Wybrane szczepy drobnoustrojów przemysłowych Hodowle komórek ssaków i komórek roślinnych Porównanie systemów komórkowych

Transkrypt

1 Wybrane szczepy drobnoustrojów przemysłowych Hodowle komórek ssaków i komórek roślinnych Porównanie systemów komórkowych

2 Metabolity pierwotne i wtórne Metabolity specyficzne (wtórne, specjalne, idiolity) charakteryzują się ograniczonym występowaniem w przyrodzie i brakiem ogólnej, zasadniczej dla wzrostu wytwarzających je organizmów funkcji biologicznej; w określonych warunkach mogą one jednak spełniać różne swoiste funkcje w życiu drobnoustrojów Około opisanych struktur pochodzi z drobnoustrojów, kilkaset z nich jest produkowane metodami biotechnologicznymi (leki, pestycydy, promotory wzrostu itd.)

3 Metabolity specyficzne (wtórne) hipotezy dotyczące funkcji - hipoteza uniwersalna - następstwo jakościowej zmiany przemian materii zachodzących w komórce po zakończeniu wzrostu - relikt procesu ewolucyjnego - wyraz wolnej gry ewolucyjnej - rola ekologiczna

4 Biosynteza metabolitów pierwotnych i wtórnych - różnice Opublikował Gabryjela Gołuński

5 Liczba metabolitów pierwotnych jest stosunkowo mała a ich biosynteza jest dobrze poznana. Dzięki ich powszechnemu występowaniu można znaleźć prosty i dobrze zbadany drobnoustrój, nadający się do ich biotechnologicznej produkcji (Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum,saccharomyces cerevisiae). Większość potrzebnych dziś do różnych celów metabolitów pierwotnych jest otrzymywanych na skalę techniczną, z zastosowaniem kombinacji hodowli klasycznej, zmian dokonanych metodami technologii genetycznej i wielokrotnej optymalizacji prowadzenia procesu biotechnologicznego ze szczepami wysokowydajnymi.

6 Metabolity wtórne Nie pełnią podstawowych funkcji biologicznych (???) Powstają w metabolizmie ograniczonej liczby gatunków, a nawet szczepów S. hygroscopicus rapamycin S. erythreus erythromycin Ich biosynteza ściśle zależy od warunków hodowli i zachodzi w jej określonym etapie

7 Liczba substancji naturalnych w tej grupie jest duża i nieznana Regulation of fungal secondary metabolism, Axel A. Brakhage, Nature Reviews Microbiology 11, (January 2013)

8 Wiele substancji naturalnych należących do metabolitów wtórnych, odpowiednio do ich budowy strukturalnej ma więcej lub mniej złożony i często rozgałęziony szlak biosyntezy któremu towarzyszy najczęściej równie skomplikowana genetyka i regulacja

9 Pathway for biosynthesis of FK506 (according to Motamedi and Shafiee) Motamedi H, Shafiee A.. Eu J Biochem 1998; 256:

10 Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów alkaloidy fenazyny pirydyny aminocukry flawonoidy pirole aminoglikozydy fosfoglikolipidy pirony aminokwasy ftalaldehydy poliacetyleny antocyjaniny glikozydy polieny ansamycyny hydroksyloaminy polietery antrachinony laktony polikwasy antracykliny makrolidy polipeptydy chinoliny naftochinony polisacharydy chinolinony nitryle salicylany chinony nukleozydy steroidy depsipeptydy peptydy tetracykliny epoksydy piperazyny triazyny

11 Kierunki biologicznego działania specyficznych metabolitów drobnoustrojowych alergiczne anaboliczne analeptyczne anorektyczne antydepresyjne antyhistaminowe cytotoksyczne dermonekrotyczne estrogenne halucynogenne hemolityczne herbicydowe hipocholesterolemiczne hipoglikemiczne hipolipidemiczne hipotensyjne immunostymulacyjne immunosupresyjne parasympatomimetyczne przeciwdrobnoustrojowe przeciwinsektydowe przeciwnowotworowe przeciwpróchnicze przeciwrobacze przeciwzakrzepowe przeciwzapalne rozluźniające mięśnie gładkie rumieniotwórcze rakotwórcze stymulujące wydzielanie hormonów uspokajające znieczulające

