Po co neurobiologom indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste?

Transkrypt

1 Po co neurobiologom indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste? Ewa Liszewska * Jacek Jaworski * Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, Warszawa * Międzynarodowy Instytut Biologii Molekularnej i Komórkowej, ul. Trojdena 4, Warszawa; tel.: (22) /57, eliszewska@iimcb.gov.pl, jaworski@iimcb.gov. pl Artykuł otrzymano 7 marca 2013 r. Artykuł zaakceptowano 22 marca 2013 r. Słowa kluczowe: indukowane neurony, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste, choroby układu nerwowego, reprogramowanie komórek, medycyna regeneracyjna, modelowanie chorób. Wykaz skrótów: AD choroba Alzheimera; ALS stwardnienie zanikowe boczne; BAM Brn2, Ascl1, Myt1l; ESC zarodkowe komórki macierzyste; HD choroba Huntingtona; in indukowane neurony; insc indukowane neuronalne komórki macierzyste; ipsc indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste; ipsc-n komórki neuronalne uzyskane w wyniku różnicowania ipsc; OKSM Oct4, Klf4, Sox2, c-myc; PD choroba Parkinsona; RTT zespół Retta; SMA rdzeniowy zanik mięśni; UN układ nerwowy Podziękowania: Badania prowadzone przez autorów niniejszej pracy przeglądowej są finansowane z grantu ERA-NET NEU- RON/06/2011 AMRePACELL (współfinansowany przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju) (JJ) oraz w ramach programu HO- MING PLUS (HOMING PLUS/2012-5/6) Fundacji na Rzecz Nauki Polskiej współfinansowanego ze środków Europejskiego Funduszu Rozwoju Regionalnego w ramach Programu Operacyjnego Innowacyjna Gospodarka (EL). Autorzy dziękują także dr Iwonie Cymerman za komentarze do manuskryptu. STRESZCZENIE Przeprogramowywanie komórek somatycznych stworzyło możliwość uzyskania do badań trudnodostępnych komórek ludzkich, np. różnych rodzajów neuronów. Niemal natychmiastową konsekwencją pojawienia się tej technologii było opracowanie licznych modeli komórkowych chorób układu nerwowego. Są one wykorzystywane zarówno do poszukiwania mechanizmów komórkowych tych schorzeń, jak i opracowywania nowych strategii farmakologicznych. Przeprogramowane komórki stanowią również potencjalną alternatywę dla zarodkowych komórek macierzystych w transplantologii. Niniejszy artykuł przedstawia najistotniejsze dokonania w wykorzystaniu technologii przeprogramowywania komórek w neurobiologii, jednocześnie wskazując na ograniczenia tej metodologii i spodziewane kierunki jej rozwoju. WPROWADZENIE Przełomowe odkrycie Yamanaki [1,2], nagrodzone Nagrodą Nobla w dziedzinie fizjologii lub medycyny w 2012 roku, pokazało iż los zróżnicowanych komórek somatycznych nie jest ostatecznie zdefiniowany i można go zmieniać. Przyczyniło się także do dynamicznego rozwoju technologii reprogramowania komórek, dając tym samym dostęp do komórek, które wcześniej były niedostępne lub trudno osiągalne, jak na przykład ludzkie neurony [3-6]. Bezpośrednią konsekwencją tego nowego nurtu badań było uzyskanie licznych linii indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ipsc, ang. induced pluripotent stem cells,) oraz indukowanych neuronów (ang. induced neurons, in) od pacjentów z różnymi chorobami układu nerwowego, np. chorobami neurodegeneracyjnymi, tj. stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS, ang. Amyotrophic lateral sclerosis), chorobą Parkinsona (PD, ang. Parkinson s disease), Alzheimera (AD, ang. Alzheimer s disease) i Huntingtona (HD, ang. Huntington s disease) czy neurorozwojowymi, np. zespołem łamliwego chromosomu X, zespołem Retta. Te linie ipsc posłużyły do podjęcia prób modelowania patologii układu nerwowego w oparciu o uzyskane z nich neurony, hodowane in vitro. Technologia reprogramowania zrodziła także nadzieję na wyjście z impasu etycznego medycyny transplantacyjnej opartej o zarodkowe komórki pluripotencjalne. Zarówno modelowanie chorób, jak i projektowanie terapii komórkowej wykorzystującej ipsc rozwijają się obecnie w błyskawicznym tempie i omówienie wszystkich przykładów i dokonanych przy ich użyciu odkryć przekracza ramy tego artykułu przeglądowego. Dlatego naszym celem było przedstawienie tylko najciekawszych przykładów takich badań w celu przybliżenia czytelnikom możliwości, jakie stworzyła technologia reprogramowania i uzyskiwania ludzkich komórek nerwowych zarówno do badań, jak i celów terapeutycznych. Jednocześnie staraliśmy się wykorzystać te przykłady, aby uświadomić czytelnikom Postępów Biochemii, jakie wyzwania stoją przed tym relatywnie nowym polem badań i gdzie przebiega granica między naszymi dzisiejszymi możliwościami i nadziejami, jakie wzbudziło w środowisku naukowym odkrycie Yamanaki [2]. Wprowadzenie do naszego artykułu stanowi krótkie omówienie podstawowych informacji dotyczących uzyskiwania ipsc oraz ich różnicowania do neuronów oraz metod bezpośredniej produkcji in. OD DOJRZAŁYCH, ZRÓŻNICOWANYCH KOMÓREK SOMATYCZNYCH DO NEURONÓW Obecnie komórki neuronalne możemy uzyskać z komórek somatycznych trzema różnymi sposobami: (1) w wyniku reprogramowania pośredniego, polegającego na przekształceniu komórki somatycznej do indukowanej pluripotencjalnej komórki macierzystej, a następnie zróżnicowaniu jej do neuronu (ipsc-n); (2) na drodze reprogramowania bezpośredniego, zwanego również transdyferencjacją, polegającego na przekształceniu komórki somatycznej do neuronu (in), z pominięciem etapu pluripotencji; oraz (3) poprzez przekształcenie komórek 164

2 Rycina 1. Schemat dostępnych metod uzyskiwania neuronów z łatwo dostępnych komórek somatycznych. (A) przeprogramowanie pośrednie do ipsc-n z wykorzystaniem ipsc, (B) przeprogramowanie bezpośrednie (transdyferencjacja) do indukowanych neuronów (in), (C) przeprogramowanie bezpośrednie do indukowanych neuronalnych komórek macierzystych (insc); wyjaśnienia w tekście. somatycznych do neuronalnych komórek macierzystych (insc, ang. induced neuronal stem cells) i w kolejnym etapie zróżnicowanie ich do neuronu (Ryc. 1). Dotychczas najczęściej stosowana jest metoda najstarsza, polegająca na wykorzystaniu reprogramowania pośredniego. Pierwsze mysie ipsc otrzymano, wprowadzając do fibroblastów, przy pomocy wektora retrowirusowego, cztery geny (w skrócie OKSM): Oct4 (ang. octamer-binding transcription factor 4), Klf4 (ang. Krueppel-like factor 4), Sox2 (ang. sex determining region Y-box 2) i c-myc [2]. W tak zmodyfikowanych komórkach ekspresji zaczęły ulegać geny, normalnie aktywne tylko w komórkach węzła zarodkowego, w początkowych stadiach rozwoju zarodkowego. Rok później tą samą metodą udało się otrzymać pluripotencjalne komórki macierzyste z ludzkich komórek skóry [1]. Spośród genów użytych do reprogramowania OCT4 i SOX2 uważa się za kluczowe w utrzymywaniu pluripotencji, rozumianej jako zdolność do generowania wszystkich rodzajów komórek wywodzących się trzech listów zarodkowych. Faktycznie, zarówno mysie, jak i ludzkie ipsc pod wieloma względami (np. morfologii, zdolności do proliferacji i ekspresji genów) przypominały zarodkowe komórki macierzyste (Ryc. 2). Ponadto, można je było różnicować we wszystkie rodzaje komórek charakterystyczne dla trzech listków zarodkowych, w tym takie, które morfologią oraz profilem produkowanych białek, np. Tuj1 (ang. neuron-specific class III β-tubulin), MAP2 (ang. microtubule associated protein 2), NeuN (ang. Neuronal Nuclei) i synapsyna, przypominały neuron (Ryc. 2). Dalsze badania potwierdziły, iż komórki ipsc-n wytwarzają funkcjonalne połączenia synaptyczne i są w stanie integrować z siecią neuronalną po wszczepieniu do mózgu gryzoni [7-9]. Ponieważ neurony są bardzo zróżnicowaną grupą komórek zarówno w odniesieniu do biologii komórki, jak i specyficznych funkcji pełnionych w układzie nerwowym, ważnym aspektem różnicowania ipsc-n stała się charakterystyka uzyskanych komórek pod względem wydzielanych neurotransmiterów i zawartości markerów białkowych charakterystycznych dla poszczególnych klas neuronów [10,11]. Wykazano, iż zastosowanie zmodyfikowanych warunków hodowli in vitro, polegające na stosowaniu różnych koktajli odpowiednich czynników wzrostowych, pozwala uzyskać szerokie spektrum rodzajów komórek neuronalnych, w tym