Modelowanie molekularne układów błonowych: badania biofizyczne

Transkrypt

1 Modelowanie molekularne układów błonowych: badania biofizyczne (badania biochemiczne wymagają metod hybrydowych łączących klasyczne modelowanie molekularne z mechaniką kwantową) 1

2 LIPIDOMIKA Lipidomika (Lipidomic) jest nową gałęzią biologii molekularnej Zajmuje się charakteryzacją lipidów występujących w organizmach żywych, ich oddziaływaniami oraz funkcjami biologicznymi Następny związek struktura-funkcja 2

3 Rola lipidów w układach biologicznych 3

4 Schemat błony komórki zwierzęcej 4

5 Transport wewnątrzkomórkowy Svetlana Lutsenko, Dept. Biochemistry and Mol. Biology MRB 624, 5

6 Transport wewnątrzkomórkowy (vesicular transport) Tworzenie się pęcherzyków oraz ich fuzja z docelową błoną 6

7 W wodzie, lipidy spontanicznie agregują w różne struktury przestrzenne (self-assembly) (fazy lipotropowe) 7

8 Struktury przestrzenne agregatów lipidowych - środowisko polarne (wodne) i niepolarne 8

9 Struktury przestrzenne agregatów lipidowych w środowisku polarnym (wodzie) Bicela zbudowana z DMPC (14C) i DHPC (6C) w proporcji 3:1 Porządkowanie biceli w polu magnetycznym badania NMR białek 9

10 Dwuwarstwy lipidowe cwx.prenhall.com/bookbind/pubbooks/mcmurrygob/medialib/ 10

11 Zależnie od warunków zewnętrznych jedna struktura może przejść w inną polimorfizm lipidów (fazy lipotropowe) DEPE, przejście z fazy lamelarnej do odwróconej heksagonalnej di-elaidynowa-pe web.mit.edu/pcvdwel/www 11

12 Lipidy dzielimy na : promujące tworzenie faz lamelarnych promujące tworzenie faz nie-lamelarnych 12

13 v P= al 13

14 Fazy lamelarne 14

15 Wspólną cechą strukturalną błon biologicznych jest matryca lipidowa Matryca lipidowa jest warstwą o grubości dwóch cząsteczek lipidów (ok. 5 nm) i bardzo dużej powierzchni (dwuwarstwa lipidowa) 15

16 Dla biologów błona jest jeszcze jedną strukturą subkomórkową Dla (bio)fizyków pasjonujący obiekt badań: własności mechaniczne, elastyczność, kontrolowana przepuszczalność 16

17 17

18 Badania błon metodą modelowania molekularnego Błona komórkowa jest olbrzymią, ciągłą*, wieloskładnikową, dynamiczną i bardzo złożoną strukturą *kanały: kontrolowane dziury * lokalne fazy nielamelarne co więc stanowi komputerowy model błony? 18

19 Dygresja 19

20 Co jest komputerowym modelem błony? Prowadząc badania metodami komputerowymi mamy ten luksus, że możemy w (względnie) szerokim zakresie kontrolować złożoność układu Ponieważ nas interesuje wyjaśnienie podstawowych mechanizmów odpowiedzialnych za biofizyczne aspekty funkcjonowania błon, badania zaczęliśmy od najprostszego układu, tj. uwodnionej dwuwarstwy lipidowej, która jest prostym modelem lamelarnych fragmentów matrycy lipidowej błony 20

21 Co jest komputerowym modelem błony? Modelem komputerowym jest więc mikroskopowy wycinek matrycy lipidowej (membrane patch). Aby go uciąglić wprowadzamy do opisu modelu periodyczne warunki brzegowe (PBC). Dwuwarstwa lipidowa DMPC 21

22 Co jest komputerowym modelem błony? Ten model poddajemy symulacji dynamiki molekularnej, a następnie dokładnym analizom i weryfikacji względem dostępnych wyników eksperymentalnych Dwuwarstwa lipidowa DMPC 22

23 Symulacja dynamiki błony 23

24 Co jest komputerowym modelem błony? Po wyjaśnieniu możliwych do zbadania mechanizmów decydujących o własnościach dwuwarstwy, stopniowo zwiększaliśmy złożoność modelu błony dodając kolejno do dwuwarstwy naturalne składniki błony: sterole, peptydy i białka, a także inne aktywne biologicznie związki POPC POPC+Chol POPC+Chol+peptydy 24

25 W organizmach żywych zidentyfikowano ponad 200 typów lipidów błonowych, które należą do kilku klas chemicznych. Skład lipidowy błony jest swoisty dla danego typu komórki. Jednym z częściej występujących lipidów błonowych jest fosfatydylocholina Rozkład ładunku na cząsteczce PC Całkowity ładunek 0e 25