12 Są zazwyczaj syntetyzowane jako grupy podobnych struktur chemicznych

13 Wybrane grupy drobnoustrojów przemysłowych Wirusy Bakterie gramujemne Bakterie gramdodatnie Promieniowce Grzyby strzępkowe stosowane w biotechnologii farmaceutycznej Drożdże Glony Drobnoustroje metylotroficzne

14 Inne typy komórek Grzyby wyższe (kultury mycelialne) Komórki zwierzęce - naturalne Hybrydy (hybrydomy) Komórki roślinne naturalne Mikroorganizmy modyfikowane metodami transformowanego DNA

15 Szczepionki wirusowe Wirusy Wektory Technologie rekombinowanego DNA

16 Bakterie gramujemne Escherichia coli acylaza penicylanowa asparginaza kwas L-asparginowy Acetobacter Gluconobacter Pseudomonas biotransformacje biorca DNA

17 Bakterie gramdodatnie Ważniejsze produkty metabolizmu wytwarzane przez bakterie z rodzaju Bacillus Antybiotyki bacytracyna butyrozyna gramicydyny polimyksyny przeciwko G+ i G przeciwko G+ i G przeciwko G + przeciwko G

18 Enzymy acylaza penicylinowa a-amylaza b-amylaza izoamyłaza b-galaktozydaza a-glukanaza b-glukanaza izomeraza glukozowa penicylinaza proteazy alkaliczne proteazy neutralne pululanaza termolizyna produkcja kwasu 6-AP hydroliza skrobi hydroliza skrobi hydroliza skrobi hydroliza laktozy hydroliza polisacharydów hydroliza polisacharydów konwersja glukozy do fruktozy inaktywacja penicyliny detergenty i inne zastosowania w przemyśle fermentacyjnym hydroliza amylopektyny produkcja aspartamu

19 Zastosowanie bakterii kwasu mlekowego Kwas mlekowy Lactobacillus: L.delbrueckii, L.bulgaricus, L.leichmanii Dekstran Leuconostoc mesenteroides Nizyna Streptococcus lactis Preparaty lecznicze Lactobacillus: L.acidophilus, L.bijidus

20 Filogenetyczne relacje pomiędzy promieniowcami i bakteriami pokrewnymi Podkreślono rodzaje mające znaczenie biotechnologiczne Gwiazdkami oznaczono rodzaje zaliczane do promieniowców według tradycyjnych kryteriów morfologicznych (wg A. Chmiela)

21 Wybrane produkty metabolizmu promieniowców Antybiotyki: aktynomycyna Rodzaj Streptomyces nowobiocyna amfoterycyna B nystatyna blastomycyna S oksytetracyklina bleomycyna polifungina chlorotetracyklina oleandomycyna cykloheksimid spektynomycyna erytromycyna streptomycyna kanamycyna tetracyklina kasugamycyna tobramycyna linkomycyna tylozyna mitomycynam wankomycyna monenzyna wiomycyna gentamycyna ryfamycyna kobalamina (B 12 ) Inne rodzaje: Micromonospora purpurea Nocardia mediterranea Witaminy: Streptomyces olivaceus

22 proteaza izomeraza glukozowa Enzymy: Streptomyces sp. Actinoplanes missouriensis Inhibitory enzymów (w nawiasie nazwa enzymu): bestatyna (aminopeptydaza B) Streptomyces olworeticuli forfenicyna (alkal.fosfataza) Streptomyces flurovirialis pepstatyna (pepsyna) Streptomyces testaceus reticulol (fosfodiesteraza camp) Streptomyces moberensis Substancje powierzchniowo czynne: kwasy karboksylowe pochodne trehalozy (dimykolowe, diacylowe) Nocardia sp. Nocardia sp.

23 Wybrane produkty metabolizmu grzybów strzępkowych Antybiotyki cefalosporyna C cyklosporyna fumagilina gryzeofulwina kwas fusydowy penicylina G wariotvna Cephulosporium acremonium Tyolypocladium injlatum Aspergillus fumigatus Penicillium griseofulvus Fusidium coccineum Penicillium chrysogenum Paecilomyces narioti Witaminy i inne substancje aktywne biologicznie ryboflawina (B 2 ) alkaloidy gibereliny Ashbya gossypii, Eromothecium ashbyii Claviceps purpurea, Claviceps paspali Giberella fujikuroi (Fusarium moniliforme)