neurony glutaminergiczne (pobudzające), GABAergiczne (hamujące), dopaminergiczne oraz cholinergiczne (motoryczne). Metoda uzyskiwania ipsc-n z powodzeniem została zastosowana do wytworzenia różnych rodzajów ludzkich neuronów z fibroblastów pacjentów cierpiących na schorzenia neuronalne [4,11-14]. Uzyskanie tych neuronów pozwoliło na opracowanie modeli chorób układu nerwowego (UN), dostarczając cennego narzędzia do badania mechanizmów tych schorzeń [4,11-14]. Niemniej jednak stosowanie do wprowadzenia czynników przeprogramowujących, w tym onkogenu c-myc, wektorów retro- i lentiwirusowych, które losowo wbudowują się do genomu, mogąc tym samym naruszyć jego integralność, budzi obawy przed zastosowaniem ipsc w terapii komórkowej i medycynie regeneracyjnej ze względu na towarzyszące mu ryzyko nowotworzenia. Ponadto, jeśli któraś z komórek wykorzystanych do transplantacji nie uległaby zróżnicowaniu i utrzymała swój pluripotencjalny status, mogłoby to doprowadzić do rozwoju potworniaków, czyli guzów składających się z komórek wywodzących się z trzech listków zarodkowych. Wykorzystując fakt, że komórkowo specyficzne czynniki transkrypcyjne są głównymi regulatorami losu komórek podczas rozwoju zwierząt, podjęto próby bezpośredniego przeprogramowania komórek, czyli przekształcenia jednej komórki somatycznej w zupełnie inną komórkę somatyczną. Pierwsze badania przeprowadzone przez Andersona i współpracowników wykazały, że nadprodukcja neurogeniny 1 (Ngn1) w dermomiotomie kurzego zarodka indukuje ekspresję genów odpowiednich markerów w tych komórkach [15]. Następnie pojawiły się doniesienia, że nadprodukcja białka Pax6 (ang. paired box 6), charakterystycznego dla neuronalnych komórek macierzystych, w ssaczych komórkach glejowych nadaje im cechy neuronalne [16]. Natomiast wprowadzenie genów kodujących Ascl1 (ang. Achaete-scute homolog 1), Ngn2 (neurogenina 2) i Dlx2 (ang. distal-less homeobox 2) do astrogleju noworodków myszy prowadziło do zmian morfologicznych i funkcjonalnych tych komórek, które nabrały zdolności do generowania potencjałów czynnościowych oraz tworzenia funkcjonalnych połączeń synaptycznych [17]. Z opisanych badań wynikało, że indukcja ekspresji czynników transkrypcyjnych, specyficznych dla neuronów, w innych komórkach somatycznych może prowadzić do wytworzenia funkcjonalnych komórek neuronalnych. W związku z tym pojawiło się pytanie, co się stanie, jeśli zaindukujemy ekspresję neuronalnych czynników transkrypcyjnych w łatwo dostępnych komórkach, np. fibroblastach? Odpowiedzi na te pytania dostarczyli Wernig i jego współpracownicy [18], którzy po przebadaniu 19 genów odgrywających kluczową rolę w rozwoju neuronalnym oraz modyfikacjach epigenetycznych, zidentyfikowali zestaw pięciu (Brn2, ang. Brain 2; Myt1l, ang. myelin transcription factor 1-like; Ascl1; Zic1, ang. Zic family member 1; Olig2, ang. oligodendrocyte transcription factor 2), dzięki którym byli w stanie przekształcić fibroblasty myszy w neurony. Otrzymane komórki, nazwane indukowanymi neuronami, wy- Postępy Biochemii 59 (2)

3 Rycina 2. Przykładowe zdjęcia ludzkich komórek na poszczególnych etapach różnicowania indukowanych komórek macierzystych do neuronów. (A) kolonia ludzkich ipsc; (B, C, D) lokalizacja markerów pluripotencji w ludzkich ipsc: alkaliczna fosfataza (A), Nanog (B), Tra 1-81 (C); (E, F) ludzkie progenitory neuronalne uzyskane z ipsc w formie rozetek (E) i w formie hodowli adherentnej (F), w komórkach uwidoczniono lokalizację markera neuronalnych komórek macierzystych, Nestyny (kolor czerwony); (G, H) neurony uzyskane w wyniku różnicowania ludzkich ipsc, w których uwidoczniono lokalizację markera komórek neuronalnych MAP2 (kolor zielony) po 3 (G) i 10 (H) dniach różnicowania. kazywały nie tylko spodziewaną morfologię i syntezę właściwych markerów, ale również posiadały zdolność generowania potencjałów czynnościowych i tworzenia połączeń synaptycznych [18]. W późniejszych badaniach zawężono grupę genów niezbędnych do otrzymania in do Brn2, Ascl1 i Myt1l (określanych wspólnie skrótem BAM). Większość z otrzymanych in stanowiły neurony glutaminergiczne. Wydajność procesu bezpośredniego przeprogramowania, w porównaniu do metody otrzymywania neuronów opartej na reprogramowaniu pośrednim, znacznie wzrosła, osiągając 20%, w przypadku zastosowania, jako materiału wyjściowego, fibroblastów zarodkowych. Jednocześnie skrócono czas potrzebny do otrzymania funkcjonalnych neuronów do 2 tygodni [18]. Zakończone sukcesem wytworzenie mysich in obudziło nadzieje na opracowanie podobnej technologii produkcji neuronów z komórek ludzkich. Liczne grupy badawcze na całym świecie podjęły próby ich otrzymania stosując koktajl genów BAM. Okazało się jednak, że zestaw czynników wystarczający do transdyferencjacji zastosowany u myszy był nieefektywny w przypadku komórek człowieka. Brn2, Ascl1 i Myt1l indukowały w tych komórkach jedynie syntezę markerów i morfologię neuronalną. Nie były natomiast w stanie wymusić zmian funkcjonalnych. Dalsze badania wykazały, że do wytworzenia ludzkich in (hin), oprócz BAM, niezbędne są dodatkowe czynniki, np. NEUROD1/2 [19], ZIC1 [20] lub mikrorna [21,22]. Ponadto stwierdzono, że dodanie do wybranych, podstawowych genów przeprogramowujących genów kodujących czynniki transkrypcyjne charakterystyczne dla konkretnych rodzajów neuronów dodatkowo zwiększa szansę uzyskania populacji in wzbogaconej np. o neurony dopaminergiczne (wykorzystano: Ascl1; Nurr1, ang. nuclear receptor related 1 protein; Lmx1a, ang. LIM homeobox transcription factor 1) [23] lub motoryczne (wykorzystano: BAM + HB9, ang. Homeobox HB9; ISL1, ang. Lim-homeodomain protein Islet1; LHX3, ang. LIM homeobox 3; NGN2; NEUROD1) [24]. Pierwsze hin uzyskane metodą bezpośredniego przeprogramowania pochodziły z fibroblastów osób cierpiących na chorobę Alzheimera (AD) [20]. Fibroblasty pacjentów przeprogramowano przy użyciu 5 genów, pierwotnie zidentyfikowanych u myszy: Brn2, Myt1l, Ascl1, Zic1 i Olig2. W otrzymanych hin zaobserwowano zaburzoną produkcją β-amyloidu, co świadczyło o tym, że ludzkie indukowane neurony otrzymane od pacjentów z AD charakteryzują się zaburzeniem typowym dla choroby [20]. Zatem, podobnie jak ipsc-n, także hin okazały się być cennym narzędziem oferującym nowe możliwości poznania budowy i funkcjonowania neuronów, jak również badania mechanizmów rozwoju chorób układu nerwowego. Warto jednak zwrócić uwagę, iż w przeciwieństwie do ipsc i uzyskiwanych z nich ipsc-n, in nie mogą być stosowane do modelowania i poznawania mechanizmów chorób, których podstawą są za

4 burzenia w funkcjonowaniu i różnicowaniu progenitorów neuronalnych, np. w przypadku wielu chorób neurorozwojowych. Wynika to z faktu, że transdyferencjacja omija ten etap rozwoju. Dużym ograniczeniem zastosowania in w podstawowych badaniach laboratoryjnych, terapii komórkowej oraz medycynie regeneracyjnej jest brak możliwości namnażania i pasażowania neuronów, które są komórkami nieproliferującymi. Dlatego też, z praktycznego punktu widzenia, bezpośrednie przeprogramowanie komórek somatycznych do aktywnie dzielących się neuronalnych komórek macierzystych (insc) byłoby lepszym rozwiązaniem i stworzyłoby możliwość uzyskania dużej liczby komórek nerwowych z pominięciem etapu ipsc. W celu otrzymania insc wykorzystano fakt, że czynniki OKSM początkowo wprowadzają przeprogramowywane komórki w niestabilny, plastyczny stan, podczas którego poprzez odpowiednie manipulacje środowiskiem zewnątrzkomórkowym można wpływać na los komórki. Kim i współpracownicy [25] zaledwie trzy dni po wprowadzeniu do fibroblastów czynników OKSM zmienili warunki hodowli komórek na charakterystyczne dla neuronalnych komórek macierzystych (pożywka z dodatkiem czynnika wzrostu fibroblastów [FGF2, ang. fibroblast growth factor 2] i nabłonkowego czynnika wzrostu [EGF, ang. epidermal growth factor]) i tym sposobem uzyskali po raz pierwszy mysie indukowane insc. Otrzymane komórki miały prawidłową morfologię, charakterystyczną dla progenitorów neuronalnych, wykazywały syntezę markerów neuronalnych komórek macierzystych (np. Pax6), aktywnie się dzieliły oraz można było je zróżnicować