonych komórek jądrowych w stabilnej temperaturze 196ºC fazy ciekłej, ciekłego azotu jest znacząco bardziej wydajne niŝ przechowywanie w zamraŝarce udostępnionej do ogólnego uŝytku. SŁOWA KLUCZOWE: Krew pępowinowa Kriokonserwacja Potencjał proliferacyjny komórek jądrowych SUMMARY The aim of this work was to evaluate the result of the 4 years period of the umbilical cord blood nuclear cells in the general purpose laboratory mechanical freezer ( 80ºC) as well as in the liquid phase of the liquid nitrogen ( 196ºC). It was detected the impact of such storage conditions on survival and proliferative potential of these cells. It seems probable, that the main reason of diminution of the pool of clonogenic cells is the temperature of storage. The secondary reason is agglutination of these cells as a consequence of their initial concentration in the freezed probe. However, it was not observed, that the freezing process of the nuclear cells have had some effect on the enrichment or specific diminution of the pool of CFC that remain in the suspension after thawing. Storage of the cryopreserved nuclear cells in the stable temperature of liquid phase of

2 706 K. ILNICKI i wsp. liquid nitrogen (-196ºC) seems to be significantly more effective than the storage in the general purpose mechanical freezer. KEY WORDS: Cord blood Cryopreservation Proliferative potential of nuclear cells WSTĘP Pierwsze udane zabiegi przeszczepienia krwi pępowinowej wykazały, Ŝe pojedyncza jednostka takiej krwi zawiera wystarczającą liczbę komórek krwiotwórczych, pozwalającą na odnowę krwiotworzenia biorcy. Czynniki takie, jak wyŝsza aktywność proliferacyjna komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej w porównaniu do komórek szpiku, ich odpornościowa niedojrzałość, łatwiejszy dobór dawcy i biorcy oraz praktycznie nieograniczony dostęp do niej spowodowały wzrost zainteresowania tym źródłem komórek krwiotwórczych do przeszczepienia. Procedurę pozyskiwania i preparowania komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej moŝna podzielić na następujące etapy: pobranie krwi pępowinowej, oddzielenie komórek jądrowych od erytrocytów, granulocytów i płytek krwi, zagęszczenie zawiesiny komórek jądrowych, wśród których są obecne komórki krwiotwórcze, krioprezerwację tych komórek, ich przechowywanie oraz rozmroŝenie z ewentualnym usunięciem krioprotektora. Od momentu zamroŝenia krwi pępowinowej do wydania do przeszczepienia, musi być ona przechowywana w temperaturze kriogenicznej. Klasycznie, temperaturą do przechowywania zamroŝonego materiału komórkowego jest temperatura ciekłego azotu ( 196 C), która pozwala na wieloletnie przechowywanie takiego materiału i pozostaje bez ujemnego wpływu na aktywność proliferacyjną komórek krwiotwórczych [1]. Komórki krwiotwórcze mogą być równieŝ przechowywane w temperaturze zamraŝarki mechanicznej ( 80 C) [2], co nie wymaga stałego uzupełniania odparowanego ciekłego azotu, tak jak musi to być dokonywane w metodzie poprzedniej. Dodatkowo, zewnętrzne powierzchnie pojemników krioochronnych nie są obmywane przez ciekły azot, który moŝe ułatwiać rozprzestrzenianie zakaŝeń (np. wirusowych) pomiędzy pojemnikami. Przed przeszczepieniem biorcy krew pępowinowa dotychczas przechowywana w zamroŝeniu musi zostać rozmroŝona. Regułą jest bardzo szybkie rozmroŝenie porcji zawiesiny komórek poprzez krótkotrwałe (minuty) ogrzanie w łaźni wodnej o