Asocjacje na skalę genomu z paleniem tytoniu

Transkrypt

1 PRACE POGLĄDOWE Ewa Strauss Asocjacje na skalę genomu z paleniem tytoniu Genome-wide associations for cigarette smoking behavior Zakład Funkcji Kwasów Nukleinowych, Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu Kierownik: Prof. dr hab. Ryszard Słomski Dodatkowe słowa kluczowe: GWAS polimorfizm palenie tytoniu Additional key words: GWAS polymorphism tobacco smoking Praca finansowana z projektu badawczego NCN nr NN Adres do korespondencji: Dr Ewa Strauss Zakład Funkcji Kwasów Nukleinowych, Instytut Genetyki Człowieka Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu ul. Strzeszyńska 32, Poznań tel. (61) fax: (61) strauss@man.poznan.pl Choroby spowodowane paleniem papierosów są drugą najczęstszą przyczyną zgonów na świecie. Pomimo zwiększającej się liczby danych wskazujących na udział czynników genetycznych w determinowaniu różnych cech związanych z paleniem tytoniu, geny i regiony chromosomowe odpowiedzialne za ich rozwój są w większości nieznane. Badania asocjacji na skalę genomu (GWASs) stanowią nowe podejście do poszukiwania wariantów genetycznych odpowiedzialnych za rozwój cech złożonych i chorób częstych w populacji. Poszukiwania w skali całego genomu bez wstępnej hipotezy umożliwiają odkrycie nowych powiązań między zmiennością genetyczną a występowaniem takich cech. W niniejszej pracy przedstawiono wyniki badań GWA i ich metaanaliz dotyczących różnych aspektów palenia tytoniu i uzależnienia od nikotyny, ze szczególnym uwzględnieniem powodzenia w zaprzestaniu palenia oraz stosowania farmakoterapii zastępczej. Wyniki tych badań zostały przedyskutowane w kontekście wyników analiz asocjacji genów kandydatów. Przedstawiono także wyniki badań nad znaczeniem regionów genomu zidentyfikowanych w GWASs dla występowania chorób spowodowanych paleniem. Diseases related to tobacco smoking are the second leading cause of death in the world. Despite increasing evidence of genetic determination, the susceptibility genes and loci underlying various aspects of smoking behavior are largely unknown. Genome-wide association studies (GWASs) provided a new conceptual framework in the search for variants underlying common traits/disorders. A massive scan of the genome and a hypothesis-free approach enable discovery of new aspects of genetics of complex traits. In this paper the results of GWASs and GWAS meta-analyzes of cigarette smoking behavior and nicotine dependence are reviewed with the particular attention to smoking cessation success and the replacement therapy. The results of these studies are discussed in the context of the results of the candidate gene association studies. Studies on the role of the genomic regions, identified in GWASs, in the development of smoking-related diseases are also discussed. Wstęp Palenie papierosów stanowi istotny czynnik ryzyka wielu chorób, takich jak nowotwory, zaburzenia układu sercowo-naczyniowego i układu oddechowego, przyczyniając się do przedwczesnej umieralności osób palących. Choć abstynencja obniża ryzyko zachorowania i zgonu u palaczy tytoniu, wskaźniki sukcesu przy próbach zaprzestania palenia nie są optymistyczne. Rok po próbie bez wspomagania środkami farmakologicznymi odsetek abstynencji nie przekracza 5%, a przy udziale tego typu terapii długoterminowe wskaźniki