Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych

Transkrypt

1 Komórka i jej składniki 1

2 Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Najważniejsze rodzaje komórek stosowanych w biotechnologii przemysłowej Komórki prokariotyczne: aminokwasów, białek 1. Bakterie gramdodatnie i gramujemne producenci kwasów, alkoholi, - w tym promieniowce producenci antybiotyków Komórki eukariotyczne 2. Grzyby drożdże grzyby pleśniowe producenci etanolu i białek producenci białek i antybiotyków, i niektórych związków prostych 3. Komórki zwierzęce - komórki owadzie, CHO, BHK producenci białek

3 Komórki bakteryjne Morfologia komórek bakteryjnych

4 Prokariotyczna komórka bakteryjna

5 Skład i funkcja biologiczna elementów komórki prokariotycznej Składnik Skład molekularny Funkcja biologiczna Ściana komórkowa, wici i rzęski Błona komórkowa, mezosom Polisacharydy usieciowane peptydami, otoczone lipopolisacharydami Biwarstwa lipidowo (40%) -białkowa (60%); mezosom to wpuklenie błony Ochrona przed stresem osmotycznym i mechanicznym, Ruch (wici), adhezja i koniugacja (rzęski) Selektywnie przepuszczalna bariera umożliwiająca transport składników pokarmowych i metabolitów Obszar jądrowy Rybosomy Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych Kompleksy RNA (65%) i białek (35%) Genom. Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej Miejsce biosyntezy białek Cytoplazma Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych

6 Komórki bakteryjne są otoczone ścianą komórkową Uproszczone struktury osłon zewnętrznych komórek bakteryjnych

7 Bakteryjna ściana komórkowa i jej biosynteza to miejsca działania ważnych antybiotyków Antybiotyki beta-laktamowe Peptydoglikan Liza komórki bakteryjnej Wankomycyna

8 Promieniowce (Actinomycetales)

9 Eukariotyczna komórka zwierzęca

10 Eukariotyczna komórka roślinna

11 Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Skład i funkcja biologiczna organeli komórki eukariotycznej Organela Skład molekularny Funkcja biologiczna Błona komórkowa Biwarstwa lipidowo (50%) -białkowa (50%); Selektywna bariera transportowa; komunikacja międzykomórkowa Jądro Siateczka środplazmatyczna z rybosomami Aparat Golgiego Mitochondria Lizosomy (zwierzęta) Peroksysomy (zw.) lub glioksysomy (rośliny) Chloroplasty (rośliny) Cytoplazma Zawiera chromatynę -kompleks DNA i białek histonowych + RNA Zespoły błon lipidowo-białkowych + rybosomy j.w. + polisacharydy Otoczone podwójną błoną, zawierają enzymy, DNA i RNA Pęcherzyki zawierające enzymy hydrolityczne Pęcherzyki zawierające katalazę i inne enzymy utleniające Otoczone podwójną błoną, zawierają białka, lipidy, chlorofil, RNA, DNA i rybosomy Małe cząsteczki, białka rozpuszczalne, enzymy, sole nieorganiczne, cytoskeleton Miejsce przechowywania i powielania informacji genetycznej i transkrypcji Miejsce biosyntezy białek Miejsce wydzielania odpadów komórkowych i obróbki białek Miejsce części reakcji katabolicznych i syntezy ATP Metabolizm materiałów pobranych na drodze endocytozy Miejsce reakcji katabolicznych, w których powstaje H 2 O 2 Miejsce fotosyntezy Miejsce zachodzenia większości reakcji metabolicznych oraz struktura nadająca kształt komórce

12 Jądro komórkowe Obraz komórek HeLa z jądrami komórkowymi zaznaczonymi barwnikiem Hoechst

13 Mitochondrium Obraz w mikroskopie elektronowym mitochondriów komórek pęcherzyków płucnych

14 Siateczka śródplazmatyczna retikulum endoplazmatyczne 1- jądro; 2 por jądrowy; 3 szorstkie RE; 4 gładkie RE; 5 rybosom; 6 białko transportowane w RE; 7 pęcherzyk transportowy; 8 aparat Golgiego (AG); 9 strona cis AG; 10 strona trans AG; 11 cysterna AG Obraz w mikroskopie elektronowym retikulum endoplazmatycznego

15 Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Rybosomy Rybosomy prokariotyczne: 30S + 50S 70S Rybosomy eukariotyczne: 40S + 60S 80S Wizualizacja struktury rybosomu Katalityczny rdzeń rybosomu Struktura zbudowany jestrybosomu z rrna