do różnych rodzajów neuronów (np. pobudzeniowych i GABAergicznych) i astrocytów [25]). W opisanej metodzie uzyskiwania insc, czynniki przeprogramowujące są potrzebne komórce przez krótki czas, co stwarza możliwość zastąpienia wektorów wirusowych koktajlami związków chemicznych, takich jak np. kwas walproinowy (inhibitor deacetylazy histonowej), BIX (inhibitor metylotransferazy histonowej), witamina C, 5-AzaC (inhibitor metylotransferazy DNA), CHIR99021 lub BIO (inhibitory kinazy syntazy glikogenu 3, ang. Glycogen synthase kinase 3, GSK3), ALK5 lub RepSox (inhibitory ścieżki sygnałowej transformującego czynnika wzrostu β, ang. Transforming Growth Factor β, TGFβ), BayK8644 (agonista kanałów wapniowych typu L) oraz kenpaullon (inhibitor kinaz zależnych od cyklin, ang. cyclin-dependent kinases). Niewątpliwie jest to bardzo ważna zaleta opisanej metody, pozwalająca na uzyskiwanie bezpieczniejszych insc, które miałyby potencjalne zastosowanie w terapii komórkowej i medycynie regeneracyjnej. W kolejnych próbach otrzymywania insc stosowano różne zestawy genów oraz materiał wyjściowy: mysie fibroblasty c-myc, Klf4, Sox2 oraz E47/TCF3 (ang. E2A immunoglobulin enhancerbinding factors E12/E47) i Brn4 (ang. Brain 4) zamiast Oct4 [26] lub Brn2, Sox2 oraz FoxG1 (ang. forkhead box G1) [27]; komórki Sertoliego - Pax6, Ngn2, Hes1 (ang. hairy and enhancer of split-1), Id1 (ang. inhibitor of DNA binding 1), Ascl1, Brn2, c-myc oraz Klf4 [28]. Intensywne badania w tej dziedzinie doprowadziły do uzyskania zarówno z mysich, jak i ludzkich fibroblastów insc przy użyciu zaledwie jednego czynnika Sox2 [29]. WYKORZYSTANIE PRZEPROGRAMOWANYCH NEURONÓW DO MODELOWANIA I OPRACOWANIA NOWYCH TERAPII CHORÓB UKŁADU NERWOWEGO Opisane powyżej protokoły produkcji ludzkich ipsc-n, in i insc wzbudziły ogromne zainteresowanie i entuzjazm, ponieważ ich bezpośrednią implikacją była możliwość uzyskania komórek nerwowych o określonej charakterystyce, pochodzących od osób cierpiących na choroby układu nerwowego [4,11,14]. To z kolei daje szansę opracowania nowych modeli do badania i projektowania terapii tych schorzeń. Powstaje pytanie, jakie są ich zalety i wady, w porównaniu do modeli, którymi dysponujemy obecnie. Dotychczas najczęściej w tego rodzaju badaniach wykorzystywane są zwierzęta laboratoryjne. Zmiany patologiczne mogą być w nich indukowane zarówno farmakologicznie (np. wywołanie degeneracji prążkowia podaniem 6-hydroksydopaminy [6-OHDA, ang. 6-hydroxydopamine], wywołanie epilepsji podaniem pilokarpiny lub kainianu), genetycznie (np. transgenizacja zmutowanymi formami genów kodujących białko prekursora amyloidu [APP, ang. Amyloid precursor protein] czy presyniliny [Psen 1 lub 2]), jak i poprzez ingerencję chirurgiczną (np. udar, uszkodzenie rdzenia kręgowego). Zaletą tego modelu badawczego jest możliwość analizy zmian patologicznych i ich mechanizmów molekularnych in vivo. Natomiast jako wadę należy wymienić to, że wykorzystywane w badaniach zwierzęta mają inne rozmieszczenie chromosomowe genów, inny metabolizm oraz nieporównywalnie mniej skomplikowaną organizację mózgu niż ludzie. Skrajny przykład stanowi model zespołu Downa, gdyż geny znajdujące się na ludzkim chromosomie 21 u myszy są rozproszone pomiędzy różnymi chromosomami. W przypadku wielu chorób neurologicznych stworzenie modeli zwierzęcych jest w zasadzie niemożliwe ze względu na złożoność ludzkich funkcji kognitywnych. W związku z tym konieczne jest bazowanie na modelach poszczególnych aspektów takich schorzeń, jak na przykład schizofrenia [30,31]. Część problemów związanych z różnicami gatunkowymi dotychczas rozwiązywano, badając łatwo dostępne komórki pochodzące od pacjentów, np. fibroblasty czy limfocyty. Wadą tego podejścia jest niewielkie podobieństwo funkcjonalne tych komórek do neuronów, których funkcje są zaburzone w poszczególnych chorobach UN. W związku z powyższym możliwość uzyskiwania ipsc-n, in i insc od pacjentów stanowi znaczący postęp w opracowywaniu modeli in vitro chorób UN. Co więcej, technologie te, w przypadku możliwości porównania próbek od licznych pacjentów, najprawdopodobniej pozwolą w przyszłości zrozumieć interakcję zaburzonych genów z tłem genetycznym poszczególnych osób. Nie są to jednak modele pozbawione wad [3,32]. Podstawową jest to, iż ipsc-n, in i insc są modelami in vitro i w związku z tym nie uwzględniają wpływu złożonego środowiska układu nerwowego. Jednak, jak omówiono poniżej, prowadzone obecnie badania starają się przynajmniej częściowo uwzględniać te problemy. Jednym z podejść jest transplantacja komórek nerwowych uzyskanych w wyniku różnicowania ipsc lub bezpośredniego przeprogramowania komórek somatycznych do mózgu zwierząt. Innym, znajdującym zastosowanie szczególnie w przypadku modeli chorób neurodegeneracyjnych, jest stosowanie czynników stresowych. Podsumowując, użycie ipsc, uzyskanych od pacjentów cierpiących na Postępy Biochemii 59 (2)

5 daną chorobę, w wielu przypadkach pozwala na symulację mechanizmów patofizjologicznych choroby i pozwala na modelowanie jej przebiegu z uwzględnieniem indywidualnego tła genetycznego. Biorąc pod uwagę niewątpliwe korzyści płynące z możliwości wykorzystania technologii przeprogramowywania w badaniu chorób układu nerwowego nie dziwi fakt, iż w ciągu ostatnich 3 lat opracowano liczne modele takich chorób w oparciu o tę technologię [11,13,14,33]. Poniżej omówione zostały tylko wybrane przykłady, które w naszym przekonaniu pozwalają przybliżyć strategię badania tak różnych zjawisk, jak monogenowe choroby neurorozwojowe, choroby wielogenowe oraz choroby neurodegeneracyjne. Więcej szczegółowych informacji czytelnicy mogą znaleźć w licznych pracach przeglądowych opublikowanych ostatnio [11,12,14,33]. Pierwszym modelem choroby układu nerwowego uzyskanym przy użyciu ipsc, w którym udało się uzyskać in vitro zmiany patologiczne charakterystyczne dla tego schorzenia, był model rdzeniowego zaniku mięśni (SMA, ang. spinal muscular atrophy) [34]. SMA jest autosomalną recesywną chorobą genetyczną wywołaną mutacjami genu SMN1 (ang. survival motor neuron 1), prowadzącymi do obniżenia w komórkach poziomu kodowanego przez ten gen białka. W efekcie dochodzi do wybiórczej degeneracji motoneuronów w obrębie rdzenia kręgowego, co prowadzi do zaniku mięśni i śmierci najpóźniej w drugim roku życia. Ebert i współpracownicy w pierwszej kolejności uzyskali ipsc poprzez transdukcję fibroblastów pacjenta wektorem lentiwirusowym kodującym OCT4, SOX2, NANOG i LIN28. Następnie ipsc pacjenta oraz komórki kontrolne, uzyskane od jego matki zróżnicowano do ipsc-n. Pośród nich można było wyróżnić motoneurony, co potwierdzono, badając syntezę charakterystycznych markerów, SMI-32 i acetylotransferazy choliny. Analiza uzyskanych komórek wykazała obniżony poziom ekspresji SMN1 w komórkach pacjenta, ich zmniejszone ciało komórkowe oraz przedwczesną degenerację motoneuronów, objawy spójne z obrazem klinicznym [34]. Rdzeniowy zanik mięśni, w związku ze znaną wcześniej przyczyną patologii, okazał się być relatywnie prostą chorobą do modelowania przy wykorzystaniu ipsc-n. Było to związane także z tym, iż SMA objawia się w pierwszych dwóch latach życia. Próby otrzymania modeli chorób o bardziej złożonym podłożu lub pojawiających się w późniejszym wieku takich, jak ALS czy HD, podjęte jeszcze przed badaniami Eberta i współpracowników [34], wykazały możliwość uzyskania neuronów z ipsc pacjentów, ale nie powiodły się w kontekście uzyskania spodziewanych efektów fenotypowych towarzyszących chorobom [35,36]. Jednak praca Dimosa i współpracowników [35] była ważnym krokiem, ponieważ pokazała, iż można uzyskać ipsc, a następnie neurony od pacjentów w bardzo podeszłym wieku, co jest kluczowe dla modeli np. AD. W przypadku tej ostatniej choroby udało się uzyskać zarówno ipsc-n, jak i in od pacjentów, u których AD wystąpiło z różnych przyczyn [20,37,38]. W większości tych modeli, niezależnie od przyczyny choroby (np. postać sporadyczna vs. rodzinna; mutacje w genach kodujących APP lub PSEN) stwierdzono wzrost produkcji szkodliwych form β-amyloidu, co jest jednym z symptomów AD. W przypadku pracy grupy