temperaturze C [3, 4] Spowolnienie takiego tempa rozmraŝania przez np. kilkugodzinne rozmraŝanie w temperaturze +4 C obniŝa Ŝywotność komórek jądrowych i liczbę tworzonych przez nie kolonii krwiotwórczych. Czynnikami branymi pod uwagę w kwalifikacji jednostki krwi pępowinowej do przeszczepienia jest nie tylko liczba komórek jądrowych, ale takŝe liczba kolonii krwiotwórczych wskazujące na wielkość potencjału proliferacyjnego komórek hematopoetycznych. Nie ma jednak wystarczającej liczby badań porównujących wpływ długotrwałego (wieloletniego) przechowywania komórek krwiotwórczych krwi pępowinowej w ciekłym azocie i w zamraŝarce mechanicznej na właściwości klonogenne tych komórek. Dlatego celem naszej pracy było porównanie przechowywania przez okres 4 lat wyizolowanych i zamroŝonych komórek krwiotwórczych krwi pępowino-

3 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania 707 wej w temperaturze fazy ciekłej ciekłego azotu ( C) i w ogólnie dostępnej laboratoryjnej, pionowej zamraŝarce mechanicznej ( 80 0 C). MATERIAŁ I METODY Pracę wykonano na 60 porcjach krwi pępowinowej pobranej w trakcie porodów rozwiązywanych siłami natury. Określano objętość zebranej krwi oraz liczono bezwzględną liczbę komórek jądrowych (za pomocą analizatora hematologicznego Cell Dyna 1700 firmy Abbott). Izolacja, zamraŝanie i rozmraŝanie komórek jądrowych krwi pępowinowej Na Gradisol L nawarstwiano krew pępowinową i wirowano przy 1000 g. przez 20 minut, a następnie zbierano frakcję leukocytarną. Otrzymane komórki płukano, zawieszano w podłoŝu Iscove a, liczono oraz określano ich Ŝywotność metodą wchłaniania błękitu trypanu oceniając odsetek komórek, które nie wchłonęły barwnika. Otrzymane w wyniku rozdziału komórki jądrowe zawieszano w płodowej surowicy cielęcej w stęŝeniach 50; 20; 10 i 5 mln/ml i przenoszono do fiolek do krioprezerwacji (Nalge Nunc Int.), a następnie dodawano podłoŝe do mroŝenia, tak aby końcowe stęŝenie DMSO wynosiło 7,5%. ZamraŜanie prowadzono zgodnie ze schematem zamraŝania komórek jądrowych krwi. Połowę zamroŝonych próbek z kaŝdej grupy przenoszono do ogólnie dostępnej laboratoryjnej, pionowej zamraŝarki mechanicznej firmy Revco (temp 80 C), Pozostały materiał komórkowy przenoszono do kriostatu firmy Taylor- Wharton i umieszczano w fazie ciekłej, ciekłego azotu (temp. 196 C). Czas przechowywania wynosił 4 lata. Po upływie tego czasu, próbkę po wyjęciu z ciekłego azotu lub zamraŝarki, rozmraŝano w łaźni wodnej w temp. 37 C nieustannie mieszając. Po rozmroŝeniu, do ampułki dodawano kroplami podłoŝe Iscove a z dodatkiem 10% płodowej surowicy cielęcej (Gibco Ltd). W rozmroŝonej zawiesinie określano liczbę komórek jądrowych oraz ich Ŝywotność. Badanie liczby komórek krwiotwórczych tworzących kolonie in vitro Do podłoŝa z metylcelulozą (MethoCult H 4433 Stem Cell Technologies) dodawano zawiesinę komórek w podłoŝu Iscove a z dodatkiem płodowej surowicy cielęcej. Otrzymaną mieszaninę rozlewano do dwóch płytek testowych (Nalge Nunc). Po inkubacji odczytywano liczbę wyrośniętych kolonii krwiotwórczych na nasadzonych komórek. Kolonie krwiotwórcze klasyfikowano według kryteriów opracowanych przez Sutherland i wsp. [5]. Wynik był średnią z odczytu z 2 płytek. Otrzymane wartości przedstawiano jako średnie ± odchylenie standardowe. Porównania pomiędzy grupami przeprowadzano stosując test t Studenta, a wartości p poniŝej 0,05 uznawano za znamienne statystycznie.

