Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó

Transkrypt

1 PRACE PRZEGL DOWE Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó Anna Nadolska-Orczyk Zak³ad In ynierii Komórkowej i Transformacji, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin, Radzików Transgene expression and gene silencing in cereals Summary Adres do korespondencji Anna Nadolska-Orczyk, Zak³ad In ynierii Komórkowej i Transformacji, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roœlin, Radzików, B³onie; a.orczyk@ihar.edu.pl 4 (75) Genetic transformation of cereal crops is a powerful research tool for analysis of gene function and varietal improvement. Application of the method is possible when the expression of introduced transgene is on the desired level and stable over several generations. The production of transgenic cereals was mainly performed by microprojectile bombardment. However, some advance was also achieved by application of Agrobacterium-mediated transformation. For rice, which is the cereal model species, this method is routinely used, while for many others, especially polyploids, it has been developed very recently and only in a few laboratories. We still lack the knowledge whether the main features of Agro-mediated transformation (i.e. integration of one or few copies usually not rearranged and well defined transgene cassette) influence the transgene expression in polyploid cereal species. This review discusses known mechanisms possibly involved in transgene silencing, using both transformation methods. Part of the discussion is focused on transgene expression / silencing in relation to large genomes of polyploid cereals. Another application of genetic transformation, based on RNAi technology (RNA interference), is silencing of selected genes. This could be used to study gene function as well as to induce silencing of the native, single or family genes of cereals. Two strategies of silencing are discussed: a strategy of transcriptional gene silencing (TGS) and posttranscriptional gene silencing (PTGS). Key words: genetic transformation, polyploids, wheat, triticale, oat.

2 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó 1. Metody transformacji zbó Uzyskanie transgenicznych roœlin jest podstawowym etapem w badaniach funkcji genów oraz otrzymywaniu nowych, genetycznie ulepszonych odmian. Drugim, niezbêdnym warunkiem jest uzyskanie stabilnej ekspresji wprowadzonej konstrukcji genetycznej, niezmienionej w kolejnych pokoleniach generatywnych. Zastosowanie odpowiedniej metody transformacji genetycznej ma znaczenie nie tylko dla wydajnoœci, ale przede wszystkim dla jakoœci uzyskanych roœlin transgenicznych. Pierwsze transgeniczne, p³odne roœliny zbó, tj. kukurydzy (1) i ry u (2,3) uzyskano pod koniec lat 90. ubieg³ego wieku z protoplastów. Metoda ta jednak nie rozpowszechni³a siê, z powodu trudnoœci metodycznych oraz wystêpuj¹cych zaburzeñ genetycznych w otrzymywanych roœlinach. Ze wzglêdu na nieudane w tym czasie próby transformacji zbó za pomoc¹ Agrobacterium, opracowana zosta³a metoda biolistyczna (mikrowstrzeliwania) (4) z powodzeniem u yta do transformacji pszenicy (5-7). Do dziœ rozpowszechni³a siê ona w wielu laboratoriach na œwiecie. Próby wykorzystania naturalnego mechanizmu transformacji genetycznej przy u yciu Agrobacterium przynios³y pewien prze³om w 1994 r. w transformacji ry u (8) i w 1997 r. w transformacji pszenicy (9). W chwili obecnej u ry u, który jest diploidalnym gatunkiem modelowym wœród zbó, ta metoda transformacji jest ju rutyn¹. U wielu pozosta³ych, zw³aszcza gatunków poliploidalnych (pszenica, pszen yto, owies) transformacja za pomoc¹ Agrobacterium jest nadal bardzo trudna i niedopracowana. Najwiêcej doniesieñ dotyczy pszenicy, gatunku gospodarczo najwa - niejszego (9-13). Wiêkszoœæ z nich ukaza³a siê w okresie ostatnich trzech lat i pochodzi z kilku laboratoriów. Nasz wk³ad w opracowanie metody transformacji genetycznej za pomoc¹ Agrobacterium u poliploidalnych zbó jest bardzo istotny. Intensywne prace z ostatnich kilku lat (z du ¹ pomoc¹ finansow¹ KBN) zaowocowa³y opracowaniem regeneracji in vitro i transformacji trzech odmian pszenicy (14,13), pszen yta (15) i owsa (Gasparis i in., w opracowaniu). Znajomoœæ tych technik umo - liwia nam prowadzenie badañ nad ekspresj¹ transgenów oraz wyciszaniem genów natywnych w zbo ach Metoda biolistyczna Du e zainteresowanie metod¹ transformacji zbó za pomoc¹ Agrobacterium nie by³o bezprzedmiotowe. Po kilku latach badañ i entuzjastycznych doniesieñ na temat mo liwoœci u ycia metody biolistycznej w kolejnych gatunkach zbó, rozpoczêto analizê uzyskanych linii transgenicznych. Dotyczy³a ona liczby kopii, struktury transgenicznych loci, ich lokalizacji, dziedziczenia i utrzymywania ekspresji w kolejnych pokoleniach generatywnych, a w najnowszych pracach przeprowadzono analizê sekwencji. Wykazano, integracjê zazwyczaj wielu (do kilkudziesiêciu) kopii transgenu zawieraj¹cego ponadto sekwencje wektora. Towarzyszy³y temu du e rearan- BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