abstynencji mieszczą się poniżej 25% [50]. Dopuszczone do użytku środki wspomagające to nikotynowa terapia zastępcza (NTZ), terapia bupropionem i warenikliną. Bupropion jest lekiem przeciwdepresyjnym, inhibitorem wychwytu zwrotnego dopaminy i noradrenaliny oraz antagonistą nikotyny. Wareniklina to częściowy agonista neuronalnych nikotynowych receptorów cholinergicznych (nachr) α4β2, który ma działanie antagonistyczne w obecności nikotyny. Po związaniu z receptorem naśladuje efekty nikotyny w stopniu wystarczającym do osłabienia głodu nikotynowego i objawów abstynencyjnych. Metaanalizy wskazują, że stosowanie NRT lub bupropionu dwukrotnie zwiększa szansę uzyskania abstynencji w okresie 6 miesięcy po zaprzestaniu terapii, a warenikliny od 2- do 3-krotnie [15]. Nasilenie palenia tytoniu, uzależnienie od nikotyny i zdolność palaczy do skutecznego powstrzymania się od palenia są cechami odziedziczalnymi o charakterze wieloczynnikowym. Około 30-80% zmienności osobniczej tych cech warunkują oddziaływania czynników genetycznych [5, 26]. Dobrze udokumentowany wpływ czynników środowiskowych dotyczy zależności kulturowych i ekonomicznych: niskiego statusu społeczno-ekonomicznego, palenia przez rówieśników oraz palenia matki w czasie ciąży. Przeprowadzone w ostatnich latach badania asocjacji na skalę genomu (ang. 852 E. Strauss

2 genomewide association studies; GWAS) oraz metaanalizy wyników tych badań przyczyniły się do identyfikacji licznych loci genomowych, które powiązane są z uzależnieniem od palenia tytoniu. Zaletą tego typu analiz, poza ich globalnym w skali genomu zasięgiem, jest brak wstępnej hipotezy. Dzięki temu możliwe jest odkrycie nowych nieoczekiwanych uprzednio powiązań pomiędzy wariantami genetycznymi a badaną cechą. Inne podejścia w badaniach asocjacji genetycznych, jak badania genów kandydatów oraz badania genów zaangażowanych w określone szlaki są pomocne w identyfikacji wariantów o mniejszej sile oddziaływania oraz w interpretacji wyników GWAS. W niniejszej pracy podsumowano najważniejsze wyniki badań GWA w zakresie uwarunkowań cech związanych z paleniem tytoniu z uwzględnieniem wyników badań replikacyjnych i badań asocjacji genów kandydatów, występujących w zidentyfikowanych loci. Przedstawiono także powiązania pomiędzy wyznaczonymi regionami chromosomowymi a występowaniem chorób związanych z paleniem. Metodyka i bazy danych GWAS W założeniach badań GWA za wyniki istotne statystycznie uznaje się te, dla których poziom istotności p nie przekracza wartości 1 x Tak niski punkt odcięcia podyktowany jest koniecznością wprowadzenia korekty względem liczby jednocześnie badanych wariantów genetycznych. W konsekwencji, klasyczna analiza wyników GWAS pozwala na identyfikację pojedynczych najsilniej asocjowanych wariantów, nie wyjaśniających w pełni uwarunkowań badanej cechy [37]. Wyniki prowadzonych badań GWA gromadzone są w dwóch bazach danych dostępnych w intrenecie: bazie The Research Institute Catalog of Published GWAS (www. genome.gov/gwastudies) oraz bazie GWAS Central ( Pierwsza z wymienionych, jest bazą asocjacji polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (ang. single nucleotide polymorphisms, SNPs) z określonymi cechami/chorobami, na bieżąco aktualizowaną na podstawie opublikowanych wyników GWAS. W drugiej zawarte są zarówno wyniki małych