4 708 K. ILNICKI i wsp. WYNIKI 1. Wpływ przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej w temperaturze ciekłego azotu ( 196 C) i zamraŝarki mechanicznej ( 80 C) na parametry fizjologiczne tych komórek. a. Ŝywotność komórek Po przechowywaniu komórek jądrowych w ciekłym azocie i ich rozmroŝeniu, Ŝywotność tych komórek wynosiła 82,5±7%, natomiast po przechowywaniu w zamraŝarce i rozmroŝeniu Ŝywotność wynosiła 48,9 ±15%. RóŜnica w odsetku przeŝycia tych komórek w zaleŝności od temperatury przechowywania (między grupami ( 196 C i 80 C) była statystycznie znamienna. Rycina 1 ilustruje wpływ temperatury przechowywania na Ŝywotność komórek jądrowych po ich rozmroŝeniu śywotność (%) p= 0, temperatura C - 80 C Ryc. 1. Wpływ temperatury przechowywania na Ŝywotność komórek jądrowych Fig. 1. Influence of the storage temperature on the viability of the nuclear cells b. Odsetek odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze Liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w próbkach przechowywanych w ciekłym azocie, po rozmroŝeniu wyniosła 82 ± 15% w stosunku do liczby tych komórek w materiale nie poddanym krioprezerwacji, natomiast liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w próbkach przechowywanych w zamraŝarce wyniosła 45 ± 16%. RóŜnica w odsetku odzysku komórek w zaleŝności od temperatury przechowywania jest statystycznie znamienna. Na Rycinie 2 przedstawiono wpływ temperatury przechowywania na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po rozmro- Ŝeniu.

5 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania 709 odsetek liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze temperatura p = 0, C - 80 C Ryc. 2. Wpływ temperatury przechowywania na tworzenie kolonii przez komórki tworzące kolonie hematopoetyczne Fig. 2. Influence of storage temperature on the colonies formation by the hematopoietic colony forming cells 2. Wpływ temperatury C i 80 0 C na odsetek odzysku rozmraŝanych komórek jądrowych uprzednio zamroŝonych w róŝnych stęŝeniach. Odsetek odzysku komórek jądrowych po rozmroŝeniu zmniejszał się wraz ze wzrostem stęŝenia tych komórek przechowywanych zarówno w ciekłym azocie jak i w zamraŝarce. RóŜnice w odzysku pomiędzy grupą I (5 mln/ml) i IV (50 mln/ml) były znamienne statystycznie w odniesieniu do materiału przechowywanego w zamraŝarce (Rycina 3). 3. Wpływ temperatur C i 80 0 C na odsetek odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. Populacje rozmroŝonych komórek jądrowych, które były przechowywane w ciekłym azocie prezentują zbliŝone wartości odsetka odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na hodowanych komórek, niezaleŝnie od ich stęŝenia w próbce. Podobna zbieŝność wyników dotyczy równieŝ populacji komórek przechowywanych w zamraŝarce. Rycina 4 ilustruje wpływ stęŝenia izolowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej, krioprezerwowanych i przechowywanych w ciekłym azocie lub zamraŝarce po rozmroŝeniu, na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. JednakŜe, odsetek odzysku liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w populacji przechowywanej w temperaturze ciekłego azotu był znamiennie wyŝszy niŝ odsetek odzysku tych komórek w populacji przechowywanej w zamraŝarce, niezaleŝnie od stęŝenia komórek w próbce. Wyjściowa liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze wynosiła 140±85 na komórek jądrowych i ± 8000 na

6 710 K. ILNICKI i wsp. 1 ml zawiesiny tych komórek. Obserwowano ponad dwukrotny spadek liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze na komórek jądrowych pozostających w zawiesinie, w próbkach przechowywanych w zamraŝarce, w porównaniu do próbek przechowywanych w ciekłym azocie odsetek liczby komórek jądrowych P=0, stęŝenie komórek 5mln/ml 10 mln/ml 20mln/ml 50mln/ml Komórki przechowywane w temp C Komórki przechowywane w temp C Ryc. 3. Wpływ temperatury 196 C i 80 C na odsetek odzysku rozmraŝanych komórek jądrowych, zamraŝanych w róŝnych stęŝeniach Fig. 3. Influence of the temperatures 196 C and 80 C on the percentage of recuperation of thawed nuclear cells, frozen in different concentrations