16 Grzyby w biotechnologii Grzyby są organizmami heterotroficznymi pasożyty lub saprofity Przykłady ról grzybów w środowisku: - dekompozycja martwej tkanki biologicznej (np. degradacja składników drewna) - czynniki chorobotwórcze rośliny (ponad chorób), zwierzęta - Mycorrhizae symbioza z korzeniami roślin W biotechnologii - procesy fermentacyjne, wytwarzanie antybiotyków producenci białek terapeutycznych

17 Drożdże Budowa komórki drożdżowej Obraz komórek drożdży w skaningowym mikroskopie elektronowym Morfologia drożdży

18 chityna mannoproteiny Struktura grzybowej ściany komórkowej

19 GRZYBY Zygomycetes grzyby pleśniowe, sprzężniaki Grzybnia zbudowana z niepodzielnego mycelium. Rozmnażanie płciowe poprzez zarodniki zwane zygosporami lub bezpłciowe poprzez spory w sporangium. Mucor racemous Aspergillus fumigatus Ascomycetes workowce Grzyby jednokomórkowe lub tworzące grzybnię w postaci podzielnych strzępek. Rozmnażanie płciowe poprzez askospory lub bezpłciowe przez konidia. Do tej klasy należą m.in. Neurospra, Penicillium. Penicillium chrysogenum

20 Basidomycetes podstawczaki Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Rozmnażanie płciowe poprzez basidospory lub bezpłciowe poprzez konidia. Do tej klasy należą grzyby kapeluszowe. Amanita phalloides Deuteromycetes grzyby niedoskonałe Grzyby jednokomórkowe lub rozgałęzione. Cecha charakterystyczna brak rozmnażania płciowego. Candida albicans

21 Grzyby pleśniowe Aspergillus nidulans

22 Grzyby - rozmnażanie

23 Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Drobnoustroje jako biologiczne źródło nowych potencjalnych leków Drobnoustroje prokariotyczne i eukariotyczne wytwarzają olbrzymią ilość małocząsteczkowych metabolitów wtórnych, z których wiele wykazuje selektywną toksyczność wobec innych drobnoustrojów (antybiotyki przeciwdrobnoustrojowe), działanie przeciwnowotworowe (antybiotyki przeciwnowotworowe), ale także obniżające ciśnienie, hamujące biosyntezę cholesterolu, o działaniu przeciwbólowym, immunosupresyjnym i innym. - wyizolowano i opisano około metabolitów wtórnych; - połowa z nich działa antybiotycznie lub cytostatycznie - zastosowanie medyczne około 150 Potencjalne dalsze możliwości: - z gatunków bakterii poznano około z 1,5 mln gatunków grzybów poznano około bardzo słabo poznane: drobnoustroje morskie, ekstremofilne

24 Biofarmaceutyki białkowe Systemy ekspresyjne: Komórki ludzkie gen zmodyfikowany w obszarze promotora CHO Chinese hamster ovary (komórki jajnika chomika chińskiego) BHK baby hamster kidney (komórki nerki chomika) Komórki owadzie, gen włączony w genom baculowirusa Autographa californica Drożdże S. cerevisiae, Pichia pastoris Bakterie E. coli, Bacillus spp. Transgeniczne rośliny i zwierzęta

25 The purpose of micro-organism is......to make another micro-organism Cel procesu biotechnologicznego: 1) jak najwięcej komórek drobnoustrojów w jak najkrótszym czasie... lub 2) jak najwięcej pożądanego produktu Przypadek 2) sprzeczny z życiowym celem drobnoustroju

26 Metabolizm = anabolizm + katabolizm Procesy anaboliczne endoergiczne i redukcyjne Procesy kataboliczne egzoergiczne i utleniające

27 Bilans masowy utleniania glukozy w warunkach tlenowych i beztlenowych

28 Metabolizm kluczowe cząsteczki A + B + ATP AB + ADP + P i A + B + ATP AB + AMP + PP i A + ATP A-P + ADP

29 Etapy katabolizmu

30 Główne szlaki kataboliczne jako źródła prekursorów dla biosyntezy składników biomakromolekuł Wykład 2 Biologiczne podstawy procesów biotechnologicznych Katabolizm

31 W warunkach beztlenowych w mięśniu pirogronian jest przekształcany w mleczan Obecność dodatkowej reakcji umożliwia regenerację NAD + Cykl Corich Mleczan powstający w pracującym mięśniu ulega w wątrobie przekształceniu w glukozę