26 Własności cząsteczek lipidów narzucają określone własności dwuwarstwy lipidowej. Można wyróżnić w niej trzy główne obszary Faza wodna Interfaza błona/woda Niepolarny obszar błony Najtrudniejszy do badań eksperymentalnych jest obszar interfazy 26

27 Matryca lipidowa najczęściej występuje w fazie ciekłokrystalicznej Wiele funkcji biologicznych błony wymaga tej fazy Fazę ciekłokrystaliczną cechuje przede wszystkim ruchliwość wewnętrzna łańcuchów węglowodorowych tj. izomeryzacja tras gauche W fazie ciekłokrystalicznej lipidy tworzące błonę przyjmują bardzo różne chwilowe konformacje zarówno łańcuchy acylowe jak i głowy polarne 27

28 Fazę ciekłokrystaliczną cechuje przede wszystkim ruchliwość wewnętrzna łańcuchów węglowodorowych, tj. izomeryzacja tras gauche Trzy stabilne konformacje kąta torsyjnego wiązania pojedynczego w łańcuchu acylowym Profil energetyczny dla rotacji wokół wiązania pojedynczego 28

29 izomeryzacja tras gauche zachodzi w krótkiej skali czasowej Czasy życia konformacji trans i gauche dla kolejnych kątów torsyjnych w łańcuchach DMPC Profil czasowy obsadzenia stanów konformacyjnych przez wybrane kąty torsyjne 29

30 Czas życia konformacji wiązania podwójnego jest bardzo długi w porównaniu z czasem życia konformacji wiązania pojedynczego. Możemy więc założyć, że izomeryzacja cis tras w łańcuchach węglowodorowych w czasie nanosekundowej symulacji dynamiki molekularnej praktycznie nie zachodzi 30

31 Czasy życia konformacji trans i gauche dla kolejnych kątów torsyjnych w łańcuchach POPC Profil czasowy obsadzenia stanów konformacyjnych przez wybrane kąty torsyjne 31

32 Przyjęło się, określać błonę w fazie ciekłokrystalicznej jako płynną Płynność (pojęcie nieostre) błony jest różna od płynności cieczy ciecz jest układem izotropowym, gdzie wszystkie cząsteczki mają 3wymiarową swobodę dyfuzji translacyjnej i rotacyjnej 32

33 W odróżnieniu od cieczy, dwuwarstwa ma symetrię dwuwymiarową Cząsteczki tworzące błonę mają swobodę dyfuzji lateralnej w obszarze błony i rotacyjnej wokół długiej osi Rotacja wokół osi prostopadłej jest ograniczona rzadkie przeskoki flip-flop (długi okres przejścia) Dyfuzja translacyjna wzdłuż osi prostopadłej do powierzchni błony (wertykalna) zachodzi jedynie w bardzo ograniczonym zakresie 33

34 Modelowanie molekularne układów błonowych: badania biofizyczne 34

35 Trzy główne obszary błony Faza wodna Interfaza błona/woda Niepolarny obszar błony Najtrudniejszy do badań eksperymentalnych jest obszar interfazy 35

36 Pierwszy problem w zastosowaniu modelowania molekularnego do badania błon! Jak zbudować układ symulacyjny, jeśli matryca lipidowa błony jest w stanie ciekłokrystalicznym (skąd wziąć startową strukturę przestrzenną lipidów)? w przypadku białek strukturą startową jest struktura krystaliczna lub rozwiązana metodą NMR (zbiór PDB), w przypadku dwuwarstwy lipidowej sprawa jest problematyczna 36

37 Jak zbudować startowy model błony? Ponieważ układy lipidowe są trudnym obiektem badań strukturalnych tylko dla niewielu fosfolipidów rozwiązano struktury przestrzenne Znana jest na przykład struktura DMPC (wzorzec, template) Struktura krystaliczna DMPC i zbudowana z niej dwuwarstwa Ten model błony nie jest jednak przydatny do badań bioukładów błonowych 37

38 Aktywna biologicznie jest faza ciekłokrystaliczna błony, aby ją otrzymać musimy przeprowadzić dwuwarstwę przez przejście fazowe (temperatura przejścia fazowego, Tm) Pole powierzchni/lipid 38