3 Anna Nadolska-Orczyk acje. Zdecydowana wiêkszoœæ transgenicznych loci mia³a bardzo z³o on¹ strukturê sk³adaj¹c¹ siê z wielokrotnych kopii ca³ych, uszkodzonych i zrearan owanych sekwencji, czêsto wbudowanych w postaci jednokierunkowych lub odwróconych powtórzeñ i rozdzielonych fragmentami genomowego DNA (16-18). Te zaburzenia w budowie i strukturze transgenicznych loci maj¹ bezpoœredni lub poœredni wp³yw na brak ekspresji wprowadzonych transgenów lub ich wyciszanie w kolejnych pokoleniach. Srivastava i wsp. (19) opisali rearan acje a w5z6testowanych linii transgenicznych pszenicy. Tak du ¹ liczbê linii z zaburzeniami transgenów autor t³umaczy³ niestabilnoœci¹ u ytej do transformacji populacji. Cannell i wsp. (20) badali dziedziczenie genu reporterowego uida i selekcyjnego bar w trzech pokoleniach roœlin transgenicznych pszenicy i tritordeum. Z 12 lini testowanych w pierwszym pokoleniu generatywnym (T 1 )67%,az9analizowanych w T2 i T3 55% wykazywa³o dziedziczenie zgodne z prawami Mendla. W niektórych liniach ekspresja genu reporterowego uida, znajduj¹cego siê pod silnym promotorem Ubi1/intron ulega³a wyciszaniu w kolejnych trzech pokoleniach. Poniewa linie te wyprowadzono z rodzica wykazuj¹cego dobr¹ ekspresjê, autorzy sugeruj¹ w³¹czenie wyciszania epigenetycznego. W podobny sposób t³umaczono brak zgodnoœci z segregacj¹ mendlowsk¹ w pokoleniu F 2 roœlin potomnych uzyskanych po krzy owaniu roœlin transgenicznych, wykazuj¹cych dobr¹ ekspresjê genu uida z nietransgenicznymi (21). Wyciszanie genu uida opisano równie w wielu innych pracach, miêdzy innymi u diploidalnego ry u (22). Obejmowa³y one od 5 do 49% potomstwa rodzica dobrze wyra- aj¹cego ekspresjê transgenu selekcyjnego bar pod promotorem Ubi1. W tym doœwiadczeniu stwierdzono metylacjê sekwencji promotora, co sugeruje, e inaktywacja nast¹pi³a na poziomie transkrypcji. Podobn¹, specyficzn¹ inaktywacjê genu uida w liniach pszenicy zawieraj¹cych obydwa transgeny opisywali Srivastava i wsp. (19). Jakkolwiek w niektórych przypadkach gen bar ulega³ ekspresji nawet, je eli by³ zmetylowany. Specyficzne wyciszanie uida sugeruje, e niestabilnoœæ transgenów mo e byæ zwi¹zana z ich sekwencj¹. Szczegó³owa analiza sekwencji transgenicznych loci u owsa, charakteryzuj¹cych siê prostym wzorem integracji wykazanym za pomoc¹ hybrydyzacji DNA, uwidoczni³a wielokrotne rearan acje transgenu i jego sekwencji flankuj¹cych z genomowym DNA (23). Z tego wynika, e czêstotliwoœæ wystêpowania linii charakteryzuj¹cych siê prostym wzorem integracji jest jeszcze rzadsza ni wskazuj¹ na to hybrydyzacja Southern blot lub badania FISH. Na inn¹ przyczynê zaburzeñ wskazuje Howarth i wsp. (24). Analizie poddano dwie transgeniczne linie pszenicy, wykazuj¹c¹ ekspresjê i ulegaj¹c¹ wyciszaniu. Wyciszanie ekspresji genu reporterowego uida i genu bar by³o coraz silniejsze w kolejnych pokoleniach generatywnych a do T3 i zachodzi³o na poziomie transkrypcyjnym. Zwi¹zana z tym by³a nasilaj¹ca siê w kolejnych pokoleniach metylacja promotora (Ubi1). Inserty linii wykazuj¹cej ekspresjê w pokoleniu T3 zlokalizowano w dystalnej czêœci chromosomu 5D, a w linii, gdzie transgeny uleg³y wyciszeniu w pobli u centromeru chromosomu 5A (24). Z map fizycznych chromosomów pszenicy oraz innych gatunków wiadomo, e geny zlokalizowane s¹ g³ównie w dystalnych, 170 PRACE PRZEGL DOWE

4 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó sybtelomerycznych rejonach chromosomów. Rejony znajduj¹ce siê blisko centromeru zawieraj¹ nieaktywn¹ transkrypcyjnie heterochromatynê (25), wp³ywaj¹c¹ na wyciszanie ulokowanych w niej transgenów. Efekt wyciszania tak zlokalizowanych transgenów nazywany jest efektem pozycji (26), czyli w³aœciwoœciami strukturalnymi i funkcjonalnymi obszaru chromatyny flankuj¹cej miejsce integracji transgenu (27). Opisano go w obydwu metodach transformacji, choæ ze wzglêdu na ró ny przebieg tych procesów czêœciej przypisywany by³ metodzie biolistycznej Metoda transformacji za pomoc¹ Agrobacterium Integracja transgenicznych loci z genomowym DNA w metodzie Agrobacterium zachodzi w naturalnym procesie infekcji komórek roœlinnych t¹ bakteri¹, w czasie, której dochodzi do przekazania T-DNA (praca przegl¹dowa 28). Wi¹ e siê z tym ich znacznie prostsza organizacja polegaj¹ca na integracji pojedynczych lub ma³ej liczby kopii transgenów z minimalnymi rearan acjami. Ponadto daje ona mo liwoœæ wbudowania œciœle okreœlonego przez sekwencje graniczne fragmentu DNA (T-DNA). Integracja mo e zachodziæ w loci na ró nych chromosomach, co umo liwia zastosowanie metody transformacji dwoma ró nymi plazmidami/t-dna w celu