Goldsteina [37] potwierdzono również wystąpienie w ipsc-n innych zmian typowych dla AD, np. podniesienie poziomu aktywnej izoformy β kinazy 3 syntazy glikogenu (ang. Glycogen synthase kinase 3β, GSK3β) oraz fosforylacji treoniny 231 białka Tau. Jednak we wszystkich cytowanych pracach nie wykazano najważniejszej cechy patologii AD, czyli śmierci komórek nerwowych. W ostatnich latach, w przypadku modeli niektórych chorób neurodegeneracyjnych, znaleziono kilka rozwiązań problemu braku zmian patologicznych np. zadziałanie czynnikami stresowymi na uzyskane neurony. I tak na przykład Nguyen i współpracownicy [39] wykazali zwiększoną śmierć dopaminergicznych ipsc-n od pacjentów z PD (z mutacją powodującą substytucję glicyny 2019 do seryny w kinazie LRRK2, ang. Leucine-rich repeat kinase 2), po podaniu H 2 O 2, 6-OHDA lub inhibitorów proteasomu. Ta obserwacja jest zgodna z postulowanym mechanizmem choroby, w myśl którego śmierć neuronów dopaminergicznych jest spowodowana niekorzystną kombinacją podwyższonego stresu oksydacyjnego i zaburzeń w procesach degradacji białek. Różne czynniki stresowe wykorzystywano także w modelach ALS [40] i HD [41]. W pierwszym przypadku podanie arsenianiu powodowało podwyższoną śmiertelność komórek ipsc-n pacjentów. W przypadku HD, Jeon i współpracownicy [41] wykazali, iż podanie inhibitora proteasomu MG132 indukowało pojawienie się agregatów zmutowanej huntingtyny w ipsc-n pacjenta. Metodą alternatywną do stresowania komórek nerwowych jest długoterminowa ich hodowla [42] lub postarzanie neuroprekursorów poprzez kolejne pasaże [43]. Na przykład Sanchez-Danes i współpracownicy [40] zaobserwowali spontaniczne zmiany patologiczne towarzyszące chorobie Parkinsona tj. degenerację komórek (utrata neurytów i wakuolizacja), aktywację kaspazy 3 oraz zaburzoną autofagię, tylko w ipsc-n pacjentów z PD (mutacje w LRRK2 lub idiopatyczna PD) hodowanych in vitro ponad 75 dni. W przypadku chorób neurodegeneracyjnych aktualne pozostaje jednak pytanie, na ile badanie komórek pacjentów in vitro, w oderwaniu od środowiska całego mózgu, pozwoli rzeczywiście zrozumieć proces chorobowy. W celu odpowiedzi na to pytanie podejmowane są próby wszczepiania ipsc-n lub ich prekursorów do mózgu zwierząt laboratoryjnych. Na przykład, w przypadku HD udało się zaobserwować tworzenie agregatów zmutowanego białka w transplantowanych ipsc-n-hd, jeśli doświadczenia były prowadzone odpowiednio długo (ponad 30 tygodni) [41]. W przypadku większości omówionych powyżej przykładów, modele opracowano w oparciu o łatwo mierzalne i dobrze opisane zjawiska związane z patologią, np. śmierć komórek nerwowych lub nadmierną produkcję toksycznej formy białka. Jednak prawdziwe wyzwanie stanowią te choroby, w przypadku których efekt fenotypowy nie jest dobrze zbadany lub wymaga skomplikowanych pomiarów. Wśród schorzeń układu nerwowego można do nich zaliczyć choroby, które przejawiają się opóźnieniem umysłowym lub zaburzeniami osobowości, np. zespół Retta czy schizofrenia. Opracowanie modeli dla tych dwóch schorzeń opisano bardziej szczegółowo poniżej. Zespół Retta (RTT) to neurologiczne zaburzenie rozwoju, które jest uwarunkowane genetycznie i zaliczane do 168

6 spektrum zaburzeń autystycznych. Za wystąpienie choroby odpowiada mutacja genu MeCP2 (ang. methyl CpG binding protein 2) zlokalizowanego na chromosomie X, kodującego białko zaangażowane w regulację transkrypcji [44]. Chłopcy z mutacją MeCP2 umierają najczęściej zaraz po urodzeniu lub jeszcze w okresie prenatalnym. Dziewczynki zaś nie wykazują jakichkolwiek objawów choroby podczas ciąży i pierwszych 6-18 miesięcy życia, po czym obserwuje się u nich okres stagnacji, a następnie dochodzi do szybkiego zanikania już nabytych umiejętności werbalnych i ruchowych. Klasycznym objawem wyróżniającym tę chorobę jest utrata umiejętności celowego posługiwania się rękoma, która jest zastępowana powtarzanymi stereotypowymi ruchami rąk. Ponadto, u osób z zespołem Retta występuje opóźnienie wzrostu i przyrostu obwodu głowy, zaburzenia poruszania się (ataksja/apraksja), napady padaczkowe oraz cechy autyzmu. W konsekwencji, u chorych rozwija się szereg zaburzeń neurorozwojowych, które w większości wypadków prowadzą do znacznej i głębokiej niepełnosprawności ruchowej oraz znacząco ograniczają możliwość komunikacji z otoczeniem [45]. Obecnie nie istnieje żadna skuteczna metoda leczenia przyczynowego. Leczy się jedynie zaburzenia współistniejące takie, jak np. padaczka, oraz stosuje się odpowiednią terapię, by stymulować w jak największym stopniu ogólny rozwój pacjentów. Wczesna diagnoza jest istotna ze względu na kluczowe znaczenie wczesnego podjęcia tych działań dla dobra dziecka i jego dalszego rozwoju. Trzem grupom badawczym niezależnie udało się otrzymać ipsc pochodzące od pacjentów z RTT i zróżnicować je do funkcjonalnych neuronów [46-48]. Marchetto i współpracownicy [46] uzyskali ipsc z fibroblastów pochodzących od pacjentów z zespołem Retta, wykorzystując wektor retrowirusowy do wprowadzenia czterech czynników przeprogramowujących, tj. Sox2, Oct4, c-myc i Klf4. Badacze ci nie zaobserwowali zakłóceń w procesie różnicowania ani różnic w przeżywalności ipsc-n otrzymanych od pacjentów RTT i zdrowych osób. Wykazali jednak, że hodowane in vitro ipsc-n-rtt miały mniej synaps i kolców dendrytycznych, mniejsze ciało komórki oraz zaburzony poziom jonów wapnia, a także nieprawidłowe parametry elektrofizjologiczne. Otrzymane wyniki wskazują, iż zaburzenia w tworzeniu i funkcjonowaniu sieci neuronalnej u chorych z zespołem Retta mogą leżeć u podstawy tego schorzenia. Ponieważ Marchetto i współpracownicy [46] użyli do badań ipsc-n, byli oni w stanie prześledzić rozwój tych komórek i wskazać początek zmian patologicznych już we wczesnym rozwoju neuronalnym. Warto podkreślić, iż u chorych na tym etapie nie występują jeszcze wykrywalne symptomy. Zatem uzyskane przez autorów wyniki dostarczyły informacji na temat nowego i najwcześniejszego etapu rozwoju patologii, w którym zastosowanie odpowiedniego leczenia mogłoby skutkować spowolnieniem lub całkowitym zatrzymaniem rozwoju schorzenia. Aby przetestować tę hipotezę, zbadano efekt podania insulinopodobnego czynnika wzrostu 1 (IGF-1, ang. insulin-like growth factor) na właściwości ipsc-n-rtt i w części klonów zaobserwowano częściowe odwrócenie fenotypu, polegające na zwiększeniu liczby synaps w badanych komórkach. Jednak IGF-1 powodował także nadmierną aktywność synaps pobudzających [46]. Drugą substancją czynną testowaną na ipsc-n-rtt posiadających mutację typu nonsens w MeCP2 była gentamycyna, która jest stosowana do eliminowania defektów związanych z nonsensowymi mutacjami punktowymi i pozwala na ekspresję prawidłowego i kompletnego produktu genu. Środek ten skutecznie przyczynił się do odtworzenia synaps glutaminergicznych w badanych neuronach i stał się potencjalnym kandydatem terapeutycznym w leczeniu RTT. W przeciwieństwie do RTT, schizofrenia nie ma jednoznacznie określonego podłoża genetycznego. Dlatego też opracowanie spójnego modelu do badań in vitro stanowiło duże wyzwanie. Analizy post mortem tkanki mózgowej pacjentów ze schizofrenią wykazują, że ich komórki neuronalne są mniejsze, mają zubożone drzewka dendrytyczne i zmniejszoną liczbę synaps pobudzeniowych [49]. W celu sprawdzenia, czy parametry te można odtworzyć in vitro, Brennand i współpracownicy [9] otrzymali z fibroblastów czwórki pacjentów ipsc (przeprogramowanie przy użyciu lentiwirusów pozwalających na indukowaną ekspresję OCT4, SOX2, NANOG i LIN28), z których następnie otrzymali ipsc-n. Większość otrzymanych komórek neuronalnych stanowiły neurony pobudzające. Analiza morfometryczna wykazała, iż otrzymane neurony miały mniej neurytów oraz mniejszą gęstość synaps pobudzeniowych. Zastosowanie nowoczesnej metody znakowania połączeń neuronalnych in vitro przy użyciu zmodyfikowanego wirusa wścieklizny pozwoliło wykazać, iż istotnie liczba połączeń pomiędzy komórkami w hodowli była znacznie obniżona. Jednak autorom nie udało się wykazać znaczących różnic elektofizjologicznych w porównaniu z kontrolą, co może wskazywać na silne efekty kompensacyjne. Niemniej