39 Zmiana wartości parametrów błony przy przejściu fazowym ze struktury krystalicznej do ciekłokrystalicznej, na przykładzie błony DMPC 1. liczba cząsteczek wody/lipid wzrasta z 2 do ok. 25 ** 2. średnia wartość pola powierzchni/lipid wzrasta z ~40 do ~60 Å2 3. średnia liczba konformacji gauche/łańcuch wzrasta z 0 do ~3 4. wzrasta ruchliwość grup i całych cząsteczek (w stanie krystalicznym brakuje miejsca na ruch) 5. entropia układu rośnie, w efekcie układ jest w równowadze termodynamicznej 39

40 Różnice w strukturze błony w fazie krystalicznej i ciekłokrystalicznej Obecnie w Internecie dostępne są struktury ciekłokrystalicznych lipidów, z których można zbudować dwuwarstwę w fazie zbliżonej do ciekłokrystalicznej (oferta ograniczona do kilku typów PC, ale można wymieniać głowy polarne) 40

41 W organizmach żywych zidentyfikowano ponad 200 typów lipidów błonowych, które należą do kilku klas chemicznych Skład lipidowy błony jest swoisty dla danego typu komórki 41

42 Temperatury głównego przejścia fazowego (Tm) błon DMPC, DPPC, POPC, POPE, PEPC (palmitynowo-elaidynowapc), SM Lipid DMPC (14/14) DPPC (16/16) POPC (16/18, cis) POPE (16/18, cis) PEPC (16/18, trans) SSM (18) Temperatura [ C] DMPC i DPPC oba łańcuchy nasycone POPC/PE łańcuch β nono-cis nienasycony, łańcuch γ nasycony PEPC łańcuch β nono-trans nienasycony, łańcuch γ nasycony SSM wiązanie C4=C5 w łańcuchu γ trans-nienasycone, łańcuch β nasycony 42

43 O temperaturze przejścia fazowego błony decydują między innymi oddziaływania między głowami polarnymi lipidów w obszarze interfazy 43

44 Dlaczego badamy błony metodami modelowania molekularnego?? Błony są bardzo trudnym obiektem do badań eksperymentalnych ponieważ są: wieloskładnikowym, wielofazowym, układem dynamicznym, gdzie ruchy zachodzące w różnej skali czasowej są bardzo istotną cechą układu Błonę cechuje struktura dynamiczna innej jakości niż w przypadku białek Slogan: w białkach najważniejsza jest struktura, w błonach dynamika 44

45 Dlaczego badamy błony metodami modelowania molekularnego?? Modelowanie molekularne, ze względu na swoją rozdzielczość czasową i przestrzenną jest bardzo pomocne w poznawaniu struktury i dynamiki dwuwarstwy lipidowej i prostszych modeli błon biologicznych Rozdzielczość czasowa Δt rzędu 1ps, czas symulacji rzędu ns Rozdzielczość przestrzenna Δx, Δy, Δz : atomowa 45

46 Jakich informacji o błonach dostarczyły badania metodami modelowania molekularnego? Nic nowego, ale ciekawe: Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę S. J. Marrink, E. Lindahl, O. Edholm, A. E. Mark, J. Am. Chem Soc. 2001, 123, University of Groningen, Holandia Układ molekularny: 64 cząsteczki dipalmitylofosfatydylcholiny (DPPC) 3000 cząsteczek wody Początkowa konfiguracja: przypadkowa mieszanina DPPC i wody Metoda: symulacja dynamiki molekularnej 46

47 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę t = 0 ps, przypadkowa mieszanina DPPC i wody. Głowy polarne DPPC są w kolorze pomarańczowym, łańcuchy węglowodorowe we fioletowym, a cząsteczki wody w niebieskim. Ramka wskazuje podstawowe pudełko symulacyjne (periodyczne warunki brzegowe) t=0 ps t = 200 ps, cząsteczki DPPC agregują w nieregularne klastry separacja wody i łańcuchów węglowodorowych t=200 ps 47

48 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę t = 3 ns, tworzy się już struktura będąca zaczątkiem dwuwarstwy t = 3 ns t = 10 ns, w ciągu następnych 7 ns struktura relaksuje do metastabilnej struktury z transbłonowym porem t = 10 ns 48

49 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę t = 20 ns, utworzony por jest względnie stabilny, jednakże po zgromadzeniu się wystarczającej na pokonanie bariery energii, struktura pora szybko zanika t = 20 ns t = 25 ns, osiągnięcie przez układ stabilnego (zrównoważonego) stanu, odpowiadającego idealnej dwuwarstwie t = 25 ns 49