wysegregowania (usuniêcia) konstrukcji u ytej do selekcji (29,30). Dlatego korzyœci wynikaj¹ce z u ycia metody transformacji genetycznej zbó za pomoc¹ Agrobacterium mog¹ byæ znaczne zarówno w badaniach podstawowych jak i w przypadku wprowadzania GMO do œrodowiska. Najlepiej zosta³y one udokumentowane u roœlin dwuliœciennych, u których ta metoda transformacji jest wykorzystywana w badaniach i do celów aplikacyjnych od ponad dwudziestu lat. Zalety te potwierdzone zosta³y w pierwszych doniesieniach dotycz¹cych zbó (por. praca przegl¹dowa 31) oraz pracach porównuj¹cych obydwie metody u diploidalnych zbó (32,33). Na przyk³ad w wyniku u ycia metody Agrobacterium u jêczmienia uzyskano dwukrotnie wy sz¹ wydajnoœæ transformacji ni w metodzie biolistycznej i integracjê 1-3 kopii we wszystkich uzyskanych liniach. Natomiast 60% linii uzyskanych w metodzie biolistycznej mia³o wiêcej ni 8 kopii. Czêœciej równie obserwowano wyciszenie w pierwszym pokoleniu generatywnym (33). Najczêœciej wystêpuj¹ce zaburzenia w tej metodzie, to integracja sekwencji wektora spoza T-DNA, integracja wiêcej ni jednej kopii, czasami niepe³nej T-DNA oraz drobne zaburzenia w sekwencjach nukleotydów granicz¹cych z genomowym DNA. Jednak nie wszystkie z nich, jak to sugerowano we wczeœniejszych badaniach, s¹ powodem wyciszania. Meza i wsp. (34) analizowali 37 jednokopiowych linii transgenicznych wyprowadzonych z modelowej roœliny dwuliœciennej Arabidopsis thaliana. Prawie jedna trzecia (13) z nich wykazywa³a wyciszanie. W dok³adnej analizie transgenicznych loci wykazano, e piêæ linii zawiera³o sekwencje wektora, a trzy mia³y uciête kopie T-DNA w odwróconej orientacji do ca³ej kopii. Zarówno jedne jak i drugie nie odgrywa³y istotnej roli w indukcji wyciszania. Podobnie nie stwierdzono BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

5 Anna Nadolska-Orczyk zwi¹zku pomiêdzy metylacj¹ promotora a wyciszaniem transgenu. Autorzy t³umaczyli wyciszenie transgenów w tych badaniach efektem pozycji. Nie jest to zgodne z wynikami opisanymi w innych pracach, sugeruj¹cymi rozdzia³ insertów T-DNA w miejscach aktywnej transkrypcyjnie euchromatyny (35). Na przyk³ad w genomie A. thaliana, gdzie zagêszczenie genów jest du e, stwierdzono równomierny rozdzia³ insertów T-DNA. U ry u by³y one zlokalizowane jedynie w rejonach aktywnych transkrypcyjnie odpowiadaj¹cych tylko 10-25% genomowego DNA. Podobnie w analizie fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) chromosomów metafazowych ry u wykazano, e inserty T-DNA by³y ulokowane g³ównie w dystalnych, euchromatynowych czêœciach (36). Pewnym wyt³umaczeniem efektu pozycji, opisanym u roœlin transformowanych za pomoc¹ Agrobacterium mo e byæ wystêpowanie interstycjalnych miejsc heterochromatyny (knobs), po raz pierwszy opisanych w kukurydzy (37), ale wystêpuj¹cych równie w genomach innych roœlin. W najnowszych badaniach u Arabidopsis wykazano, e heterochromatyna jest determinowana przez elementy transpozonowe i zwi¹zane z nimi duplikacje tandemowe pod kontrol¹ genu DDM1 ATPazy remodeluj¹cej chromatynê (38). Geny le ¹ce blisko lub wewn¹trz tych rejonów mog¹ byæ przez nie regulowane epigenetycznie. Z wczeœniejszych badañ wynika³o, e wyciszanie by³o równie czêsto zwi¹zane z wystêpowaniem powtarzalnych struktur T-DNA (praca przegl¹dowa 39), choæ nigdy w konfiguracjach T-DNA jako sekwencje odwrócone lub tandemowe (40). Zwi¹zek z transkrypcj¹ odwróconych powtórzeñ a wyciszaniem istnia³, wtedy gdy RNA formowa³o dwuniciowe RNA, ciête na sirna i homologiczne mrna by³o degradowane (por. praca przegl¹dowa 41). Jednak e w niektórych badaniach podtrzymuje siê hipotezê, e wyciszanie jest aktywowane przez przekroczenie pewnego stê enia transkryptu lub innego produktu ekspresji transgenów (42). Na przyk³ad czêstotliwoœæ wyciszania by³a pozytywnie skorelowana z si³¹ promotora wprowadzanego genu (43) i by³a bardziej jednoznaczna w roœlinach homo- ni hemizygotycznych (44). Ta hipoteza zostanie szerzej omówiona w nastêpnym rozdziale. W badaniach przeprowadzonych na modelowych roœlinach dwuliœciennych uzmys³owiono nam tylko ewentualne przyczyny i mechanizmy wyciszania transgenów. Metoda transformacji zbó heksaploidalnych za pomoc¹ Agrobacterium zosta³a opracowana dopiero w ostatnich latach (9-13,15,16), dlatego informacje na temat ekspresji wprowadzonych transgenów ograniczaj¹ siê do pierwszego, najwy ej drugiego pokolenia generatywnego. We wstêpnych wynikach tych badañ potwierdza siê du o wy sz¹ czêstotliwoœæ wystêpowania pojedynczych kopii o prostym wzorze integracji. Brak na razie prac, w których prowadzono analizê stabilnoœci ekspresji i/lub ewentualnych mechanizmów wyciszania. Jednym z elementów mog¹cych odgrywaæ bardzo du ¹ rolê w ekspresji transgenów jest du y i bardzo z³o ony genom tych roœlin. Diploidalne zbo a maj¹ genom wiêkszy ni roœlina modelowa A. thaliana od ok. 3 razy u ry u do ponad 30 razy u jêczmienia. Zbo a poliploidalne, jak alloheksaploidalna pszenica, pszen yto czy owies, maj¹ genomy prawie 100-krotnie wiêksze (45). Wiêkszoœæ zajmuj¹ rozproszone wzd³u chromosomów rejony hetero- 172 PRACE PRZEGL DOWE