jednak otrzymany model potwierdził, iż niektóre zmiany obserwowane u pacjentów ze schizofrenią mogą być modelowane przy użyciu ips-n chorych osób. Co więcej, model ten okazał się przydatny w poszukiwaniu substancji odwracających zmiany patologiczne (patrz niżej). Najważniejszym celem wykorzystania modeli chorób UN uzyskanych w oparciu o komórki ipsc-n lub in jest użycie ich do poszukiwania nowych leków. Jest to związane miedzy innymi z faktem, iż wykorzystanie dotychczasowych modeli przedklinicznych (linie komórkowe, modele zwierzęce) w opracowywaniu leków przeciwko chorobom UN można uznać za spektakularną porażkę. Ponad 90% substancji, które przeszły przez fazę przedkliniczną odpadło w testach klinicznych mających potwierdzić ich specyficzność, skuteczność oraz bezpieczeństwo zastosowania. Generuje to ogromne straty finansowe i stawia pod znakiem zapytania adekwatność modeli przedklinicznych opartych w głównej mierze o genetycznie modyfikowane zwierzęta oraz unieśmiertelnione komórki ludzkie. W związku z tym rozwiązanie polegające na wykorzystaniu ipsc-n lub in stanowi potencjalnie ważną alternatywę, pozwalającą jednocześnie na rozszerzenie skali testów. Zastosowanie ipsc można obecnie rozpatrywać w trzech płaszczyznach: do testowania nowych leków w modelach chorób uzyskanych dzięki technologii przeprogramowania, do badań toksykologicznych oraz w celu poszukiwania substancji wpływających na samoodnawialność, przeżywalność i różnicowanie komórek. W niniejszej pracy przeglądowej skupiliśmy się tylko na pierwszym zagadnieniu, które wyszło już poza sferę planów. Postępy Biochemii 59 (2)

7 Wykorzystanie modeli chorób UN opartych o ipsc-n i in do poszukiwania i testowania leków wzbudza obecnie największe zainteresowanie. Jednakże dotychczasowe próby należy traktować raczej jako obiecujące eksperymenty pilotażowe. Wiąże się to z tym, iż zwykle badania są prowadzone z wykorzystaniem materiału od małej liczby pacjentów i maksymalnie 4 testowanych substancji. Co więcej, ipsc-n oraz in są uzyskiwane i różnicowane w laboratoriach wg różnych, często niewystandaryzowanych procedur, co utrudnia ich wykorzystanie do wielkoskalowych poszukiwań potencjalnych leków. Pierwszą udaną próbę farmakologicznego odwrócenia fenotypu chorych neuronów uzyskanych na drodze reprogramowania podjęli Ebert i współpracownicy [34], wykorzystując opisany już powyżej model SMA. Wykazali oni, że zastosowanie kwasu walproinowego lub tobramycyny przywracało ekspresję SMN1 do poziomu kontrolnego. Natomiast nie badali oni w swojej pracy, czy podanie tych substancji zapobiega selektywnej śmierci neuronów motorycznych uzyskanych od pacjentów [34]. Jednak te pionierskie eksperymenty udowodniły, iż w modelu stworzonym na bazie technologii przeprogramowywania, substancje uznane za potencjalne terapeutyki istotnie mogą wykazywać oczekiwane działanie, np. podnieść poziom białka, którego brak jest uznany za przyczynę śmierci komórek. Podobne eksperymenty przeprowadzono także w modelach AD, w których - zgodnie z oczekiwaniem - wykazano, iż w przypadku mutacji w PSEN1 i 2 zastosowanie inhibitorów g-sekretazy obniżało poziom β-amyloidu produkowanego przez uzyskane z ipsc neurony [38]. Ten przykład dobrze ilustruje niebezpieczeństwo analizy podczas badań przedklinicznych tylko wybranych aspektów danej choroby, gdyż wiadomo, że zastosowanie inhibitorów g-sekretazy w badaniach klinicznych nie przyniosło pożądanych efektów. Co więcej, w modelach AD, gdzie ipsc- -N pochodziły od pacjentów zarówno z duplikacją APP, jak i postacią sporadyczną, zastosowanie inhibitorów g-sekretazy nie wpływało na szereg badanych parametrów o znanym powiązaniu z patologią AD (np. poziom aktywnej GSK3β czy fosforylacji Tau) [37]. Jednak badania wykorzystujące ipsc-n i in nie ograniczają się tylko do potwierdzania lub falsyfikacji aktywności leków znanych i testowanych od dawna [11,14]. Ciekawe przykłady w kontekście poszukiwania nowych leków mogą stanowić modele schizofrenii, RTT (omówiony już wcześniej) oraz ALS. W przypadku pierwszego z modeli Brennand i współpracownicy [9] przetestowali pięć leków antypsychotycznych (klozapina, loksapina, olanzapina, risperidon oraz thioridazin) o różnym spektrum działania pod kątem zdolności do zwiększenia liczby połączeń pomiędzy ipsc-n pacjenta. Wykazano, iż tylko loksapina w sposób istotny poprawiała ten parametr. Z kolei w przypadku modeli ALS, Egawa i współpracownicy [40] wyprowadzili szereg linii ipsc od pacjentów z mutacją w genie kodującym białko TDP-43 (ang. TAR DNA-binding protein 43), a następnie wykazali ich podwyższoną wrażliwość na stres wywołany podaniem arsenianu. Analizy mikromacierzowe, przeprowadzone z wykorzystaniem tych komórek, wykazały wzrost poziomu transkrypcji białek istotnych dla procesów transkrypcji lub składania eksonów [40]. Dlatego też w dalszych badaniach skupiono się na sprawdzeniu efektywności 4 substancji modulujących te procesy w przeciwdziałaniu efektom arsenianu. Spośród tych substancji kwas 2-Hydroxy-6-pentadecylobenzoesowy (ang. anacardic acid), nie tylko ochraniał ipsc-n-als przed śmiercią, ale także zwiększał długość neurytów i obniżał poziom ekspresji zmutowanego TDP-43 oraz licznych genów zaangażowanych w metabolizm RNA [40]. Ponieważ jednak związek ten ma dość szerokie spektrum działania na poziomie molekularnym autorzy ostatecznie nie wyjaśnili, na czym dokładnie polegał jego efekt terapeutyczny. WYKORZYSTANIE ipsc-n i in W MEDYCYNIE REGENERACYJNEJ UKŁADU NERWOWEGO Obok opracowywania nowych modeli chorób UN oraz użycia ich do poszukiwania nowych lub testowania istniejących leków, ipsc-n i in rozbudziły nadzieję na ich wykorzystanie w transplantologii i terapii komórkowej. Pozwalałoby to, przynajmniej w teorii, na obejście problemu niezgodności tkankowej komórek dawcy i biorcy. W tym kontekście najśmielsze plany zakładają wykorzystanie skorygowanych genetycznie somatycznych komórek pacjenta do uzyskania materiału do przeszczepu neuroprekursorów w celu naprawy układu nerwowego. Plany bardziej realne skupiają się na terapiach patologii związanych z urazami układu nerwowego lub udarem mózgu. W przeciwieństwie jednak do opracowywania nowych modeli chorób, prace nad wykorzystaniem terapii komórkowych przy użyciu komórek pluripotencjalnych (np. ESC) trwają od wielu lat. W tym kontekście, wykorzystanie ipsc i uzyskanych z nich neuroprekursorów może bazować na wcześniejszych osiągnięciach. Jednak problem sprowadza się nie tylko do odpowiedzi na pytanie, czy komórki ipsc-n lub in przejmą funkcje zniszczonych komórek. Wciąż nie do końca rozwiązany pozostaje problem produkcji ipsc w sposób bezpieczny, tj. umożliwiający ich zastosowanie w transplantologii, oraz znalezienie sposobów zwiększających szansę przetrwania zdrowych komórek w patologicznie zmienionym środowisku tkanki docelowej. W związku z tym wszystkie omówione poniżej dotychczasowe próby transplantacji ipsc i komórek z nich uzyskanych były przeprowadzane z wykorzystaniem modeli zwierzęcych. Terapia z wykorzystaniem komórek pluripotencjalnych jest najprawdopodobniej najbardziej zaawansowana w przypadku wspomagania regeneracji uszkodzeń rdzenia kręgowego [50]. W przeciwieństwie do neuronów obwodowych, które odznaczają się dużym potencjałem regeneracyjnym, komórki ośrodkowego UN, w tym budujące rdzeń kręgowy, zasadniczo nie mają zdolności do regeneracji, co uniemożliwia skuteczną naprawę pourazową [51]. Okazuje się jednak, iż wszczepione komórki neuroprekursorowe uzyskane z ESC do pewnego stopnia są w stanie wspomagać odzyskanie utraconych funkcji [50]. Jednak ESC są materiałem trudno dostępnym, a ich wykorzystanie budzi kontrowersje natury etycznej. Dlatego też ipsc i pochodzące od nich neurprekursory stanowią atrakcyjne rozwiązanie. Tsuji i współpracownicy [52] wykazali, iż uzyskane z mysich ipsc neuroprogenitory wszczepione do rdzenia kręgowego myszy różnicowały zarówno do różnych rodzajów neuronów, jak i astrocytów oraz oligodendrocytów. Uzyskane neurony były funkcjonalne, tworzyły właściwe projekcje i 170