32 Przekształcenie pirogronianu w etanol w komórkach drożdży w warunkach fermentacji alkoholowej

33 Produkty metabolizmu beztlenowego w różnych drobnoustrojach Reakcje prowadzące do odtworzenia NADH są zaznaczone jako R

34 Regulacja metabolizmu drobnoustrojów Zasady podstawowe 1. Równowaga pomiędzy procesami wytwarzającymi i zużywającymi metabolity pośrednie 2. Energetyczne sprzężenie metabolizmu bilansowanie zysku reakcji katabolicznych z sumą potrzeb energetycznych komórki

35 Etapy ekspresji genu

36 Regulacja ekspresji genu przez białka regulatorowe

37 Główne mechanizmy regulacji transkrypcji genów kodujących enzymy metabolizmu podstawowego Katabolizm: indukcja substratowa Substrat lub jego metabolit działa jako induktor lub efektor pozytywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu danego substratu -represja kataboliczna Łatwiej przyswajalne źródło węgla lub efektor syntezowany w komórce w jego obecności działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Regulacja dotyczy szlaku katabolizmu trudniej przyswajalnego źródła węgla -represja azotowa j.w., ale dotyczy szlaku przyswajania źródła azotu. Dotyczy także białek transportowych Anabolizm: - represja końcowym produktem szlaku końcowy produkt szlaku działa jako korepresor lub efektor negatywny aktywatora. Dotyczy szlaku biosyntezy -atenuacja mechanizm specyficzny dla drobnoustrojów prokariotycznych

38 Diauksja dwufazowość wzrostu drobnoustrojów w obecności dwóch źródeł węgla Produkcja penicyliny przez Penicillum chrysogenum

39 Inne mechanizmy regulacji metabolizmu podstawowego Regulacja aktywności enzymów 1. Enzymy regulatorowe regulacja allosteryczna 2. Kowalencyjna modyfikacja enzymów 3. Kompleksy wieloenzymowe Regulacja transportu metabolitów 1. Transport białek przez błony 2. Regulacja ilości i aktywności białek transportowych (permeaz)

40 Grupy specyficznych produktów metabolizmu drobnoustrojów alkaloidy fenazyny pirydyny aminocukry flawonoidy pirole aminoglikozydy fosfoglikolipidy pirony aminokwasy ftalaldehydy poliacetyleny antocyjaniny glikozydy polieny ansamycyny hydroksyloaminy polietery antrachinony laktony polikwasy antracykliny makrolidy polipeptydy chinoliny naftochinony polisacharydy chinolinony nitryle salicylany chinony nukleozydy steroidy depsipeptydy peptydy tetracykliny

41 Przemiany peryferyjne a przemiany centralne

42 Idiolity są syntezowane w idiofazie

43 Koncepcje wyjaśniające przyczyny biosyntezy idiolitów 1. Uzyskanie przewagi w danym środowisku 2. Przystosowanie się do zmieniających się warunków środowiska dzięki dodatkowym szlakom metabolicznym 3. Utrzymanie stanu równowagi ze otoczeniem, gdy normalny wzrost nie jest możliwy 4. Wynik rozregulowania metabolizmu. Nadprodukcja idiolitów rodzajem wentyla dla niezbilansowanych przemian 5. Obszar wolnej gry ewolucyjnej poza zakresem ścisłych reguł selekcji eliminujących zmiany niekorzystne dla organizmu. Niektóre z idiolitów znajdują w końcu zastosowanie w metabolizmie producenta

44 Szlaki biosyntezy metabolitów wtórnych 1. Szlak poliketydowy 2. Polimeryzacja jednostek izoprenoidowych 3. Nierybosomalna synteza peptydów 4. Mieszana biosynteza poliketydów i peptydów 5. Biosynteza aminoglikozydów oraz amino- i peptydylonukleozydów Fazy biosyntezy metabolitów wtórnych 1. Biosynteza i aktywacja prekursorów 2. Oligomeryzacja 3. Modyfikacja 4. Kondensacja składników 5. Modyfikacje końcowe 6. Ukierunkowany eksport

45 Szlak poliketydowy biogeneza niektórych antybiotyków

46 Regulacja biosyntezy idiolitów MECHANIZMY KONTROLI BIOSYNTEZY IDIOLITÓW - indukcja substratowa; - indukcja powodowana przez regulatory metaboliczne; - represja i hamowanie kataboliczne; - regulacja związkami azotu; - regulacja fosforanowa i energetyczna; - hamowanie w sprzężeniu zwrotnym zarówno przez metabolity podstawowe jak i specyficzne; - regulacja z udziałem pierwiastków śladowych; - regulacja tlenowa; - regulacja innymi czynnikami, takimi jak temperatura lub ph