6 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó chromatynowe, zawieraj¹ce sekwencje repetytywne oraz ruchome elementy genetyczne. Elementy transpozonowe w roœlinach o du ych genomach zajmuj¹ wiêkszoœæ obszaru (46). Udzia³ retrotranspozonów w genomach zbó oceniany jest nawet na 50 do 80% (47). Stwierdzono, e w warunkach stresu mog¹ ulegaæ aktywacji i wp³ywaæ na ekspresjê i/lub rearan acje przylegaj¹cych genów. Na przyk³ad w nowo syntetyzowanym amfiploidzie pszenicy poziom transkryptów transpozonu Wis 2-1A, znajduj¹cy siê w dziesiatkach tysiêcy kopii by³ bardzo wysoki i zwi¹zany z wyciszaniem lub aktywacj¹ okreœlonych genów (48). U jêczmienia 12 z 46 miejsc integracji T-DNA ulokowanych by³o wewn¹trz retrotranspozonu BARE-1, wystêpuj¹cego z czêstotliwoœci¹ w genomie (49). Miejsca integracji transgenu z genomowym DNA u³o one by³y zawsze w powtarzalnej duplikacji tandemowej. 2. Liczba kopii a ekspresja Mimo prostego wzoru integracji, transgeniczne linie roœlin dwuliœciennych wyprowadzone za pomoc¹ Agrobacterium mog¹ ró niæ siê nawet 100-krotnie w poziomie ekspresji (50,51). To du e zró nicowanie pojawia siê równie wœród linii transformowanych t¹ sam¹ konstrukcj¹. W niektórych laboratoriach stwierdzono bezpoœredni zwi¹zek pomiêdzy liczb¹ kopii transgenów a poziomem ekspresji (52-54). Przy czym w badaniach na ziemniaku (52) by³ on pozytywny, a np. u tytoniu pozytywnie lub negatywnie zwi¹zany z ekspresj¹ transgenu (53). W badaniach roœlin zbo owych dane dotycz¹ce efektu liczby kopii transgenu s¹ nieliczne i sprzeczne. Opisano zarówno brak wp³ywu (55) jak i wzrost ekspresji zwi¹zany z homozygotyzacj¹ (56,57). W poliploidalnych zbo ach, g³ównie pszenicy transformowanej metod¹ biolistyczn¹ mo na znaleÿæ wiele przyk³adów pozytywnej korelacji liczby transgenów z ekspresj¹. Jednym z nich jest uzyskanie transgenicznej linii pszenicy zawieraj¹cej wed³ug szacunku autorów oko³o 90 w przeliczeniu na homozygotyczny genom 2C kopii transgenu koduj¹cego bia³ko p³aszcza wirusa paskowanej mozaiki pszenicy (58). Linia ta wykazywa³a jednoczeœnie siln¹ odpornoœæ na tego wirusa. Tak jak przedstawiono za pomoc¹ hybrydyzacji Northern, odpornoœæ nie wynika³a z ekspresji bia³ka p³aszcza wirusa, ale du ej iloœci zdegradowanego mrna transkrybowanego genu. Wynik ten sugeruje typ odpornoœci warunkowany przez potranskrypcyjne wyciszanie. Inne przyk³ady dotycz¹ transformacji zbó genami natywnymi, warunkuj¹cymi cechy jakoœciowe. Jedn¹ z najwa niejszych jest sk³ad jakoœciowy gluteniny, bia³ka zapasowego zbó. Sk³ada siê ona z dwóch podjednostek: wysokocz¹steczkowej HMW (ang. high-molecular-weight) i niskocz¹steczkowej LMW (ang. low-molecular-weight). HMW warunkuje elastycznoœæ glutenu. Ró nice w jakoœci zwi¹zane s¹ z liczb¹ podjednostek i mog¹ byæ zale ne od efektu iloœciowego. Pszenica heksaploidalna zawiera szeœæ genów podjednostki HMW, ale w zale noœci od odmiany wystêpuje ekspresja 3, 4 lub 5 z nich. Istnieje œcis³y zwi¹zek pomiêdzy liczb¹ genów ulegaj¹cych ekspresji a jakoœci¹ (59). Dwa z nich: 1Dx5 i 1Ax1 koduj¹ce podjednostkê BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

7 Anna Nadolska-Orczyk HMW zosta³y wyizolowane i u yte do transformacji pszenicy (59,60). Rooke i wsp. (60), mimo uzyskania linii zawieraj¹cych od oko³o 6 do kilkudziesiêciu kopii transgenów, nie stwierdzili pozytywnej korelacji pomiêdzy poziomem ekspresji a liczb¹ insertów transgenu. Te same geny wprowadzone do odmiany pszenicy, u której wystêpuje ekspresja wszystkich piêciu podjednostek (59) da³a wynik odmienny. Z szeœciu roœlin transgenicznych w dwóch odnotowano nadekspresjê genu 1Dx5, zwiêkszaj¹c¹ udzia³ wysokocz¹steczkowej podjednostki gluteniny w bia³ku ca³kowitym do 22%. Ekspresja 1Ax1 w dwóch roœlinach powodowa³a wyciszanie genu endogennego podjednostki 1Ax2*, kiedy transgen by³ w stadium homozygoty. Roœliny te zwiera³y nisk¹ liczbê kopii. Wyciszanie wszystkich podjednostek HMW obserwowano w dwóch innych roœlinach wykazuj¹cych ekspresjê transgenu podjednostki 1Ax1 i nadekspresjê genu Dx1. Posiada³y one wysok¹ liczbê kopii transgenu (od 20 do 50) wbudowanego w wielu miejscach genomu. Wzór integracji i ekspresji by³y dziedziczone z wyj¹tkiem jednej linii, u której w pokoleniu T 2 nast¹pi³a rewersja wyciszania. By³a ona zwi¹zana z drastyczn¹ strat¹ du ej liczby, ale nie wszystkich transgenów. Rewertant wykazywa³ ekspresjê wszystkich piêciu podjednostek oraz transgenu 1Ax1. W innym laboratorium te same geny wprowadzono do roœlin tritordeum (pszenica durum x jêczmieñ). Z 13 uzyskanych linii transgenicznych, 