8 wspomagały powrót funkcji motorycznych u zwierząt w modelu urazu rdzenia kręgowego [52]. Jednocześnie badania te wykazały, iż kluczowe dla sukcesu jest sprawdzenie pochodzących z ipsc neuroprogenitorów pod względem ich zdolności do tworzenia potworniaków po wszczepieniu do mózgu myszy SCID. Opisane doświadczenia wykonano przy użyciu linii komórek bezpiecznych, o potwierdzonym niskim potencjale do tworzenia potworniaków. Jeśli jednak wykorzystano do nich komórki niewystarczająco zróżnicowane, zaobserwowano formowanie potworniaków w miejscu przeszczepu [52]. W roku 2011 grupa Okano potwierdziła możliwość wykorzystania progenitorów neuronalnych wyprowadzonych z ludzkich ipsc do terapii uszkodzenia rdzenia kręgowego w modelu mysim [53]. Ostatnio ten sam zespół zrobił kolejny krok naprzód w kierunku opracowania takiej terapii u ludzi i udowodnił, iż transplantacja ludzkich neuroprogenitorów pozwala na poprawę funkcjonalną po urazie rdzenia kręgowego marmozety [54]. Udar mózgu jest kolejnym uszkodzeniem, którego terapia mogłaby się opierać na przywróceniu funkcji poprzez wszczepienie neuroprekursorów pochodzących z ipsc lub uzyskanych w wyniku bezpośredniego przeprogramowania. W przypadku udaru, w efekcie zaburzeń krążenia mózgowego (niedokrwienie lub wylew krwi do mózgu), dochodzi do śmierci komórek mózgu i w konsekwencji do zaburzenia jego funkcji. W zależności od rozmiarów i miejsca uszkodzenia efekty fenotypowe mogą być odwrócone poprzez rehabilitację, która opiera się o zjawisko plastyczności mózgu. Jednak w części przypadków jest to obecnie niemożliwe, choć mogłoby się stać możliwe, gdyby udało się zregenerować tkankę nerwową. Oki i współpracownicy [55] podjęli taką próbę, wprowadzając ludzkie komórki neuroepitelialne uzyskane z ipsc do mózgu myszy i szczurów, u których wywołano niedokrwienie mózgu. Efektem niedokrwienia były lezja części prążkowia oraz zaburzenie funkcji motorycznych zwierząt. Autorzy wykazali, że transplantacja komórek neuroepitelialnych do prążkowia tydzień po udarze w znaczący sposób poprawiała funkcje ruchowe zwierząt. Dalsze analizy mózgu zwierząt w 11 tygodniu po transplantacji wykazały, że wprowadzone komórki różnicowały do funkcjonalnych neuronów. Jednak autorzy stwierdzili brak korelacji pomiędzy trwałą poprawą zaobserwowaną w testach behawioralnych a przetrwaniem wszczepionych komórek. Nie stwierdzono też znaczącej odbudowy zniszczonej tkanki. Rodzi się zatem pytanie, w jaki sposób wszczepione komórki, które najprawdopodobniej na badanym etapie (tj. 7 dni od transplantacji) nie były jeszcze odpowiednio zróżnicowane, wywarły efekt terapeutyczny. Praca Oki i współpracownicy [55] nie daje ostatecznej odpowiedzi, jednak autorzy na podstawie obserwacji poziomu VEGF (ang. Vascular endothelial growth factor) postawili hipotezę, że wzmożona synteza tego czynnika troficznego może wpływać, w pierwszym okresie po udarze, na podniesienie potencjału plastycznego endogennych komórek nerwowych, które przetrwały niedokrwienie. Drugą grupę patologii układu nerwowego, w których transplantacja komórek nerwowych pacjenta mogłaby stanowić skuteczną terapię są choroby degeneracyjne. Wśród nich najbardziej rozpowszechnione są AD, PD i HD. Intensywnie badane są także możliwości wykorzystania terapii komórkowej w innych chorobach UN takich, jak ALS [24] czy zwyrodnienie plamki żółtej związane z wiekiem (AMD, ang. Age-related Macular Degeneration) [56]. Jednak w przeciwieństwie do uszkodzeń rdzenia kręgowego czy śmierci neuronów wywołanej udarem sprawa leczenia osób dotkniętych tymi chorobami poprzez transplantację komórek neuronalnych uzyskanych dzięki technologii przeprogramowywania jest kwestią dużo bardziej złożoną i problematyczną. W tym kontekście warto omówić przykład potencjalnej terapii choroby Parkinsona. W 2008 roku Wernig i współpracownicy [7] wykazali, iż uzyskane w wyniku przeprogramowania mysich fibroblastów neurony dopaminergiczne po wprowadzeniu do prążkowia szczurów, poddanego uprzednio działaniu 6-OHDA, są w stanie przetrwać i stworzyć funkcjonalne sieci neuronalne. Podanie 6-OHDA do prążkowia prowadzi do zniszczenia neuronów dopaminergicznych i jest powszechnie używane u zwierząt laboratoryjnych w celu naśladowania efektów choroby Parkinsona. W modelu tym podanie substancji podnoszących aktywność lokomotoryczną (np. amfetaminy) zwierzętom, u których wywołano jednostronne zniszczenie prążkowia prowadzi do bardzo intensywnych, jednokierunkowych ruchów rotacyjnych. Miarą poprawy fenotypu i odzyskania funkcji przez zniszczoną część prążkowia jest zmniejszenie ich liczby. Transplantacja neuronów dopaminergicznych pochodzących z ipsc przyniosła właśnie taki efekt terapeutyczny [7]. Z kolei, w 2009 roku podobny efekt uzyskano wprowadzając do zniszczonego podaniem 6-OHDA prążkowia szczura ludzkie komórki uzyskane z ipsc, w tym od pacjentów chorych na idiopatyczną chorobę Parkinsona [57]. Co więcej, w większości przypadków nie zaobserwowano typowych zmian chorobowych tych neuronów, ani ich zwiększonej śmierci po transplantacji. A zatem potencjalnie możliwe byłoby wykorzystanie własnych komórek pacjenta do terapii. Należy jednak pamiętać o dwóch istotnych kwestiach. Po pierwsze opisywane doświadczenia przeprowadzano w krótkiej skali czasowej (tygodnie), podczas gdy powstanie zmian chorobowych u ludzi zajmuje lata. Ponadto, należy pamiętać, że ważnymi aspektami większości chorób neurodegeneracyjnych są stres komórkowy i patologicznie zmienione środowisko mózgu. Jak wspomniano powyżej, w modelach in vitro opartych o technikę przeprogramowywania, często konieczne jest zastosowanie dodatkowego stresu w celu wywołania określonych zmian patologicznych. A zatem prawdopodobnie przeszczep komórek pacjenta bez uprzedniej poprawy ich genotypu nie stanowi rzeczywistej alternatywy w przypadkach, gdzie choroba jest powodowana defektem genetycznym. Technologie umożliwiające korektę mutacji są już dostępne i z powodzeniem były stosowane w przypadku ipsc od pacjentów z PD spowodowaną zmianą w genie LRRK2 (G2019S) [43]. Jednak w licznych sporadycznych przypadkach PD przyczyna genetyczna nie jest znana co nie pozwoli na ich korektę molekularną. Ponadto, pochodzące od naprawionych ipsc neuroprekursory będą narażone na środowisko chorego układu nerwowego. W dłuższej perspektywie może prowadzić to do ich śmierci. Podobne zjawisko obserwowano w przypadku wykorzystania neuroprekursorów pochodzących z ESC, które po kilku latach od transplantacji także ulegały degeneracji w związku z toksycznym oddziaływaniem środowi- Postępy Biochemii 59 (2)

9 ska chorego mózgu. Podobny przykład pochodzi z badań nad ALS [24]. Otóż wykazano, że zdrowe in hodowane w obecności komórek glejowych produkujących zmutowaną, toksyczną formę dysmutazy ponadtlenkowej SOD1 (G93A) ulegają degeneracji [24]. Pokazuje to dobitnie, że terapia genowa oparta na genetycznej korekcie tylko wprowadzanych komórek chorego, czy nawet wprowadzenie zdrowych komórek od innego dawcy mogą być niewystarczające dla efektywnej i długofalowej terapii. W naszym przekonaniu należy o tym pamiętać, gdyż jest to bardzo poważne ograniczenie zastosowania wszelkich terapii transplantacyjnych w chorobach neurodegeneracyjnych. ipsc-n, in oraz insc JAKO NARZĘDZIA DO POSZUKIWANIA NOWYCH MECHANIZMÓW FIZJOLOGII I PATOLOGII NEURONÓW Opisane dotychczas przykłady przedstawiały badania z wykorzystaniem ipsc-n oraz in, które miały z góry założony cel praktyczny: modelowanie chorób w celu opracowania nowych terapii lub opracowanie nowych strategii terapeutycznych w oparciu o przeszczep komórek. Okazuje się jednak, że wykorzystanie technologii przeprogramowania do badania neuronów różnych rodzajów pochodzących od pacjentów może prowadzić do nowych odkryć na poziomie podstawowym. Pierwszym źródłem takich nowych obserwacji jest globalna analiza ekspresji genów poszczególnych rodzajów neuronów uzyskanych na drodze reprogramowania od pacjentów cierpiących na schorzenia UN i porównanie ich z komórkami osób zdrowych. Na przykład analiza transkryptomu komórek ipsc-n pochodzących od 4 pacjentów ze schizofrenią [9] wykazała różnice w ekspresji 596 genów w porównaniu z komórkami ipsc-n osób zdrowych. Siedemdziesiąt pięć procent spośród nich