24 Wybrane produkty metabolizmu grzybów c.d. acylaza L-aminokwasowa enzymy amylolityczne enzymy pektynolityczne enzvmv celulolityczne enzymy lipolityczne dekstranaza b-glukanaza glukoamylaza inwertaza katalaza laktaza oksydaza glukozowa proteazy Enzymy Aspergillus oryzae Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus niger, Aspergillus wentii. Aspergillus niger, Trichodermu liride, Aspergillus spp., Mucor miehei Penicillium lilacinum, Penicillium funiculosum Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Aspergillus oryzae, Aspergillus niger Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger, Aspergillus oryzae Aspergillus niger, Aspergillus oryzae Penicillium notatum, Aspergillus niger, Aspergillus sp., Mucor sp.

25 Wybrane produkty metabolizmu grzybów c.d. Inne produkty: etanol, napoje alkoholowe glicerol kwas cytrynowy kwas fusarowy kwas glukonowy kwas itakonowy Saccharomyces ceretisiae, Saccharomyces uvarum i inne Saccharomyces cerevisiae Aspergillus niger, Candida lipolytica Fusarium sp. Aspergillus niger Aspergillus terreus, Aspergillus itaconicus

26 Szacunkowa liczba antybiotyków wytwarzanych przez ważniejsze grupy drobnoustrojów

27 Cele procesów biotechnologicznych z wykorzystaniem kultur mycelialnych grzybów wyższych izolacja z mycelium lub podłoża pohodowlanego substancji farmakologicznie czynnych biosyntezowanych przez komórki grzyba;?

28 wg Wasser i Weis,mod. Grzyby lecznicze około 700 (?) gatunków grzybów klasy Basidiomycetes >30 wykorzystywane w lecznictwie (leki, suplementy diety)

29 Hodowle komórek ssaków Cele stosowania (komórki pierwotne i hybrydy) Otrzymywanie czynników wzrostu i hormonów Otrzymywanie czynników trombolitycznych i angiogennych Produkcja szczepionek Testy cytotoksyczności Testy farmakologiczne Wytwarzanie przeciwciał monoklonalnych

30 Hodowle pierwotnych komórek ssaków - problemy: Duże rozmiary komórek Brak ściany komórkowej komórki wrażliwe na stres fizyczny Konieczność stosowania bardzo złożonych pożywek (dodatki hormonalne, czynniki wzrostu, insulina) Wzrost jest ograniczony (wyjątek linie komórek nowotworowych)

31 Stosowane techniki: Hodowle okresowe Hodowle na nośnikach A suspension culture in serum-free media, this singleuse bioreactor set-up at Wyeth (now part of Pfizer) graced the cover of BPI s September 2011 issue. This scanning electron micrograph of Vero cells cultured on microcarrier beads with Thermo Fisher Scientific media appeared on BPI s April 2010 cover.

32 Hodowle ciągłych linii komórkowych, uzyskanych przez fuzję z komórkami nowotworowymi Wykazują te same fazy wzrostu co drobnoustroje Mogą być hodowane podobnie jak drobnoustroje miesiącami i latami Stosowane techniki: Podobne jak w przypadku drobnoustrojów Animal cells cultivation in fermenter Karel Schmiedberger ml. - vlastní foto / own work

33 Hodowle komórek ssaków produkty stosowane, gdy produktu nie można uzyskać z zastosowaniem drobnoustrojów (biogenne substancje czynne z z prawidłową strukturą glikozylacji i sfałdowaniem białek)

34 Hodowle komórek roślinnych Cele stosowania: Otrzymywanie metabolitów wtórnych Problemy: Wolno przebiegający metabolizm Stosuje się hodowle heterogenne (wolno i szybko rosnące komórki tej samej linii) Po przeniesieniu zróżnicowanych komórek do hodowli następuje ich odróżnicowanie i powstają komórki omnipotentne wykazujące niewielkie zdolności biosyntezy metabolitów wtórnych Opłacalnośc stosowania takich metod mniejsza niż uprawy

35 Hodowle komórek roślinnych Problemy: Podłoża wymagają dodatków czynników wzrostu i prekursorów Po naniesieniu na podłoże komórki roślinne wyrastają do kultur kalusowych z których rozwija się normalna zdrowa roślina plant regeneration from cell suspension culture

36 Porównanie systemów komórkowych wg O. Kayser, Podstawy biotechnologii farmaceutycznej