7 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania odsetek liczby komórek tworzacych kolonie krwiotwórcze stęŝenie komórek P=0,05384 p = 0,0441 P= 0,0485 P= 0,0362 5mln/ml 10mln/ml 20mln/ml 50mln/ml Komórki przechowywane w temp C Komórki przechowywane w temp C Ryc. 4. Wpływ stęŝenia krioprezerwowanych komórek jądrowych przechowywanych w ciekłym azocie lub w zamraŝarce na odsetek odzysku komórek tworzących kolonie krwiotwórcze po ich rozmroŝeniu (na komórek pozostających w zawiesinie). Fig. 4. Influence of concentrations of the cryopreserved nuclear cells stored in liquid nitrogen and freezer on the percentage of recuperation of the colony forming cells after thawing (per cells that remain in the suspension). OMÓWIENIE WYNIKÓW Krew pępowinowa przechowywana w bankach krwi pępowinowej stanowi cenne uzupełnienie rejestrów szpiku. Do efektywnego przeszczepienia krwi pępowinowej zapewniającej trwałą odnowę układu krwiotwórczego wymagana jest infuzja co najmniej /kg m.c. biorcy komórek jądrowych, wśród których są obecne komórki krwiotwórcze [6]. Czynności, które obejmują wyizolowanie komórek jądrowych z krwi pępowinowej, ich przechowywanie i rozmraŝanie muszą być wykonywane w taki sposób, aby gwarantowały najmniejsze ich straty, zarówno w czasie obróbki, jak teŝ i wieloletniego przechowywania. Jest to o tyle istotne, Ŝe zwykle pobiera się niewielką

8 712 K. ILNICKI i wsp. objętość krwi pępowinowej (ok. 80 do 150 ml), zawierającą ograniczoną liczbę komórek krwiotwórczych, która wystarcza do ustanowienia krwiotworzenia u dzieci, ale jest niewystarczającą do odtworzenia układu krwiotwórczego u biorców dorosłych. W tym ostatnim przypadku dokonuje się przeszczepienia dwóch lub więcej jednostek krwi pępowinowej [7]. Konieczne jest więc zastosowanie nie tylko wydajnych metod preparowania krwi pępowinowej, ale takŝe takich sposobów krioprezerwacji i przechowywania wyizolowanych komórek jądrowych, aby ich odzysk i potencjał proliferacyjny do celów przeszczepienia był jak najwyŝszy. Warunki krioprezerwacji komórek jądrowych krwi pępowinowej. W obecnej pracy uŝyto dwumetylosulfotlenku (DMSO) jako krioprotektora w stę- Ŝeniu 7,5% w podłoŝu zawierającym 80% surowicy cielęcej płodowej. Almici i wsp. [8] i wielu innych autorów stosuje wyŝsze (10%) stęŝenie DMSO, natomiast Galmes i wsp. [9] stosowali niŝsze (5%) stęŝenie DMSO. Ahmed i wsp. [10] stosowali mieszaninę 5% DMSO i 6% HES. Ballint i wsp. [11] wykazali, Ŝe wyŝsze stęŝenie DMSO jest optymalne dla krioprezerwacji bardziej niedojrzałych komórek krwiotwórczych, natomiast niŝsze dla komórek juŝ zróŝnicowanych (CFU-GM). Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania komórek jądrowych krwi pępowinowej na ich przeŝycie. Krioprezerwowany materiał przechowywano w ciekłym azocie w temp C oraz w zamraŝarce w temp. 80 C. śywotność komórek jądrowych mierzona pochłanianiem błękitu trypanu wynosiła po przechowywaniu w ciekłym azocie ponad 80%, natomiast po przechowywaniu w zamraŝarce niecałe 50%. Simon i wsp. (12) uzyskali wyŝsze wyniki przeŝycia (ok. 80%) krioprezerwowanych limfocytów przechowywanych w zamraŝarce. Stiff i wsp. [13] uzyskali wynik przeŝycia 70% komórek szpiku zamroŝonych w mieszaninie DMSO i HES po 14 miesiącach przechowywania w temperaturze 80 C. Był to wynik lepszy od wyniku przeŝycia (50%) komórek szpiku zamroŝonych w tych samych warunkach i przechowywanych w temp. 170 C przez okres sześciu miesięcy. Makino i wsp. [14] uzyskali 90% przeŝycia komórek krwiotwórczych pobranych drogą aferezy z krwi obwodowej a następnie zamroŝonych w mieszaninie DMSO i HES, które przechowywano przez okres 3 miesięcy w temp. -80 C. Feremans i wsp. [15] uzyskali 75% przeŝycia