jak i dużych badań asocjacji SNPs i wariantów liczby kopii (ang. copy number variations, CNVs) z cechami fenotypu. Jej aktualizacja opiera się w znacznym stopniu na samodzielnym wprowadzaniu danych przez autorów, stąd dla wielu doniesień opóźnienie notacji sięga dwóch lat. Zaletą tej bazy jest natomiast odrębna charakterystyka poszczególnych wyników uzyskanych w jednym badaniu asocjacji. W większości badań GWA nad uzależnieniem od palenia tytoniu znajdujemy skromny opis cech związanych z paleniem. Przyczyną tej sytuacji jest fakt, że badania te wykonywane były w grupach zebranych na potrzeby innych badań, przede wszystkim chorób spowodowanych paleniem. Parametrem najczęściej stosowanym w tym przypadku jako wykładnik stopnia uzależnienia od nikotyny jest liczba papierosów wypalanych w ciągu dnia. Powszechnie przyjmuje się, że wartość ta bezpośrednio przekłada się na stopień uzależnienia. Zidentyfikowane regiony chromosomowe Dotychczas przeprowadzono 13 badań GWA dotyczących różnych aspektów palenia tytoniu, przy czym w ponad połowie z nich (N=8) próba badana okazała się zbyt mała dla wykrycia asocjacji istotnych na poziomie p < 1x10-7 (Tabela 1). Ten poziom istotności uzyskano w przypadku 11 niezależnie stwierdzonych asocjacji dla polimorfizmów zlokalizowanych w 6 regionach chromosomowych 15q25.1 (PSMA4 - CHR- NA5 - CHRNA3 - CHRNB4) [11,27,39,41], 19q13.2 (EGLN2, CYP2A6 CYP2A7) [23,40,41], 8p11.21 (C8orf40 CHRNA6 - CHRNB3) [41], 9q34.2 (FAM163B DBH) [39], 10q23.32 (LOC ) [39], 11p14.1 (BDNF) [39]. Obecność asocjacji, dla których poziom istotności statystycznej sugerował wysoce prawdopodobny związek z paleniem tytoniu (w granicach od 2 x 10-7 do 9 x 10-6 ) stwierdzono dla 30 kolejnych loci, w tym Xp11.3 i 14q24.2, które mogą oddziaływać na powodzenie zaprzestania palenia. Ogółem w genomie człowieka loci o wykazanej lub wysoce prawdopodobnej asocjacji z paleniem tytoniu mieszczą się na każdym autosomie oraz na chromosomie płci X. Większość z polimorfizmów wykazujących asocjację w tych obszarach, to warianty sekwencji niekodującej: intronowe i rejonów międzygenowych. Jedynie dwa warianty zlokalizowano w sekwencjach kodujących białko, a dwa kolejne przypisano do sekwencji funkcjonalnego RNA. Powiązanie regionów chromosomowych 15q25 (wariant rs ) i 19q13 (wariant rs ) z nasileniem palenia tytoniu, na poziomie istotności p < 1x10-7, zostało po raz pierwszy wykazane w populacjach o pochodzeniu na podstawie metaanalizy danych pochodzących z wcześniejszych badań GWA w grupach scharakteryzowanych pod względem palenia tytoniu [41]. W późniejszych badaniach asocjacji potwierdzono rolę locus 15q25 w tej grupie etnicznej [27, 39, 14] oraz u osób rasy czarnej (Amerykanów pochodzenia afrykańskiego) [11]. Zależności takiej nie obserwowano u osób rasy żółtej w badaniach populacji japońskiej [23] i koreańskiej [47]. Jeszcze większe zróżnicowanie etniczne dotyczy znaczenia regionu 19q13.2, który wykazuje asocjację z paleniem również w populacji japońskiej, podczas gdy zależności takiej dotychczas nie wykazano u osób rasy czarnej [11] i w populacji koreańskiej [47]. W tej ostatniej najbardziej istotny region 7q31.1 wykazywał związek z nasileniem palenia oraz ze stopniem uzależnienia od nikotyny. Za wyjątkiem regionów chromosomowych 15q25 i 19q13, które wykazują stały, potwierdzony w