6 wykazywa³o podobn¹ lub wy sz¹ ekspresjê tych podjednostek. Masci i wsp. (61) transformowali za pomoc¹ mikrowstrzeliwania odmianê Bobwhite pszenicy genem koduj¹cym podjednostkê LMW gluteniny pod jego w³asnym promotorem. Podjednostka ta jest drugim wa nym komponentem glutenu wp³ywaj¹cym na jego strukturê. U wiêkszoœci transgenicznych roœlin, ekspresja transgenu by³a s³abo przekazywana do roœlin potomnych. U jednej z linii, wykazuj¹cej siln¹ ekspresjê transgenu, stwierdzono podwojenie udzia³u bia³ka w podjednostce. Zdaniem autorów nadekspresja tego transgenu by³a prawdopodobnie efektem integracji wielu kopii, co wynika³o z analizy hybrydyzacji Southern. Pozytywny efekt wielokrotnych kopii genów puroindolinowych Pina i Pinb, których ekspresja wp³ywa na miêkkoœæ ziaren wykazali See i wsp. (62) w liniach substytucyjnych pszenicy. Ekspresja tych genów wystêpuje w gatunkach diploidalnych pszenicy, ale jest wyciszona w pszenicy tetraploidalnej. Aktywne w heksaploidalnych gatunkach geny puroindolinowe pochodz¹ z Aegilops tauschii, donora genomu D. Autorzy w³¹czyli za pomoc¹ linii substytucyjnych aktywne geny Pina i Pinb do genomuaib.stwierdzili œcis³¹ zale noœæ miêkkoœci ziarna ze zwiêkszon¹ liczb¹ tych genów. Podobny wynik zwiêkszenia miêkkoœci ziarna uzyskano w wyniku transformacji genetycznej ry u metod¹ mikrowstrzeliwania transgenów pina i pinb umieszczonych pod kontrol¹ promotora ubiquityny (63). W tym przypadku ry by³ tylko roœlin¹ modelow¹, nie zawieraj¹c¹ w swoim genomie homologów tych genów. Autorzy potwierdzili wp³yw produktów genów puroindolinowych na miêkkoœæ ziarna, choæ nie wykazali efektu addytywnego. Na podstawie uzyskanych wyników mo na jednak przypuszczaæ, e w wyniku zwiêkszenia liczby kopii tych genów poprzez transformacjê genetyczn¹ poliploidalnych zbó mo e wyst¹piæ efekt addytywny. 174 PRACE PRZEGL DOWE

8 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó W badaniach dotycz¹cych roœlin dwuliœciennych najczêœciej wyra any by³ pogl¹d, e stabilna ekspresja jest wynikiem integracji pojedynczych kopii transgenów (64), a kopie wielokrotne prowadz¹ do kosupresji i wyciszania (65). Nowe dane wnios³a praca Schubert i wsp. (66) na podstawie badañ przeprowadzonych u A. thaliana. Autorzy scharakteryzowali ekspresje jednokopiowego T-DNA, zwieraj¹cego ró n¹ liczbê transgenu w 132 niezale nych liniach. Wyciszenie transgenów u adnej z nich nie by³o wynikiem efektu pozycji (miejsca integracji). Natomiast poni ej pewnej liczby identycznych transgenów w genomie, korelacja pomiêdzy liczb¹ kopii transgenu i ekspresj¹ by³a pozytywna. Wysoka i stabilna ekspresja kilku kopii transgenu utrzymywana by³a w dalszych pokoleniach i jej poziom by³ porównywalny pomiêdzy niezale nymi liniami maj¹cymi tyle samo kopii transgenu. Wyciszanie RNAi (zob. dalej) na poziomie transkrypcji by³o w³¹czane, je eli liczba kopii przekroczy³a pewien poziom. Autorzy zaproponowali istnienie mechanizmu ochronnego, w³¹czanego, kiedy transkrypcja RNA danego genu jest nadmierna. Pozytywna korelacja wiêkszej liczby kopii z ekspresj¹ jest dyskutowana z organizacj¹ genomu DNA tej roœliny. Na podstawie analizy sekwencji genomowego DNA wykazano, e u A. thaliana tylko 35% genów koduj¹cych bia³ka jest jednokopiowych (67). Istniej¹cy, zatem pozytywny zwi¹zek ekspresji z okreœlon¹ liczb¹ kopii transgenów mo e byæ odzwierciedleniem charakterystyki genomu. Zmiany w liczbie kopii s¹ szczególnie czêste w trakcie ewolucji genomów (por. praca przegl¹dowa 68). Genomy alloheksaploidalnych zbó s¹ z³o one z trzech genomów diploidalnych ró nych gatunków. Zawieraj¹ zatem trzy zestawy chromosomów homeologicznych. Mechanizmy regulacji ekspresji w poliploidach, podobnie jak wskazuj¹ na to badania z u yciem resyntezowanych poliploidów (69), musz¹ uwzglêdniaæ zwiêkszon¹ liczbê genów homeologicznych i ortologicznych oraz elementów regulatorowych. Mo na, zatem przypuszczaæ, e pozytywna zale noœæ liczby kopii z ekspresj¹ powinna byæ w tych gatunkach jeszcze bardziej istotna. Paradoksalnie hipotezê tê potwierdzono w pracach, w których wysoka ekspresja transgenu by³a zwi¹zana z du ¹ liczb¹ kopii wprowadzonych metod¹ biolistyczn¹. Brak korelacji pomiêdzy liczb¹ kopii i poziomem ekspresji transgenów t³umaczono najczêœciej opisanym wczeœniej efektem pozycji. 3. Ukierunkowane wyciszanie genów natywnych zbó 3.1. Wykrycie regulatorowego RNA (RNAi) Mimo e RNAi bierze udzia³ w jednym z podstawowych mechanizmów regulacji ekspresji genów, jego pe³ne zrozumienie i wykorzystanie w badaniach sta³o siê mo liwe po wykryciu w 1999 r. krótkich interferuj¹cych RNA (sirna) powoduj¹cych wyciszanie genów (70). Obecnie wiadomo, e istniej¹ trzy naturalne mechanizmy in- BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