50 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę normalna do błony To samo, ale w inny sposób. Profil liczby atomów danej grupy w funkcji głębokości błony (wzdłuż normalnej) w procesie samo-organizacji dwuwarstwy (kolory jak poprzednio). (a) t = 0 ps, przypadkowa mieszanina DPPC i wody; (b) t = ps, powstawanie nieregularnych klastrów; (b-c) t = ns klastry stają się coraz regularniejsze; (c) t = 3-4 ns, początki struktury dwuwarstwy; (ceq) t = ns, struktura z metastabilnym porem; 50 (deq) t = ns, pozbawiona defektów, zrównoważona, stabilna

51 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę Ostatnie nanosekundy pora 51

52 Symulacja spontanicznej agregacji fosfolipidów w dwuwarstwę Przeprowadzono również symulacje dla innych typów fosfolipidów (POPC, DOPC, DOPE) oraz większych błon DPPC (128 i 256 cząsteczek lipidów) Proces tworzenia dwuwarstwy oraz powstawania i rozpadu stanu pośredniego przebiegał we wszystkich układach podobnie występowały różnice w czasach życia poszczególnych etapów procesu Analiza szczegółowa: praktycznie żadna po prostu obserwacja zjawiska 52

53 Jakich informacji o błonach dostarczyły badania metodami modelowania molekularnego? Coś nowego, ale spodziewanego: Jakie oddziaływania gwarantują integralność błony? Hydrofobowe fakt znany i zilustrowany powyższym przykładem Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Panował pogląd, że oddziaływania między głowami polarnymi lipidów są odpychające, tj. destabilizujące strukturę błony Co wykazały symulacje dynamiki molekularnej? 53

54 Oddziaływania w obszarze interfazy M. Pasenkiewicz-Gierula, Y. Takaoka, H. Miyagawa, K. Kitamura, A. Kusumi. Hydrogen bonding of water to phosphatidylcholine in the membrane as studied by a molecular dynamics simulation. J. Phys. Chem. A. 1997, 101, (79 cytowań) M. Pasenkiewicz-Gierula, Y. Takaoka, H. Miyagawa, K. Kitamura, A. Kusumi. Chargepairing of headgroups in phosphatidylcholine membranes. A molecular dynamics simulation study. Biophys. J. 1999, 76, (65 cytowań) Układ molekularny: 72 cząsteczki DMPC 1800 cząsteczek wody Metoda: symulacja dynamiki molekularnej Analizy: RDF, definiowanie kryteriów, wyznaczania odległości i kątów, czasów życia dla WW i PŁ (żadnych wyszukanych analiz) 54

55 Iloczyn skalarny rzut wektora 2 na wektor 1 przypomnienie v 1 v 2 = v 1 v 2 cos θ =x 1 x 2 y1 y2 z1 z2 v t θ v = x y z 2 v 0 rzut v(t) na v(0) 2 2 v 1 v 2 x 1 x 2 y 1 y 2 z 1 z 2 cos q = = v 1 v 2 v 1 v 2 Kryterium wiązania wodorowego: r(o O) 3.25 Å Kąt (O O,OH) 35 55

56 Oddziaływania w obszarze interfazy Przeprowadzono analizę oddziaływań poszczególnych grup DMPC z wodą poprzez obliczenie funkcji rozkładu radialnego, RDF, wody względem tych grup 56

57 Oddziaływania w obszarze interfazy Następnie sprawdzono, czy spełnione jest kryterium wiązania wodorowego Te analizy wykazały, że woda tworzy wiązania wodorowe przede wszystkim z atomami tlenu grupy fosforanowej O14 i O13 oraz z atomami tlenu grup karbonylowych O22 i O32. Pozostałe atomy tlenu słabo wiążą wodę 57

58 Oddziaływania między atomami tlenu DMPC a wodą Liczba wiązań wodorowych/dmpc 5.3 ± 0.14 Liczba związanych wodorowo cząsteczek wody/dmpc 4.5 ± 0.2 Liczba cząsteczek wody w najbliższym sąsiedztwie/dmpc 4.8 ± 0.2 Wyznaczona eksperymentalnie (NMR) liczba mocno związanych cząsteczek wody

59 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Liczba wiązań wodorowych/dmpc (5.3) > od liczby związanych cząsteczek wody/dmpc (4.5) Wynika stąd, że jedna cząsteczka wody jest związana równocześnie przez dwie cząsteczki DMPC lub dwie grupy w tej samej cząsteczce Cząsteczka wody równocześnie związana przez dwie grupy tworzy pomost wodny, między- lub wewnątrzcząsteczkowy 59

60 Oddziaływania w obszarze interfazy Pomosty wodne między cząsteczkami lipidów występują równie często jak pomosty wodne w białku 60