innych badaniach związek z paleniem tytoniu, pozostałe zidentyfikowane loci są unikalne, co wskazuje na heterogenność uwarunkowań cech związanych z paleniem tytoniu. Geny kodujące podjednostki receptora nach Większość efektów działania nikotyny w mózgu wynika z jej wpływu na system acetylocholinergicznych receptorów nikotynowych, a odmienne kombinacje podjednostek warunkują różnice we wrażliwości receptora na nikotynę [18]. W mózgu człowieka dochodzi do ekspresji dziewięciu różnych podjednostek nach-r: α2-α7, β2-β4, przy czym funkcjonalnie aktywne receptory mają strukturę pentameryczną. W zidentyfikowanych regionach 15q25 oraz 8p11 obecne są geny kodujące podjednostki: α5, α3 i β4 (odpowiednio: CHRNA5, CHRNA3 i CHRNB4) oraz α6 i β3 (odpowiednio: CHR- NA6, CHRNB3). CHRNA5 - CHRNA3 - CHRNB4 [15q25] Grupa genów kodujących receptory nach na chromosomie 15 wykazuje silną nierównowagę sprzężeń pomiędzy sobą. Region ten był zasocjowany z intensywnością palenia oraz ze stopniem uzależnienia od nikotyny [6, 39]. Wśród polimorfizmów wykazujących znaczące asocjacje w tym obszarze występowały warianty sekwencji kodującej, jak zmiana CHRNA5 rs , skutkująca substytucją aminokwasów (Asn398Asp) i zmiana synonimiczna CHR- NA3 rs W badaniach funkcjonalnych in vitro wykazano, że polimorfizm sekwencji kodującej podjednostkę α5 wpływa na funkcję receptora nach. Obecność izoformy α5 398Asp skutkowała mniejszą przepuszczalnością dla jonów wapnia (Ca 2+ ) oraz wydłużonym czasem powrotu receptora do aktywności [24]. Obserwacja ta wskazywała, że ten podtyp α5 może spowalniać tempo przekaźnictwa sygnału w odpowiedzi na nikotynę, skutkując ostatecznie nasileniem palenia. Podobnie, specyficzne etnicznie warianty podjednostki β4, częste w populacjach europejskich, bądź w afrykańskich, warunkują skrajnie różną wrażliwość receptora na działanie acetylocholiny oraz odmienny czas jego powrotu do aktywności. Wyniki badań funkcjonalnych na myszach, wskazują na powiązanie obecności w receptorze podjednostek α5 i β4 z efektami przedawkowania nikotyny oraz ze stopniem nasilenia somatycznych i pozasomatycznych objawów odstawienia tego związku [15]. Z uwagi na rolę podjednostek α5, α3 i β4 w determinowaniu odpowiedzi receptorów nach na nikotynę, kluczowe polimorfizmy w obrębie locus 15q25 stały się przedmiotem intensywnych badań w kierunku powiązań z występowaniem objawów odstawienia nikotyny oraz zaprzestaniem palenia. Choć należą one do najczęściej badanych w tym kontekście, nie uzyskano dotąd jednoznacznych danych odnośnie predykcyjnego znaczenia określonych SNPs. Nie potwierdzono ich związku z zaprzestaniem palenia w badaniach osób z populacji niemieckiej [4]. Nie obserwowano też ich wpływu na skuteczność zaprzestania palenia u osób poddanych terapii z zastosowaniem nikotyny lub bupropionu [9,34]. Z drugiej strony, polimorfizmy tego locus wykazywały asocjację z nasileniem objawów odstawienia i niezdolnością do zaprzestania palenia u osób, które zaczęły palić we wczesnym okresie życia [1] i z paleniem w czasie ciąży [13]. Również w badaniach farmakogenetycznych polimorfizmy tego obszaru okazały się czynnikami prognostycznymi skuteczności zaprzestania palenia w odpowiedzi na Przegląd Lekarski 2013 / 70 /