9 Anna Nadolska-Orczyk terferencji RNA (71). Reguluj¹ one mechanizmem obronnym roœliny przeciw wirusom, ochron¹ genomu przed transpozonami i bior¹ udzia³ w regulacji ekspresji genów. Ich wspólnym elementem jest ciêcie dwuniciowego RNA do krótkich nukleotydowych, interferuj¹cych RNA (sirnas i mirnas) przez enzymy typu Dicer. Zablokowanie ekspresji genów mo e zachodziæ na poziomie transkrypcji (TGS, transkrypcyjne wyciszanie genów). Zosta³o ono po raz pierwszy wykryte u roœlin transgenicznych, w których RNA transgenu powodowa³o metylacjê DNA (72,73). TGS zachodzi w wyniku metylacji promotora. Jest to proces dziedziczony aczkolwiek by³y obserwowane rewersje. Ostatnio zaobserwowano, e wyciszanie tego typu ma równie zwi¹zek z modyfikacj¹ histonów (74). Innym mechanizmem jest wyciszanie genów na poziomie mrna (PTGS, potranskrypcyjne wyciszanie genów). W wyniku tego procesu zachodzi degradacja transkryptu genu endogennego (lub transgenu), metylacja sekwencji koduj¹cej i tym samym wyciszenie ekspresji tego genu (transgenu) (75). PTGS zachodzi podczas rozwoju roœliny i po mejozie jest resetowany. Istnieje bardzo obszerna literatura na temat procesów TGS i PTGS u roœlin modelowych (A. thaliana, petunia) (por. praca przegl¹dowa 76). Charakterystyczne dla tych procesów jest systemiczne rozprzestrzenianie siê sygna³u wyciszaj¹cego w ca³ej roœlinie (77). Zarówno te badania jak i wykrycie krótkich interferuj¹cych RNA umo - liwi³y zaprojektowanie wektorów do wyciszania genów natywnych na poziomie transkrypcji lub do wyciszania potranskrypcyjnego (66,78). Wyciszaj¹ca konstrukcja zawiera pomiêdzy promotorem i terminatorem transkrypcji sekwencje odwrócone okreœlonego fragmentu DNA. Integracja tej konstrukcji z genomowym DNA i jej transkrypcja prowadzi do powstania dwuniciowej spinki RNA, i w dalszej kolejnoœci do metylacji wybranych sekwencji regulatorowych/koduj¹cych. Odwrócone sekwencje promotora spowoduj¹ jego metylacjê i w konsekwencji wyciszenia ekspresji genu na poziomie transkrypcji (nie dojdzie do transkrypcji sekwencji koduj¹cej). W przypadku u ycia sekwencji koduj¹cych, dwuniciowe fragmenty RNA tych sekwencji doprowadz¹ do degradacji odpowiadaj¹cego im mrna. Efektem bêdzie wyciszenie ekspresji na poziomie potranskrypcyjnym. Wykrycie regulatorowego RNA (RNAi) umo liwi³o zrozumienie oraz ustalenie mechanizmów wyciszania ekspresji transgenów i sta³o siê jedn¹ z podstawowych metod analizy funkcji genów. Umo liwia równie ukierunkowane wyciszanie genów natywnych, warunkuj¹cych niekorzystne cechy Wykorzystanie procesu RNAi do wyciszania genów natywnych zbó W zale noœci od u ycia okreœlonego fragmentu genu, promotora czy sekwencji reguluj¹cej w wektorze typu RNAi efekt wyciszania bêdzie ró ny. W najnowszych badaniach Miki i wsp. (79) wykazali, e u ywaj¹c sekwencji konserwatywnej rodziny genów OsRac uzyskali wyciszanie w ca³ej rodzinie. Powstaj¹ce dwuniciowe RNA sekwencji genowospecyficznych prowadzi³o do wyciszania poszczególnych genów tej 176 PRACE PRZEGL DOWE

10 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó rodziny. Efektywnoœæ metody mo na by³o zwiêkszyæ przez zastosowanie odpowiedniego promotora i u ycie w³aœciwej d³ugoœci sekwencji. Ry jest bardzo dobrym obiektem do analizy funkcji genów przy u yciu wektorów wyciszaj¹cych, poniewa jego genom jest zsekwencjonowany, istnieje du a kolekcja pe³nej d³ugoœci cdna, ale z kolei brakuje mutantów typu knockout. W najbli szym czasie mo na siê zatem spodziewaæ wielu publikacji na ten temat. Wiedza na temat ukierunkowanego wyciszania genów u gatunków poliploidalnych jest bardzo ograniczona. S¹ to gatunki, u których wyciszenie genów warunkuj¹cych niekorzystne cechy przy u yciu wektorów RNAi, jak siê wydaje, jest bardzo potrzebne i mo e mieæ ogromny wp³yw na ich ulepszenie. W wyniku zwielokrotnionego genomu, mutacja recesywna genu na jednym z chromosomów homeologicznych zazwyczaj nie powoduje eliminacji cechy fenotypowej. Natomiast u ycie wektorów RNAi umo liwia jednoczesne wyciszenie ekspresji danej grupy genów homeologicznych. Potwierdzili to w swoich badaniach Lawrence i Pikaard (80), w których u yli allotetraploidalnego gatunku Arabidopsis suecica, mieszañca A. thaliana i A. arenosa. Ekspresja dwuniciowego RNA genu DDM1 (zmniejszenie metylacji DNA) A. thaliana spowodowa³a eliminacjê mrna tego genu i brak metylacji w powtórzeniach centromerowych genomów obydwu gatunków w badanym mieszañcu (A. thaliana i A. arenosa). Te wyniki wskazuj¹, e pojedynczy transgen indukuj¹cy RNAi mo e w sposób dominuj¹cy wyciszaæ wielokrotne geny ortologiczne. W drugim i zarazem jedynym artykule dotycz¹cym pszenicy (twardej), transformowanej metod¹ biolistyczn¹, wprowadzono sekwencje genu VRN2, warunkuj¹cego hamowanie kwitnienia u zbó ozimych (81). Mutacja w tym genie powoduje, e staj¹ siê one formami jarymi. Prawdopodobnie z powodu braku odpowiednich metod, autorzy u yli do transformacji metody biolistycznej oraz odmiany jarej pszenicy twardej (Jagger). Konstrukcja RNAi zawiera³a fragment 347 pz cdna tego genu wyizolowanego z T. monococcum. Redukcja poziomu RNA genu VRN2 przyspieszy³a czas kwitnienia transgenicznych roœlin o ponad miesi¹c. 