wcześniej nie było wiązanych ze schizofrenią. Stworzona ontologia genów pozwoliła zidentyfikować nowe procesy biologiczne potencjalnie związane z tą chorobą, jak np. kontrola wzrostu i nawigacji aksonów czy wyciszanie transkrypcji genów. Inny przykład może stanowić wspomniana wcześniej analiza transkryptomu ipsc-n-als pacjentów ze zmutowanym TDP-43 [40]. Analogiczne badania przeprowadzono także na poziomie proteomu niezróżnicowanych ipsc uzyskanych z fibroblastów pacjentów z HD [58]. Uzyskane dane wskazały na szereg możliwych mechanizmów, które mogą prowadzić do patologii komórek nerwowych (np. obniżenie poziomu białek związanych z cytoszkieletem o znanej funkcji w rozwoju neuronów). Ale nie tylko badania wielkoskalowe pozwalają na odkrycie nieoczekiwanych mechanizmów towarzyszących chorobom UN. Jednym z najbardziej spektakularnych przykładów jest praca Liu i współpracowników [43], którzy wykorzystując neuroprogenitory uzyskane z ipsc pacjentów z mutacją genu LRRK2 wykazali występowanie deformacji otoczki jądrowej, utratę laminy B1 oraz zawansowane zmiany epigenetyczne, charakterystyczne dla procesu starzenia się komórek (np. wyciszenie ekspresji genów związanych z neurogenezą i funkcjonowaniem neuronów). Dalsze badania grupy Belmontego wykazały, iż istotnie neuroprogenitory z mutacją G2019S w LRRK2 tracą zdolność zarówno dalszego namnażania, jak i różnicowania do neuronów po 14 pasażu. Co najważniejsze, podobne zmiany morfologii jądra komórkowego potwierdzono w strefach neurogennych (zakręt zębaty hipokampa) w preparatach pobranych post mortem z mózgu chorych na PD. Autorzy sugerują, iż przyspieszony zanik zdolności neurogenezy w dorosłym mózgu może odpowiadać za niemotoryczne symptomy neurologiczne u osób cierpiących na PD. Innymi przykładami odkrycia nowych aspektów patologii UN na poziomie biologii komórki mogą być wykazanie zaburzeń autofagii jako jednej z przyczyn zmian patologicznych w modelach PD [42] czy powiązanie AD z zaburzeniem transportu endocytarnego [20,37]. PODSUMOWANIE W niniejszym artykule omówione zostały najnowsze badania w dziedzinie neurobiologii wykorzystujące technikę przeprogramowywania komórek. W dużej mierze skupiają się one na opracowaniu nowych modeli i terapii chorób UN w oparciu o materiał uzyskany od pacjentów. Jest to bardzo obiecujący kierunek badań, jednak do jego największych wyzwań należą stworzenie bezpiecznych metod przeprogramowywania somatycznego oraz standaryzacja metod uzyskiwania indukowanych komórek i ich hodowli. Szczególnie to ostatnie zagadnienie jest konieczne do skutecznego przeprowadzenia wielkoskalowych projektów farmakologicznych. Na koniec warto wspomnieć, iż oprócz modelowania chorób UN ipsc mogą być wykorzystywane do modelowania in vitro rozwoju mózgu. Na przykład Mariani i współpracownicy [59] traktując ipsc rosnące w zawiesinie FGF i inhibitorami ścieżek sygnałowych aktywowanych przez BMP (ang. Bone morphogenetic proteins), Wnt i TGFβ uzyskali trójwymiarowe agregaty komórkowe o charakterystyce rozwijającej się kory mózgowej. Wykorzystanie tego typu hodowli może pozwolić w niedalekiej przyszłości na szybkie testowanie hipotez dotyczących molekularnych aspektów rozwoju mózgu, a także chorób z nim związanych. PIŚMIENNICTWO 1. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, Narita M, Ichisaka T, Tomoda K, Yamanaka S (2007) Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: Takahashi K, Yamanaka S (2006) Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126: Dolmetsch R, Geschwind DH (2011) The human brain in a dish: the promise of ipsc-derived neurons. Cell 145: Koch P, Kokaia Z, Lindvall O, Brustle O (2009) Emerging concepts in neural stem cell research: autologous repair and cell-based disease modelling. Lancet Neurol 8: Mattis VB, Svendsen CN (2011) Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology? Lancet Neurol 10: Robinton DA, Daley GQ (2012) The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature 481: Wernig M, Zhao JP, Pruszak J, Hedlund E, Fu D, Soldner F, Broccoli V, Constantine-Paton M, Isacson O, Jaenisch R (2008) Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson s disease. Proc Natl Acad Sci USA 105: Kim JE, O Sullivan, ML, Sanchez CA, Hwang M, Israel MA, Brennand K, Deerinck TJ, Goldstein LS, Gage FH, Ellisman MH, Ghosh A (2011) 172

10 Investigating synapse formation and function using human pluripotent stem cell-derived neurons. Proc Natl Acad Sci USA 108: Brennand KJ, Simone A, Jou J, Gelboin-Burkhart C, Tran N, Sangar S, Li Y, Mu Y, Chen G, Yu D, McCarthy S, Sebat J, Gage FH (2011) Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature 473: Petros TJ, Tyson JA, Anderson SA (2011) Pluripotent stem cells for the study of CNS development. Front Mol Neurosci 4: Han SS, Williams LA, Eggan KC (2011) Constructing and deconstructing stem cell models of neurological disease. Neuron 70: Marchetto MC, Brennand KJ, Boyer LF, Gage FH (2011) Induced pluripotent stem cells (ipscs) and neurological disease modeling: progress and promises. Hum Mol Genet 20: R Marchetto MC, Winner B, Gage FH (2010) Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases. Hum Mol Genet 19: R Bellin M, Marchetto MC, Gage, FH, Mummery CL (2012) Induced pluripotent stem cells: the new patient? Nat Rev Mol Cell Biol 13: Perez SE, Rebelo S, Anderson DJ (1999) Early specification of sensory neuron fate revealed by expression and function of neurogenins in the chick embryo. Development 126: Heins N, Malatesta P, Cecconi F, Nakafuku M, Tucker KL, Hack MA, Chapouton P, Barde YA, Gotz M (2002) Glial cells generate neurons: the role of the transcription factor Pax6. Nat Neurosci 5: Heinrich C, Blum R, Gascon S, Masserdotti G, Tripathi P, Sanchez R, Tiedt S, Schroeder T, Gotz M, Berninger B (2010) Directing astroglia from the cerebral cortex into subtype specific functional neurons. PLoS Biol 8: e Vierbuchen T, Ostermeier A, Pang ZP, Kokubu Y, Sudhof TC, Wernig M (2010) Direct conversion of fibroblasts to functional neurons by defined factors. Nature 463: Pang, ZP, YangN, Vierbuchen T, Ostermeier A, Fuentes DR, Yang TQ, Citri A, Sebastiano V, Marro S, Sudhof TC, Wernig M (2011) Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature 476: Qiang L, Fujita R, Yamashita T, Angulo S, Rhinn H, Rhee D, Doege C, Chau L, Aubry L, Vanti WB, Moreno H, Abeliovich A (2011) Directed conversion of Alzheimer s disease patient skin fibroblasts into functional neurons. Cell 146: Yoo AS, Sun AX, Li L, Shcheglovitov A, Portmann T, Li Y, Lee-Messer C, Dolmetsch R E, Tsien, RW, Crabtree GR (2011) MicroRNA-mediated conversion of human fibroblasts to neurons. Nature 476: Ambasudhan R, Talantova M, Coleman R, Yuan X, Zhu S, Lipton SA, Ding S (2011) Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell 9: Caiazzo M, Dell Anno MT, Dvoretskova E, Lazarevic D, Taverna S, Leo D, Sotnikova TD, Menegon A, Roncaglia P, Colciago G, Russo G, Carninci P, Pezzoli G, Gainetdinov RR, Gustincich S, Dityatev A, Broccoli V (2011) Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature 476: Son EY, Ichida JK, Wainger BJ, Toma JS, Rafuse VF, Woolf CJ, Eggan K (2011) Conversion of mouse and human fibroblasts into functional spinal motor neurons. Cell Stem Cell 9: Kim J, Efe JA, Zhu S, Talantova M, Yuan X, Wang S, Lipton SA, Zhang K, Ding S (2011) Direct reprogramming of mouse fibroblasts to neural progenitors. Proc Natl Acad Sci USA 108: Han DW, Tapia N, Hermann A, Hemmer K, Hoing S, Arauzo-Bravo MJ, Zaehres H, Wu G, Frank S, Moritz S, Greber B, Yang JH, Lee HT, Schwamborn JC, Storch A, Scholer HR (2012) Direct reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by defined factors. Cell Stem Cell 10: Lujan E, Chanda S, Ahlenius H, Sudhof TC, Wernig M (2012) Direct conversion of mouse fibroblasts to self-renewing, tripotent neural precursor cells. Proc Natl Acad Sci USA 109: Sheng C, Zheng Q, Wu J, Xu Z, Wang L, Li W, Zhang H, Zhao XY, Liu L, Wang Z, Guo C, Wu HJ, Liu Z, He S, Wang XJ, Chen Z, Zhou Q (2012) Direct reprogramming of Sertoli cells into multipotent neural stem cells by defined factors. Cell Res 22: Ring KL, Tong LM, Balestra