3 Tabela I Asocjacje na skalę genomu z paleniem tytoniu (wyniki podano w kolejności od najnowszych; wytłuszczono asocjacje istotne na poziomie GWAS, p<1 x 10-7 ). Genome-wide association for cigarette smoking behavior (the most recent data are given as the first; associations in bold significant at GWAS, p<1 x 10-7 ). Typ badania [źródło] Próba w badaniu początkowym Próba w badaniach replikacyjnych Region Zidentyfikowane geny Badana cecha Palenie tytoniu [29] dorosłych par bliźniąt z populacji fińskiej nie prowadzono 16p12.3 CLEC19A-TMC5 Sztuk / dzień 2q34 ERBB4 Uzależnienie Palenie tytoniu [23] osób palących o pochodzeniu japońskim osób palących o pochodzeniu japońskim Palenie tytoniu [11] Afroamerykanów nie prowadzono 19q13.2 CYP2A6 CYP2A7 Palenie 19q13.2 CYP2A6 Palenie 7q31.31 ANKRD7 KCND2 Palenie 15q25.1 PSMA4 CHRNA5 Sztuk / dzień 15q25.1 CHRNA5 Sztuk / dzień 1q44 C1orf100 Sztuk / dzień 15q12 MRPS18CP5 GABRB3 Sztuk / dzień 10q22.1 CHST3 SPOCK2 Wiek inicjacji 7q31.1 DNAJB9 EIF3IP1 Uzależnienie (F) 7q31.1 DNAJB9 EIF3IP1 Indeks palenia Palenie tytoniu [47] osób o pochodzeniu koreańskim Afroamerykanów i 671 osób o pochodzeniu 7q31.1 DNAJB9 EIF3IP1 Sztuk / dzień 5q33.2 PPIGP1 SGCD Palenie 7q31.1 DNAJB9 EIF3IP1 Indeks palenia Palenie tytoniu [27] osoby o pochodzeniu osoby o pochodzeniu 15q25.1 CHRNA3 Palenie 15q25.1 CHRNA3 Sztuk / dzień Palenie tytoniu [39] osób o pochodzeniu osób badanych 10q23.32 LOC Sztuk / dzień 19q13.2 EGLN2 Sztuk / dzień 11p14.1 BDNF Wiek inicjacji 9q34.2 FAM163B DBH Zaprzestanie 15q25.1 CHRNA3 Sztuk / dzień Palenie tytoniu [41] osób o pochodzeniu osób o pochodzeniu 19q13.2 CYP2A6 CYP2A7 Sztuk / dzień 8p11.21 C8orf40 CHRNB3 Sztuk / dzień 7p14.3 PDE1C SLC25A5P5 Sztuk / dzień 19q13.2 CYP2B6 Sztuk / dzień Zaprzestanie palenia [43] 369 osób o pochodzeniu nie prowadzono 14q24.2 RGS6 Zaprzestanie Zaprzestanie palenia [44] Palenie tytoniu [46] 324 osób o pochodzeniu osób o pochodzeniu nie prowadzono NI NI Zaprzestanie osób badanych 824 par bliźniąt NI NI Palenie 3q13.12 BBX Sztuk / dzień 1p22.3 LOC Okres palenia 3q24 C3orf58 GM2AP1 Indeks palenia Palenie tytoniu [6]# osób o pochodzeniu nie prowadzono 12q21.2 E2F7 NAV3 Palący vs Nie 16p13.3 RPS26P51 TMEM114 >10 sztuk / dzień 18q11.2 CABLES1 Wiek inicjacji 9q31.1 MTND3P4 - ARL2BPP7 Palący vs Byli Xp11.3 MAOA - MAOB >10 sztuk / dzień Palenie tytoniu [28] 840 osób o pochodzeniu Afroamerykanów, osoby o pochodzeniu NI NI Palenie Zaprzestanie palenia [45] 550 osób o pochodzeniu nie prowadzono NI NI Zaprzestanie Stosowane skróty i odnośniki: Palenie palenie papierosów; Sztuk / dzień - liczba papierosów / dzień; Uzależnienie (F) uzależnienie od nikotyny (test Fagerstroma); Indeks palenia - wysokość indeksu palenia (paczkolata); Zaprzestanie - zaprzestanie palenia; Okres palenia - długość okresu palenia; Palący vs Nie -palący/byli palacze w odniesieniu do niepalących; Palący vs Byli - palący w odniesieniu do byłych palaczy, Wiek inicjacji - wiek inicjacji palenia; >10 sztuk /dzień palący > 10 papierosów na dzień w odniesieniu do palących 10 papierosów na dzień # Pozostałe asocjacje wykazujące poziom istotności statystycznej od p = 3x10-6 do p = 7x10-6 a) Sztuk / dzień: 1p35.2 (PTPRU MATN1, rs910696,), 19p12 (ZNF93, rs ); Xq23 (TRPC5, rs ), 17p13.2 (CAMKK1, rs758642); b) Palący vs Nie: 5q14.3 (ARRDC3-AS1 RAB5CP2, rs933688); 9p21.2 (TUSC1 CAAP1, rs ), 3q27.2 (MIR548AQ - TRA2B, rs ); c) Palący vs Byli 12q21.33 (MRPL2P1 - LINC00615; rs ), >10 sztuk / dzień: 14q24.1 (ACTN1, rs ), 7p15.2 (SNX10 - SKAP2, rs886716), d) Wiek Inicjacji 4q31.1 (RAB33B - SETD7; rs ); e) Okres palenia 13q33.1 (SLC10A2 - ATP6V1G1P7; rs912969), 4q28.1 (MIR NUPL1P1, rs950063). 854 E. Strauss