komórek z krwi obwodowej, zamroŝonych w obecności mieszanimy DMSO i HES, przechowywanych do 65 dni w -80 C. Galmes i wsp. [9] uzyskali 90% przeŝycia komórek krwi obwodowej pozyskanych w powyŝszy sposób, zamroŝonych w obecności 10% DMSO i przechowywanych przez jeden miesiąc. Ratajczak i wsp. [16] uzyskali 84% przeŝycie komórek szpiku mroŝonych w obecności 10% DMSO, przechowywanych w temp. 80 C. Był to wynik lepszy od wartości odsetka przeŝycia (76%) tych komórek mroŝonych w identyczny sposób, lecz przechowywanych w ciekłym azocie. Przytoczone powyŝej wyniki nie są zgodne z wynikami uzyskanymi w obecnej pracy. Jeszcze wyraźniej ta niezgodność jest zaakcentowana w przypadkach, w których

9 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania 713 porównywane jest przechowywanie materiału komórkowego w ciekłym azocie i zamraŝarce (9; 16). Wytłumaczeniem tej niezgodności moŝe być sposób przechowywania zamroŝonego materiału. Autorzy poniŝszej pracy wykorzystywali do tych celów pionową zamraŝarkę firmy Revco przeznaczoną do ogólnego uŝytku w laboratorium. ZamraŜarka pionowa tym zasadniczo róŝni się od zamraŝarki poziomej (z klapą poziomą umieszczoną na szczycie), Ŝe w momencie otwarcia całe, bardziej gęste i zimne powietrze wypływa z niej i jest zastępowane powietrzem ciepłym, o mniejszej gęstości. Niewiele w tym względzie pomocny jest podział wnętrza komory na indywidualnie zamykane sekcje. Umieszczony w takiej komorze materiał komórkowy podlega kilkakrotnie w ciągu dnia krótkotrwałym wahaniom temperatury, które wynikają z uŝytkowania zamraŝarki., a wahania takie mogą sięgać nawet kilkudziesięciu stopni Celsjusza. Nie są one rejestrowane przez urządzenia pomiarowo-kontrolne zamraŝarki wykazujące duŝą bezwładność. Przechowywany materiał podlega więc wielu cyklom zmian termicznych, zachodzących, co prawda w temperaturach poniŝej 0 C, ale mogących mieć destrukcyjny wpływ na zamroŝone struktury biologiczne komórek jądrowych. Rowley [17] równieŝ zwraca uwagę na destrukcyjny wpływ zmian termicznych zachodzących w kriostatach napełnionych ciekłym azotem, w których materiał umiejscowiony jest w fazie gazowej tego chłodziwa. Dobrym rozwiązaniem problemu zmian termicznych wydaje się być umieszczenie zamroŝonych próbek w pudełku ze styropianu lub poliuretanu przed jego umieszczeniem w zamraŝarce. Wpływ przechowywania krioprezerwowanego materiału w ciekłym azocie i zamraŝarce na liczbę tworzonych kolonii krwiotwórczych. Wyjściowa liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze wynosiła średnio: 142 ± 85 na komórek jądrowych. Jest to zgodne z wynikami uzyskanymi przez Briddella i wsp. [18]. Wpływ na ten znaczny rozrzut mogą mieć, poza zmiennością osobniczą, nawet niewielkie róŝnice w terminie porodu, chwili przecięcia naczyń pępowinowych w momencie pobrania krwi, dlatego Ŝe wahaniom ulega liczba komórek ukierunkowanych w krwi pępowinowej oraz w krwi noworodka. Liczba komórek tworzących kolonie krwiotwórcze zmienia się w tym okresie raptownie, na co wskazują wyniki Broxmeyera i wsp. [1]. Briddell i wsp. [18] określili pojęciem 0 day culture hodowlę komórek krwiotwórczych zainicjowaną w dniu wypreparowania frakcji komórek jądrowych, której wynik słuŝył następnie jako odniesienie do dalszych eksperymentów. Przechowywanie zamroŝonego materiału w ciekłym azocie i zamraŝarce powodowało zmniejszenie liczby komórek tworzących kolonie krwiotwórcze. Odzysk tych komórek wyniósł od 63 do 81% dla materiału przechowywanego w ciekłym azocie i od 20 do 45% dla materiału przechowywanego w zamraŝarce. Występowała duŝa zmienność wyników, ale róŝnice są statystycznie znamienne. W niektórych indywidualnych przypadkach stwierdzono w obecnej pracy większą liczbę kolonii w hodowlach z materiału rozmroŝonego po przechowywaniu w ciekłym azocie, niŝ w materiale wyjściowym nie mroŝonym nigdy nie miało to miejsca w przypadku materiału przechowywanego w zamraŝarce.