ME, Javier R, Andrews-Zwilling Y, Li G, Walker D, Zhang WR, Kreitzer AC, Huang Y (2012) Direct reprogramming of mouse and human fibroblasts into multipotent neural stem cells with a single factor. Cell Stem Cell 11: Marcotte ER, Pearson DM, Srivastava LK (2001) Animal models of schizophrenia: a critical review. J Psychiatry Neurosci 26: Van den Buuse M, Garner B, Koch M (2003) Neurodevelopmental animal models of schizophrenia: effects on prepulse inhibition. Curr Mol Med 3: Marchetto MC, Gage FH (2012) Modeling brain disease in a dish: really? Cell Stem Cell 10: Chailangkarn T, Acab A, Muotri AR (2012) Modeling neurodevelopmental disorders using human neurons. Curr Opin Neurobiol 22: Ebert AD, Yu J, Rose FF, Jr, Mattis VB, Lorson CL, Thomson JA, Svendsen CN (2009) Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature 457: Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK, Weisenthal LM, Mitsumoto H, Chung W, Croft GF, Saphier G, Leibel R, Goland R, Wichterle H, Henderson CE, Eggan K (2008) Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science 321: Park IH, Arora N, Huo H, Maherali N, Ahfeldt T, Shimamura A, Lensch MW, Cowan C, Hochedlinger K, Daley GQ (2008) Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell 134: Israel MA, Yuan SH, Bardy C, Reyna SM, Mu Y, Herrera C, Hefferan MP, Van Gorp S, Nazor KL, Boscolo FS, Carson CT, Laurent LC, Marsala M, Gage FH, Remes AM, Koo EH, Goldstein LS (2012) Probing sporadic and familial Alzheimer s disease using induced pluripotent stem cells. Nature 482: Yagi T, Ito D, Okada Y, Akamatsu W, Nihei Y, Yoshizaki T, Yamanaka S, Okano H, Suzuki N (2011) Modeling familial Alzheimer s disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet 20: Nguyen HN, Byers B, Cord B, Shcheglovitov A, Byrne J, Gujar P, Kee K, Schule B, Dolmetsch RE, Langston W, Palmer TD, Pera RR (2011) LRRK2 mutant ipsc-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell 8: Egawa N, Kitaoka S, Tsukita K, Naitoh M, Takahashi K, Yamamoto T, Adachi F, Kondo T, Okita K, Asaka I, Aoi T, Watanabe A, Yamada Y, Morizane A, Takahashi J, Ayaki T, Ito H, Yoshikawa K, Yamawaki S, Suzuki S, Watanabe D, Hioki H, Kaneko T, Makioka K, Okamoto K, Takuma H, Tamaoka A, Hasegawa K, Nonaka T, Hasegawa M, Kawata A, Yoshida M, Nakahata T, Takahashi R, Marchetto MC, Gage FH, Yamanaka S, Inoue H (2012) Drug screening for ALS using patient- -specific induced pluripotent stem cells. Sci Transl Med 4: 145ra Jeon I, Lee N, Li JY, Park IH, Park KS, Moon J, Shim SH, Choi C, Chang DJ, Kwon J, Oh SH, Shin DA, Kim HS, Do JT, Lee DR, Kim M, Kang KS, Daley GQ, Brundin P, Song J (2012) Neuronal properties, in vivo effects, and pathology of a Huntington s disease patient-derived induced pluripotent stem cells. Stem Cells 30: Sanchez-Danes A, Richaud-Patin Y, Carballo-Carbajal I, Jimenez-Delgado S, Caig C, Mora S, Di Guglielmo C, Ezquerra M, Patel B, Giralt A, Canals JM, Memo M, Alberch J, Lopez-Barneo J, Vila M, Cuervo AM, Tolosa E, Consiglio A, Raya A (2012) Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human ips-based models of genetic and sporadic Parkinson s disease. EMBO Mol Med 4: Liu GH, Qu J, Suzuki K, Nivet E, Li M, Montserrat N, Yi F, Xu X, Ruiz S, Zhang W, Wagner U, Kim A, Ren B, Li Y, Goebl A, Kim J, Soligalla RD, Dubova I, Thompson J, Yates J 3rd, Esteban CR, Sancho-Martinez I, Izpisua Belmonte JC (2012) Progressive degeneration of human neural stem cells caused by pathogenic LRRK2. Nature 491: Amir RE, Van den Veyver IB, Wan M, Tran CQ, Francke U, Zoghbi HY (1999) Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-cpg-binding protein 2. Nat Genet 23: Neul JL, Kaufmann WE, Glaze DG, Christodoulou J, Clarke AJ, Bahi- -Buisson N, Leonard H, Bailey ME, Schanen NC, Zappella M, Renieri Postępy Biochemii 59 (2)

11 A, Huppke P, Percy AK (2010) Rett syndrome: revised diagnostic criteria and nomenclature. Ann Neurol 68: Marchetto MC, Carromeu C, Acab A, Yu D, Yeo GW, Mu Y, Chen G, Gage FH, Muotri AR (2010) A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell 143: Kim KY, Hysolli E, Park IH (2011) Neuronal maturation defect in induced pluripotent stem cells from patients with Rett syndrome. Proc Natl Acad Sci USA 108: Cheung AY, Horvath LM, Grafodatskaya D, Pasceri P, Weksberg R, Hotta A, Carrel L, Ellis J (2011) Isolation of MECP2-null Rett Syndrome patient hips cells and isogenic controls through X-chromosome inactivation. Hum Mol Genet 20: Harrison PJ (1999) The neuropathology of schizophrenia. A critical review of the data and their interpretation. Brain 122: Nakamura M, Okano H (2013) Cell transplantation therapies for spinal cord injury focusing on induced pluripotent stem cells. Cell Res 23: Macias M (2008) Injury induced dendritic plasticity in the mature central nervous system. Acta Neurobiol Exp (Wars) 68: Tsuji O, Miura K, Okada Y, Fujiyoshi K, Mukaino M, Nagoshi N, Kitamura K, Kumagai G, Nishino M, Tomisato S, Higashi H, Nagai T, Katoh H, Kohda K, Matsuzaki Y, Yuzaki M, Ikeda E, Toyama Y, Nakamura M, Yamanaka S, Okano H (2010) Therapeutic potential of appropriately evaluated safe-induced pluripotent stem cells for spinal cord injury. Proc Natl Acad Sci USA 107: Nori S, Okada Y, Yasuda A, Tsuji O, Takahashi Y, Kobayashi Y, Fujiyoshi K, Koike M, Uchiyama Y, Ikeda E, Toyama Y, Yamanaka S, Nakamura M, Okano H (2011) Grafted human-induced pluripotent stem- -cell-derived neurospheres promote motor functional recovery after spinal cord injury in mice. Proc Natl Acad Sci USA 108: Kobayashi Y, Okada Y, Itakura G, Iwai H, Nishimura S, Yasuda A, Nori S, Hikishima K, Konomi T, Fujiyoshi K, Tsuji O, Toyama Y, Yamanaka S, Nakamura M, Okano H (2012) Pre-evaluated safe human ipsc-derived neural stem cells promote functional recovery after spinal cord injury in common marmoset without tumorigenicity. PLoS One 7: e Oki K, Tatarishvili J, Wood J, Koch P, Wattananit S, Mine Y, Monni E, Tornero D, Ahlenius H, Ladewig J, Brustle O, Lindvall O, Kokaia Z (2012) Human-induced pluripotent stem cells form functional neurons and improve recovery after grafting in stroke-damaged brain. Stem Cells 30: Tucker BA, Park IH, Qi SD, Klassen HJ, Jiang C, Yao J, Redenti S, Daley GQ, Young MJ (2011) Transplantation of adult mouse ips cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice. PLoS One 6: e Hargus G, Cooper O, Deleidi M, Levy A, Lee K, Marlow E, Yow A, Soldner F, Hockemeyer D, Hallett PJ, Osborn T, Jaenisch R, Isacson O (2010) Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc Natl Acad Sci USA 107: Chae JI, Kim DW, Lee N, Jeon YJ, Jeon I, Kwon J, Kim J, Soh Y, Lee DS, Seo KS, Choi NJ, Park BC, Kang SH, Ryu J, Oh SH, Shin DA, Lee DR, Do JT, Park IH, Daley GQ, Song J (2012) Quantitative proteomic analysis of induced pluripotent stem cells derived from a human Huntington s disease patient. Biochem J 446: Mariani J, Simonini MV, Palejev D, Tomasini L, Coppola G, Szekely AM, Horvath TL, Vaccarino FM (2012) Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 109: Why do we need induced pluripotent stem cells in neurobiology? Ewa Liszewska *, Jacek Jaworski * International Institute of Molecular and Cell Biology, 4 Ks. Trojdena Str., , Warsaw, Poland * eliszewska@iimcb.gov.pl, jaworski@iimcb.gov.pl Key words: induced neurons, induced pluripotent stem cells, nervous system pathology, cell reprogramming, regenerative medicine, disease modeling. ABSTRACT Reprogramming of somatic cells made possible to study in vitro inaccessible human cells, such as different types of neurons. Almost immediate consequence of the emergence of this technology was the development of a number of cellular models of the nervous system diseases. They are used both to explore the cellular mechanisms of these diseases and for the development of new pharmacological strategies. Reprogrammed cells are also a potential alternative to embryonic stem cells for transplantation. This article presents the most important achievements in the use of cell reprogramming technology in neurobiology and at the same time points out the limitations of the methodology and the expected directions of its development