4. Podsumowanie Ekspresja transgenów w roœlinach jest uwarunkowana szeregiem czynników zwi¹zanych z metod¹ transformacji, w³aœciwoœciami wprowadzanego DNA, budow¹ transgenicznej kasety jak i cechami samej roœliny. Sekwencja transgenu, budowa i czêœci sk³adowe konstrukcji oraz sposób transformacji nale ¹ do grupy elementów, na które mamy wp³yw i mo emy je modyfikowaæ. To, jak dana konstrukcja zostanie zintegrowana z DNA roœliny zale y w du ej mierze od metody transformacji jak i od procesów odbywaj¹cych siê na poziomie komórki. Pomyœlna realizacja tych wszystkich etapów nie zapewnia jeszcze uzyskania w³aœciwej ekspresji transgenu. Wa nym elementem jest, eby transgen zosta³ zintegrowany z w³aœciw¹ czêœci¹ chromatyny, w odpowiedniej liczbie kopii, a jego struktura umo liwia³a stabiln¹ ekspresjê w dalszych pokoleniach. BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

11 Anna Nadolska-Orczyk Uzyskanie ekspresji transgenu na odpowiednim poziomie jest znacznie trudniejsze u zbó ni u roœlin dwuliœciennych. Przyczyn¹ tego, jak stara³am siê wykazaæ, mog¹ byæ dwa elementy. Pierwszym z nich jest ograniczone mo liwoœciami technicznymi u ycie korzystniejszej metody transformacji za pomoc¹ Agrobacterium. Drugim jest ich du y genom, w którym prawie 80% zajmuje heterochromatyna. W gatunkach poliploidalnych zbó wystêpuje ponadto zwielokrotnienie genów homeologicznych lub ortologicznych oraz ich elementów regulatorowych. Doprowadzi³o to prawdopodobnie do wykszta³cenia u tych roœlin jeszcze silniejszych mechanizmów regulacji ekspresji, w tym wyciszania na poziomie RNAi. Znacznie prostsza w zastosowaniu u poliploidalnych zbó, jak siê wydaje, jest technika wyciszania przy u yciu mechanizmu RNAi. Zgodnie z ogóln¹ wiedz¹ na ten temat oraz wynikami pierwszych prac umo liwia ona wyciszenie wszystkich genów homologicznych, homeologicznych lub ich ortologów. Stwarza, zatem nowe mo liwoœci analizy funkcjonalnej oraz ulepszania roœlin uprawnych. Praca zosta³a opracowana w ramach projektu badawczego PBZ-KBN-089/P06/2003. Literatura 1. Rhodes C. A., Pierce D. A., Mettler I. J., Mascarenhas D., Detmer J. J., (1988), Science, 240, Toriyama K., Arimoto Y., Uchimiya H., Hinata K., (1988), Bio/Technol., 6, Zhang W., Wu., (1988), Theor. Appl. Genet., 76, Christou P., (1992), Plant J., 2, Vasil V., Castillo A. M., Fromm M. E., Vasil I. K., (1992), Bio/Technology, 10, Vasil V., Srivastava V., Castillo A. M., Fromm M. E., Vasil I. K., (1993), Bio/Technology, 11, Weeks J. T., Anderson O. D., Blechl A. E., (1993), Plant Physiol., 102, Hiei Y., Komari T., Kubo T., (1997), Plant Mol. Biol., 35, Cheng M., Fry J. E., Pang S., Zhou H., Hironaka C. M., Duncan D. R., Conner T. W., Wan Y., (1997), Plant Physiol., 115, Hu T., Metz S., Chay C., Zhou H. P., Biest N., Chen G., Cheng M., Feng X., Radionenko M., Lu F., Fry J., (2003), Plant Cell Rep., 21, Khanna H. K., Daggard G. E., (2003), Plant Cell Rep., 21, Wu H., Sparks C., Amoah B., Jones H. D., (2003), Plant Cell Rep., 21, Przetakiewicz A., Karaœ A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2004), Cell Mol. Biol. Lett., 9, Przetakiewicz A., Orczyk W., Nadolska-Orczyk A., (2003), Plant Cell Tissue Org. Cult., 73, Nadolska-Orczyk A., Przetakiewicz A., Kopera K., Binka A., Orczyk W., (2005), J. Plant Growth Regul., 24, Kohli A., Leech M., Vain P., Laurie D. A., Christou P., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, Pawlowski W. P., Somers D. A., (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, Kohli A., Twyman R. M., Abranches R., Wegel E., Stoger E., Christou P., (2003), Plant Mol. Biol., 52, Srivastava V., Anderson O. D., Ow D. W., (1999), Proc. Natl. Acad. Sci., 96, Cannell M. E., Doherty A., Lazzeri P. A., Barcelo P., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, Demeke T., Hucl P., Baga M., Caswell K., Leung N., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, Kumpatla S. P., Eng W., Buchholz W. G., Hall T. C., (1997), Plant Physiol., 115, Makarevitch I., Svitashev S. K., Somers D. A., (2003), Plant Mol. Biol., 52, Howarth J., Jacquet J. N., Doherty A., Jones H. D., Cannell M. E., (2005), 146, PRACE PRZEGL DOWE