10 714 K. ILNICKI i wsp. Beaujean i wsp. [19] sugeruje moŝliwość eliminacji poprzez proces krioprezerwacji, komórek supresorowych i w konsekwencji zwiększenie potencjału klonogennego komórek macierzystych. Ale jednocześnie Nicol i wsp. [20] stwierdzili obniŝenie aktywności receptorów dla czynnika wzrostu (GM-CSF) w Ŝywych komórkach macierzystych bezpośrednio po rozmroŝeniu. Na tak duŝą, obserwowaną zmienność wyników miała więc z pewnością wpływ duŝa zmienność wyjściowa liczby kolonii w hodowlach zainicjowanych z materiału nie krioprezerwowanego, a ponadto nakładać się mogły inne, wzmiankowane wyŝej czynniki nie związane bezpośrednio z Ŝywotnością komórki. MoŜna przypuszczać, Ŝe czynniki te dotyczą materiału po krioprezerwacji. Wpływ metody rozmraŝania na liczbę, Ŝywotność i zdolność tworzenia kolonii krwiotwórczych przez komórki jądrowe krwi pępowinowej. Materiał przechowywany równolegle w ciekłym azocie w temperaturze -196 C oraz w zamraŝarce w temperaturze -80 C był rozmraŝany metodą klasyczną. Liczba komórek jądrowych po rozmroŝeniu była niŝsza, niŝ przed zamroŝeniem. Wyraźnie widoczny był wprost proporcjonalny wpływ wzrostu stęŝenia komórek poddanych krioprezerwacji na wielkość strat powstających przy rozmraŝaniu tą metodą (21). Obserwowane zjawisko dotyczyło w takim samym zakresie komórek przechowywanych w ciekłym azocie jak i w zamraŝarce. Podsumowując moŝna stwierdzić, Ŝe głównym czynnikiem sprawczym zmniejszania liczby Ŝywych komórek jądrowych zdolnych do tworzenia kolonii krwiotwórczych jest temperatura przechowywania komórek, a następnym w kolejności czynnikiem jest zmniejszanie liczby komórek jądrowych wskutek aglutynacji, w zaleŝności od początkowego stęŝenia tych komórek w zamroŝonej próbce. Ponadto, proces zamraŝania komórek jądrowych krwi pępowinowej w róŝnych stęŝeniach nie wpływa wybiórczo na odzysk komórek tworzących kolonie krwiotwórcze w obrębie puli komórek pozostających w zawiesinie uŝytej do hodowli. PIŚMIENNICTWO 1. Broxmeyer HE, Cooper S. High-efficiency recovery of immature hemopoietic progenitor cells with extensive proliferative capacity from human cord blood cryopreserved for 10 years. Clinical and Experimental Immunology 1997; 107 Suppl. 1: Paczkowska E. Freezing of umbilical cord blood cells in mechanical freezer ( 80ºC) Ann. Acad. Med Stettin. 2002; 48: Rowley S.D, Bensinger WI, Gooley TA, Buckner C.D. Effect of cell concentration on bone marrow and peripheral blood stem cell cryopreservation. Blood 1994; 83: Mikołajek W. Optimalisation for preparation and expansion of ex vivo human Umbilical Cord Blood cells for transplantation. Ann. Acad. Med Stettin. 2002; 48: Sutherland HJ, Eaves AC, Eaves C.J. Quantitative assays for human hematopoietic progenitor cella. Bone Marrow Processing and Purging. A Practical Guide Wyd: A.P.Gee, CRC Press Inc. 1991; Larghero J, Garcia J, Gluckmann E. Sources of procurement of stem cells In Haematopoietic Stem Cell Transplantation. The EBMT Handbook, 5-th Edition, p Jędrzejczak W.W, Rokicka M, Urbanowska E, Torosian T, Graczyk-Pol E, Tomaszewska A, Król M,Paluszewska M, Jołkowska J, Witt M. Simultaneous transplantation of two allogenic unit of cord