61 Oddziaływania w obszarze interfazy Podobne analizy wykazały, że grupa cholinowa DMPC oddziałuje elektrostatycznie z grupą fosforanową lub karbonylową tej samej lub sąsiedniej cząsteczki (pary ładunkowe), analogicznie do mostków solnych w białku. Pary ładunkowe były obserwowane metodą 31PNMR [Wiązania wodorowe N(CH3)3 Op] 61

62 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Liczba wiązań wodorowych/dmpc zaangażowanych w pomosty wodne 1.7 ± 0.2 Liczba wiązań wodorowych/dmpc zaangażowanych w międzycząsteczkowe pomosty wodne 1.4 ±

63 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Coś nowego, ale spodziewanego dlaczego spodziewanego? Obliczenia kwantowo-mechaniczne wykazały, że tworzenie pomostów wodnych jest korzystne energetycznie, ale nikt nie zwrócił na to uwagi H. Frischleder et al., Chemistry and Physics of Lipids. 19, ,

64 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Coś nowego, ale spodziewanego dlaczego spodziewanego? W strukturze krystalicznej DMPC, cząsteczki wody tworzą pomosty wodne między grupami fosforanowymi, ale uważano, że w strukturze ciekłokrystalicznej takie pomosty nie powstają 64

65 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Dynamiczna sieć powiązań między głowami polarnymi DMPC w błonie poprzez pomosty wodne i pary ładunkowe (mostki solne) 65

66 Czy oddziaływania w obszarze interfazy zwiększają integralność błony? Badania metodami modelowania molekularnego wykazały: Oprócz oddziaływań hydrofobowych, za integralność dwuwarstwy lipidowej odpowiedzialne są oddziaływania przyciągające w obszarze interfazy: poprzez pomosty wodne i pary ładunkowe Postuluje się, że pomosty wodne uczestniczą w szybkiej lateralnej dyfuzji protonów na powierzchni błony 66

67 Akawporyny 67

68 Błona biologiczna stanowi barierę dla niekontrolowanego przepływu wody, jonów i większości innych cząsteczek do i z komórki 68

69 Kanały wodne (akwaporyny) Nagroda Nobla z chemii (Peter Agre) w 2003 Akwaporyny są transbłonowymi kanałami wodnymi o znanej strukturze przestrzennej W błonie, akwaporyna tworzy homotetramer; każdy z monomerów funkcjonuje jako kanał. Monomer zbudowany jest z 6 transbłonowych i 2 krótkich helis F. Zhu et al./febs Letters 504 (2001)

70 Kanały wodne (akwaporyny) Akwaporyna jest niezwykle selektywnym białkiem, przepuszcza cząsteczki wody (H2O), a nie przepuszcza protonów (H3O+) czy innych jonów (2 cząsteczki wody/monomer/ns) F. Zhu et al./febs Letters 504 (2001)

71 Moment dipolowy α-helisy 71

72 Moment dipolowy cząsteczki wody 72

73 Dwie krótkie helisy (M3 i M7) odgrywają znaczną rolę w selektywności kanału Ich N-końce (+) znajdują się wewnątrz kanału, a C-końce ( ) na zewnątrz. Wygenerowane przez nie wypadkowe pole elektrostatyczne zmienia kierunek wewnątrz kanału 73

74 Dwie krótkie helisy (M3 i M7) odgrywają znaczną rolę w selektywności kanału Na N-końcu każdej z krótkich helis, prawie w środku błony, znajdują się 3 reszty aminokwasowe: asparagina (Asn), prolina (Pro) i alanina (Ala) tzw. Motyw NPA 74

75 Dwie krótkie helisy (M3 i M7) odgrywają znaczną rolę w selektywności kanału Asparaginy Asn192 i Asn76 W środku kanału, lokalne pole elektryczne zmienia kierunek, co powoduje rotacje cząsteczek wody To, oraz dwa wiązania wodorowe tworzone przez centralną cząsteczkę wody i 2 reszty asparaginy (Asn192 i 76), przerywa liniową sieć wiązań wodorowych między cząsteczkami wody i uniemożliwia przepływ protonów w procesie proton hopping 75

76 proton hopping 76

77 Reszty asparaginy na końcach helis M3 i M7 przerywają ciąg wiązań wodorowych między cząsteczkami wody asparaginy Asn192 i Asn76 (Tajkhorshid, E., Nollert, P., Jensen, M.O., Miercke, L.J., O'Connell, J., Stroud, R.M., and Schulten, K. Science 296, , 2002). ( atomów, 5 ns) 77

78 Grupy prof. Schultena i Groota zbudowały modele błony z kanałem wodnym i przeprowadziły symulacje dynamiki molekularnej (B.L. de Groot and H. Grubmüller Science 294, ) 78