12 Ekspresja transgenów i wyciszanie genów u zbó 25. Sandhu D., Gill K. S., (2002), Plant Physiol., 128, Matzke A. J. M., Matzke M. A., (1998), Curr. Opin. Plant Biol., 1, Iglesias V. A., Moscone E. A., Papp I., Neuhuber F., Michalowski S., Phelan T., Spiker S., Matzke M., Matzke A. J. M., (1997), Plant Cell, 9, Nadolska-Orczyk A., (2001), Biotechnologia, 4, de Framond A. J., Back E. W., Chilton W. S., Kayes L., Chilton M., (1986), Mol. Gen. Genet., 202, Matthews P. R., Wang M-B., Waterhouse P. M., Thornton S., Fieg S. J., Gubler F., Jacobsen J. V., (2001), Mol. Breed., 7, Nadolska-Orczyk A., Orczyk W., (2003), in: Plant Genetic Engineering, vol 2, Improvement of Food Crops, Eds. Jaiwal P. K., Singh R. P., 1-25, Sci. Tech. Publishing LLC USA. 32. Zhang Y., Yin X., Yang A., Li G., Zhang J., (2005), Euphytica, 144, Travella S., Ross S. M., Harden J., Everett C., Snape J. W., Harwood W. A., (2005), Plant Cell Rep., 23, Meza T. J., Stangeland B., Mercy I. S., Skarn M., Nymoen D. A., Berg A., Butenko M. A., Hakelien A-M., Haslekas C., Meza-Zapeda L. A., Aalen R. B., (2002), Nucleic Acid Res., 30, Barakat A., Gallois P., Raynal M., Mestre-Ortega D., Sallaud Ch., Guiderdoni E., Delseny M., Bernardi G., (2000), FEBS Lett., 471, Dong J. J, Kharb P., Teng W. M., Hall T. C., (2001), Mol. Breed., 7, McClintock B., (1951), Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 16, Lippman Z., Gendrel A-V., Black M., Vaughn M. W., Dedhia N., Mccombie W. R., Lavine K., Mittal V., May B., Kasschau K. D., Carrington J. C., Doerge R. W., Colot V., Martienssen R., (2004), Nature, 430, Muskens M. W., Vissers A. P., Mol J. N., Kooter J. M., (2000), Plant Mol. Biol., 43, Lechtenberg B., Schubert D., Forsbach A., Gils M., Schmidt R., (2003), Plant J., 34, Matzke M. A., Matzke A. J. M., Pruss G. J., Vance V. B., (2001), Curr. Opin. Genet. Dev., 11, Lindbo J. A., Silva-Rosales L., Proebsting W. M., Dougherty W. G., (1993), Plant Cell 5, Que Q., Wang H-Y., English J. J., Jorgensen R. A., (1997), Plant Cell, 9, Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J. B., Mourrain P., Palauqui J. C., Vernhettes S., (1998), Plant J., 16, Moore G., (2000), Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 51, Bennetzen J., (2000), Plant Mol. Biol., 42, Feschotte C., Jiang N., Wessler S. R., (2002), Nat. Rev. Genet., 3, Kashkush K., Feldman M., Levy A. A., (2003), Nature Genet., 33, Stahl R., Horvath H., van Fleet J., Voetz M., von Wettstein D., Wolf N., (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, Jones J. D. G., Dunsmuir P., Bedbrook J., (1985), EMBO J., 4, Peach C., Velten J., (1991), Plant Mol. Biol., 17, Stockhaus J., Eckes P., Blau A., Schell J., Willmitzer L., (1987), Nucleic Acid Res., 15, Hobbs S. L. A., Warkentin T. D., DeLong C. M. O., (1993), Plant Mol. Biol., 21, Ku M. S., Agarie S., Nomura M., Fukayama H., Tsuchida H., Ono H., Hirose S., Toki S., Miyao M., Matsuoka M., (1999), Nat. Biotechnol., 17, Fearing P. L., Brown D., Vlachos D., Meghji M., Privalle L., (1997), Mol. Breed., 3, Duan X., Li X., Xue Q., Abo-El-Saad M., Xu D., Wu R., (1996), Nature Biotechnol., 14, James V. A., Avart C., Worland B., Snape J. W., Vain P., (2002), Theor. Appl. Genet., 104, Sivamani E., Brey Ch. W., Talbert L. E., Young M. A., Dyer W. E., Kaniewski W. K., Qu R., (2002), Transgenic Res., 11, Alvarez M. L., Guelman S., Halford N. G., Lustig S., Reggiardo M. I., Ryabushkina N., Shewry P., Stein J., Vallejos R. H., (2000), Theor. Appl. Genet., 100, Rooke L., Barro F., Tatham A. S., Fido R., Steele S., Bekes F., Gras P., Martin A., Lazzeri P. A. Shewry P. R., Barcelo P., (1999), Theor. Appl. Genet., 99, Masci S., D Ovidio R., Scossa F., Patacchini C., Lafiandra D., Anderson O. D., Blechl A. E., (2003), Mol. Breed., 12, BIOTECHNOLOGIA 4 (75)

13 Anna Nadolska-Orczyk 62. See D. R., Giroux M., Gill B. S., (2004), Crop Sci., 44, Krishnamurthy K., Giroux M. J., (2001), Nature Biotechnol., 19, Wolffe A. P., Matzke M. A., (1999), Science, 286, Vaucheret H., Beclin C., Elmayan T., Feuerbach F., Godon C., Morel J. B., Mourrain P., Palauqui J. C., Varnhettes S., (1998), Plant J., 16, Schubert D., Lechtenberg B., Forsbach A., Gils M., Bahadur S., Schmidt R., (2004), 16, Arabidopsis Genome Initiative, (2000), Nature, 408, Schmidt R., (2002), Plant Mol. Biol., 48, Ozkan H., Levy A. A., Feldman M., (2001), Plant Cell, 13, Hamilton A. J, Baulcombe D. C., (1999), Sience, 286, Baulcombe D., (2004), Nature, 431, Wassenegger M., Heimes S., Riedel L., Sanger H. L., (1994), Cell, 76, Mette M. F., Aufsatz W., van der Winden J., Matzke M. A., Matzke A. J. M., (2000), EMBO J., 19, Zilberman D., Cao X., Jacobsen S. E., (2003), Science, 299, Depicker A., van Montagu M., (1997), Curr. Opin. Cell Biol., 9, Paszkowski J., Whitham S., (2001), Curr. Opin. Plant Biol., 4, Palauqui J-C., Elmayan T., Pollien J-M., Vaucheret H., (1997), EMBO J., 16, Sijen T., Vijn I., Rebocho A., van Blokland R., Roelofs D., Mol J. N., Kooter J. M., (2001), Curr. Biol., 11, Miki D., Itoh R., Shimamoto K., (2005), Plant Physiol., 138, Lawrence R. J., Pikaard C. S., (2003), Plant J., 36, Yan L., Loukoianov A., Blechl A., Tranquilli G., Ramakrishna W., SanMiquel P., Bennetzen J. L., Echenique V., Dubcovsky J., (2004), Science, 303, PRACE PRZEGL DOWE