11 Wpływ temperatury długotrwałego przechowywania 715 blood in an adult patient with acute myeloblastic leukemia. A case report. Arch. Immunol. Ther. Exp. 2005; 53: Almici C, Carlo-Stella C, Wagner J.E, Mangoni L, Garau D, Re A, Giachetti R,Cesana C, Rizzoli V. Clonogenic capacity and ex vivo expansion potential of umbilical cord blood progenitor cells are not impaired by cryopreservation. Bone Marrow Transplantation 1997; 19: Galmes A, Besalduch J, Bargay J, Matamoros N, Morey M, Novo A, Sampol A. A simplified method for cryopreservation of hematopoietic stem cells with 80 C mechanical freezer with dimethyl sulfoxide as the sole cryoprotectant. Leukemia and Lymphoma 1995; 17: Ahmed T, Wuest D, Ciavarella D, Ayello J, Feldman E.J, Biguzzi S, Gulati S, Hussain F, Mittelman A, Ascensao J.L, Arlin Z.A. Marrow storage techniques: A clinical comparison of refrigeration versus cryopreservation. Acta Haematologica 1991; 85: Ballint B, Ivanovic Z, Petakov M, Taseki J, Jovcic G, Stojanovic N, Milenkovic P. The cryopreservation protocol optimal for progenitor recovery is not optimal for preservation of marrow repopulating ability. Bone Marrow Transplantation 1999; 23: Simon J.D.; Flinton L.J.; Albala M.M. A simple method for the cryopreservation of human lymphocytes at -80 C. Transfusion 1977; 17: Stiff P.J, Koestner A.R, Weidner M.K, Dvorak K, Fisher R.I. Autologous bone marrow transplantation using unfractionated cells cryopreserved in Dimethylsulfoxid and Hydroxyethyl starch without controlled-rate freezing. Blood 1987; 70: Makino S, Harada M, Akashi K, Taniguchi S, Schibuya T, Inaba S. A simplified method for cryopreservation of peripheral blood stem cells at -80 C without rate controlled freezing. Bone Marrow Transplantation 1991; 8: Feremans WW, Bastin G, Le moine F, Ravoet C, Delville C, Pradier O, Wallef G, Dupont E, Capel P, Lambermont M. Simplification of the blood stem cell transplantation (BSCT) procedure: large volume apheresis and uncontrolled rate cryopreservation at -80 C. European Journal of Hematology 1996; 56: Ratajczak M.Z.; Ratajczak J.; Kregenov D.A.; Kuczyński W.; Skórski T.;Gewirtz A.M. Cytokine stimulation of CD34+ bone marrow cells prior to cryopreservation enhances their post-thawing proliferative potential. Folia Histochemica et Cytobiologica 1994; 32: Rowley S.D. Hematopoietic stem cell cryopreservation. Hematopoietic Stem Cell Transplantation II Edition 1994; Briddell R, Kern B.P, Zilm KL, Stoney G.B, McNiece IK. Purification of CD34+ cells is essential for optimal ex vivo expansion of umbilical cord blood cells. Journal of Hematotherapy 1997; 6: Beaujean F, Bourhis J-H, Bayle C, Jouault H, Divine M, Rieux C, Janvier M, Le Forestier C, Pico J.L. Successful cryopreservation of purified autologous CD34+ cells: influence of freezing parameters on cell recovery and engraftment. Bone Marrow Transplantation 1998; 22: Nicol A, Nieda M, Donaldson C, Denning-Kendall P. Analysis of cord blood CD34+ cells after cryopreservation. Experimental Hematology 1995; 23: Ilnicki K, Urbanowska E. Występowanie zjawiska spontanicznej agregacji w preparatach kriokonserwowanych komórek jądrowych krwi pępowinowej. Acta Haematologica Polonica 2006; 37: Praca wpłynęła do Redakcji r. i została zakwalifikowana do druku r. Adres Autora: Krzysztof Ilnicki ul. Augustyna Kordeckiego 75/ Warszawa Tel