4 NTZ [3, 32, 36], terapię bupropionem [36] oraz warenikliną [21]. CHRNA6 - CHRNB3 [8p11.21] Polimorfizm rs , występujący w regionie 8p11, wykazywał asocjację na poziomie wymaganym w GWAS z nasileniem palenia [41]. Zmiana ta zlokalizowana jest w pobliżu genu kodującego podjednostkę β3 receptora nach (CHRNB3). Przynależy ona do bloku silnie skorelowanych wariantów zawierającego również dwa polimorfizmy sekwencji kodującej (zmianę synonimiczną rs4593 i wariant powodujący zmianę aminokwasu rs4952). Wariant rs występuje w całkowitej nierównowadze sprzężeń z polimorfizmem rs , wykazującym we wcześniejszych badaniach wysoce prawdopodobny związek z rozwojem uzależnienia od nikotyny (rzadszy allel chronił przed wystąpieniem uzależnienia). Nie można jednak wykluczyć, że wytypowany w regionie 8p11 polimorfizm wskazuje na inne geny, jak gen kodujący podjednostkę α6 receptora nach (CHRNA6), który znajduje się w obrębie tego samego bloku sprzężeń. Receptory nach zawierające podjednostkę α6 występują głównie w obszarach mózgu, które są zaangażowane w uwalniania dopaminy pod wpływem stymulacji przez nikotynę i są one zaangażowane w rozwój uzależnienia. Znaczenie obu podjednostek α6 i β3 dla wystąpienia objawów odstawienia nikotyny potwierdzono w licznych badaniach na gryzoniach [15]. U ludzi, w badaniach rodzinnych wykazano asocjację trzech wariantów genu CHRNB3 z liczbą nieudanych prób zaprzestania palenia oraz pojedynczego wariantu CHRNA6 z uzależnieniem od nikotyny [20]. Podobnie, wyniki badań genów kandydatów wskazują na powiązanie polimorfizmów genów CHRNA6 i CHRNB3 z subiektywnie ocenianą odpowiedzią na nikotynę oraz z rozwojem uzależnienia od tej substancji. Znaczenie tych genów dla uwarunkowań uzależnienia od nikotyny wydaje się jednak mniejsze w porównaniu do wpływu wariantów locus 15q25 [35]. Geny kodujące enzymy metabolizujące nikotynę CYP2A6 CYP2B6 [19q13] Cytochromy P450 2A6 (CYP2A6) i 2B6 (CYP2B6) należą do systemu oksydaz o różnych funkcjach, które biorą udział w metabolizmie ksenobiotyków, w tym nikotyny. Około 70-80% nikotyny w organizmie człowieka ulega konwersji do kotyniny, a następnie 33-40% kotyniny ulega konwersji do 3 -hydroksykotyniny. Obie reakcje zachodzą przy przeważającym udziale enzymu CYP2A6 występującego w wątrobie. Tempo metabolizmu nikotyny warunkowane jest polimorfizmami genu kodującego ten enzym, przy czym w badaniach zgodności bliźniąt polimorfizmy tego genu nie wyjaśniały w pełni odziedziczalności tej cechy. Wariant CYP2A6*1 określany jest jako kodujący izoformę białka o prawidłowej aktywności (typu dzikiego), a wariant CY- P2A6*1B to wariant powodujący zwiększoną aktywność (szybszy metabolizm nikotyny). Allele CYP2A6*2 i *4, występujące z wysoką częstością u Azjatów (około 20%) i niską u osób rasy kaukaskiej (1%), warunkują powstawanie enzymu nie wykazującego aktywności metabolizmu nikotyny (allele zerowe ). W populacji rasy kaukaskiej częściej spotykane są allele warunkujące obniżoną aktywność enzymu CYP2A6*9 i *12 (9% populacji). Stwierdzona w badaniu GWA asocjacja regionu 19q13 z