47 Regulacja biosyntezy idiolitów 1. Biosynteza cefalosporyny C w C. acremonium obecność w podłożu DL-cysteiny lub DL-norleucyny 2. Biosynteza alkaloidów sporyszu przez grzyby Clavicepsis DL-tryptofan Indukcja substratowa Warunek induktor dodawany w fazie wzrostu, a nie w fazie produkcji

48 Regulacja biosyntezy idiolitów Regulacja fosforanowa Zasada ogólna niskie stężenie fosforanu stymuluje biosyntezę idiolitów

49 Inżynieria metaboliczna szczepów przemysłowych Producenci metabolitów pierwotnych: - wprowadzenie zmian umożliwiających nadprodukcję - maksymalizacja nadprodukcji - zmiany umożliwiające pozakomórkowe wydzielanie produktu Producenci metabolitów wtórnych: - maksymalizacja wydajności produktu -możliwość wytwarzania produktów innych niż naturalny

50 Cechy szczepu wysokowydajnego maksymalna wydajność pożądanego produktu minimalizacja wytwarzania niepożądanych produktów ubocznych stabilność genetyczna odporność na zakażenia wirusowe

51 Klasyczne metody otrzymywania i hodowli szczepów wysokowydajnych nieukierunkowane zmiany genetyczne - mutageneza wytwarzanie, fuzja i odnawianie protoplastów optymalizacja warunków wzrostu

52 Mutanty szczególnie przydatne dla otrzymywania wysokowydajnych producentów metabolitów pierwotnych MUTANTY AUKSOTROFICZNE (ŻYWIENIOWE) Komórki pozbawione aktywności co najmniej jednego enzymu katalizującego reakcję szlaku biosyntetycznego MUTANTY REGULATOROWE -mutacja w genie regulatorowym lub w obszarze promotorowym powodująca stałą derepresję biosyntezy; -mutacja w genie strukturalnym, w efekcie której produkt genu ma niezmienioną aktywność katalityczną, ale traci wrażliwość na działanie inhibitora allosterycznego

53 Cel uzyskanie nadprodukcji związku G Możliwość osiągnięcia celu: Mutant auksotroficzny wobec związku F

54 Biosynteza kwasu cytrynowego Cykl Krebsa

55 Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger Aktywność fosfofruktokinazy I, kluczowego enzymu regulatorowego glikolizy jest hamowana przez ATP i cytrynian Efekt Pasteura U drobnoustrojów względnie anaerobowych, wydajność biomasy jest dużo większa w obecności tlenu, który hamuje fermentację alkoholową. Mechanizm: hamowanie glikolizy przez ATP i cytrynian Efekt Crabtree W hodowlach tlenowych następuje częściowe hamowanie oddychania przy bardzo dużych stężeniach glukozy

56 Nadprodukcja kwasu cytrynowego w Aspergillus niger Droga alternatywna funkcjonuje w warunkach niskiego stężenia fosforanów I silnego napowietrzania

57 Jakie warunki należy spełnić, aby możliwa była wysoko wydajna produkcja kwasu cytrynowego? 1. Wysoko wydajny szczep Aspergillus niger - obecność alternatywnego łańcucha oddechowego - mutant regulatorowy PFK-I niewrażliwa na hamowanie przez cytrynian 2. Odpowiednie warunki hodowli -skład pożywki: wysokie stężenie cukru; niskie stężenie jonów Fe(II) i Mn(II; niskie ph, około 2); niskie stężenie fosforanów - bardzo intensywne napowietrzanie

58 Hybrydyzacja fuzja protoplastów Przykłady zastosowania: Praktycznie wszystkie szczepy przemysłowe używane do produkcji antybiotyków w wiodących firmach farmaceutycznych są rekombinantami otrzymanymi w wyniku fuzji protoplastów; Szczepy zawierające wiele kopii genów odpowiedzialnych za biosyntezę antybiotyku (np. Penicillium chrysogenum zaw. 20 zestawów genów kodujących wytwarzanie penicyliny G); Fuzja protoplastów dwóch szczepów Cephalosporium acremonium wytwarzających cefalosporynę C: wysokowydajnego, ale wolno rosnącego i nie wytwarzającego spor oraz drugiego o cechach odwrotnych. Rekombinant posiadał kombinację cech korzystnych; wydajność o 40% lepsza niż wydajniejszy ze szczepów rodzicielskich.