obniżoną częstością palenia dotyczyła polimorfizmu rs , który jest w nierównowadze sprzężeń z allelem CYP2A6*2 [41]. Wyniki badań asocjacji genów kandydatów potwierdzają związek alleli CYP2A6 z zaprzestaniem palenia i odpowiedzią na terapię zastępczą [16, 22]. Wskazuje się, jednak że z uwagi na dużą liczbę wariantów CYP2A6 oraz wpływy środowiska na aktywność kodowanego enzymu, fenotypowy biomarker aktywności (indeks trans 3 -hydroksykotyniny do kotyniny) może być bardziej niezawodnym predyktorem prawdopodobieństwa zaprzestania palenia, niż genotyp [49]. Rola cytochromu P450 2B6 w metabolizmie nikotyny nie została jednoznacznie potwierdzona. Cytochrom ten jest głównym enzymem zaangażowanym w metabolizm bupropionu [12]. Warianty CYP2B6*5 oraz *6 są związane z wolniejszym metabolizmem tego związku i mogą oddziaływać na możliwość utrzymania abstynencji po terapii bupropionem [10, 25]. Wykazano, że również inne polimorfizmy genu CYP2B6 o nieokreślonym jeszcze efekcie funkcjonalnym mogą wpływać na uzyskanie abstynencji w wyniku stosowania tego związku [21]. Geny kodujące inne białka i funkcjonalne RNA Pozostałe unikalne regiony chromosomowe związane z paleniem tytoniu zostały zidentyfikowane w badaniach przeprowadzonych przez konsorcjum Tobacco and Genetics [39]. EGLN2 [19q13] Polimorfizm rs g>a zlokalizowany w intronie 1 genu EGLN2 wykazywał asocjację z intensywnością palenia: każda kopia allelu G zwiększała liczbę wypalanych papierosów w ciągu dnia. EGLN2 koduje wielofunkcyjne białko, które uczestniczy w regulacji homeostazy tlenowej, w szlaku odpowiedzi na niedotlenienie indukowanym przez czynnik HIF1. Zidentyfikowany polimorfizm występuje w bliskim sąsiedztwie genu CYP2A6, stąd obserwowana asocjacja może być pochodną nierównowagi sprzężeń z genami kodującymi enzymy metabolizujące nikotynę [7]. W późniejszych badaniach grupie ponad 2 tysięcy palących jedyną cechą znacząco powiązaną z wariantem EGLN2 rs był brak zdolności do powstrzymania się od palenia (p= 5 x 10-3 ) [35]. LOC [10q23] Polimorfizm rs , zlokalizowany w sekwencji genu LOC dla długiego niekodującego RNA (lncrna) wykazywał asocjację z nasileniem palenia. Każda kopia allelu ryzyka zwiększała liczbę papierosów wypalanych w ciągu dnia o wartość ~0,5. Choć początkowa obserwacja wydawała się obiecująca, z uwagi na udział ncrna w szeregu procesów powiązanych z regulacją ekspresji genów (w tym w odpowiedzi na stres oksydacyjny), również tej asocjacji nie udało się potwierdzić w późniejszych badaniach [35]. FAM163B DBH [9q34.2] Pojedynczy SNP rs a>g w regionie chromosomowym 9q34.2, wykazywał asocjację z zaprzestaniem palenia. Allel G częściej był stwierdzany w grupie byłych palaczy, niż u aktualnie palących i warunkował on 0,19% międzyosobniczych różnic w zdolności do zaprzestania palenia. Polimorfizm ten zlokalizowany jest w pobliżu końca 3 genu DBH kodującego osoczowy enzym β-hydroksylazę dopaminy. Enzym ten katalizuje konwersję dopaminy do noradrenaliny, stąd polimorfizmy genu DBH były poprzednio przedmiotem zainteresowań w badaniach fenotypów związanych z cechami psychicznymi [48]. Choć wariant rs nie zmienia sekwencji aminokwasów, stwierdzona asocjacja mogła wynikać z jego oddziaływania na ekspresję genu: bezpośredniego lub pośredniego w wyniku nierównowagi sprzężeń z innym wariantem, jak polimorfizmem rs , występującym również w regionie 3 genu. Polimorfizm ten w populacjach o pochodzeniu odpowiada za 51% zmienności w aktywności DBH w osoczu [48]. BDNF [11p14.1] W regionie 11p14.1 asocjację z paleniem tytoniu na poziomie istotności wymaganym w badaniach GWA wykazywało aż 8 SNP, które w całości pokrywały transkrypt genu BDNF, kodującego czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego. Najsilniejszą asocjację wykazano dla wariantu rs6265, zlokalizowanego w eksonie 1. Każda kopia allelu C była odpowiedzialna za 6% wzrost ryzyka zostania regularnym palaczem tytoniu i warunkowała 0,03% zmienności w zakresie tego parametru. BDNF należy do rodziny neurotrofin, które regulują plastyczność synaptyczną i odpowiadają za przetrwanie neuronów cholinergicznych i dopaminergicznych. Ulega on wysokiej ekspresji w regionach mózgu związanych z poznawczym wzmocnieniem efektów nikotyny. Chociaż mechanizmy molekularne leżące u podstaw tej zależności nie zostały jeszcze wyjaśnione, prawdopodobne jest, że zmienność genetyczna w BDNF może wpływać na subiektywne odczucie satysfakcji z zażycia nikotyny poprzez modulację dopaminowego układu nagrody. Polimorfizm rs6265 jest również powiązany z występowaniem zaburzeń odżywiania i schizofrenii. W innych badaniach GWA korelował, także z indeksem masy ciała [42]. Co ciekawe, wyższą masę ciała warunkował ten sam allel, który był powiązany z regularnym paleniem tytoniu. Wybrane asocjacje genetyczne nie spełniające wymogów istotności GWAS Spośród asocjacji, które nie osiągnęły poziomu istotności p<1x10-7 uwagę zwracają polimorfizmy w obrębie regionów chromosomowych Xp11.3 oraz 14q24.2, które mogą oddziaływać na skuteczność prób zaprzestania palenia. W regionie Xp11.3 występują geny ko- Przegląd Lekarski 2013 / 70 /

5 dujące monoaminooksydazy A (MAOA) i B (MAOB), które są enzymami odgrywającymi rolę w procesie rozkładu katecholamin. Ich aktywność jest hamowania przez dym tytoniowy. Istnieją znaczące dowody, że palenie tytoniu powoduje obniżenie poziomów monoaminooksydaz, w następstwie czego zmniejszony katabolizm dopaminy skutkuje zwiększoną motywacją do palenia. W przeprowadzonym badaniu GWA, zlokalizowany w tym regionie chromosomowym polimorfizm rs wykazywał asocjację z intensywnością palenia, a jego znaczenie zostało potwierdzone w tej samej pracy w badaniu asocjacji obejmującym ocenę 359 genów kandydatów [6]. Dalsze badania regionu Xp11.3 wydają się uzasadnione, gdyż według szeregu doniesień decydujący wpływ na silne uzależnienie od papierosów może mieć występowanie w dymie tytoniowym inhibitorów MAO [17]. Polimorfizm rs genu RGS6, występującego w regionie 14q24.2, okazał się najbardziej znaczącym wariantem wpływającym na skuteczność zaprzestania palenia przy zastosowaniu NTZ w prospektywnej ocenie grupy 369 palących o pochodzeniu [43]. Zidentyfikowany gen koduje regulator przekaźnictwa sygnału za pośrednictwem białek G. Wykonana przez badaczy rozszerzona analiza znaczenia regionu 14q24.2 dla zaprzestania palenia z użyciem wyników badań własnych oraz 6 poprzednich badań GWA, wskazała na 52 SNPs zasocjowane z tą cechą. Nie przeprowadzono jeszcze innych badań potwierdzających zaznaczenie wariantów RGS6 dla zaprzestania palenia. Polimorfizmy zidentyfikowane w GWASs a choroby związane z paleniem tytoniu Palenie papierosów stanowi istotny czynnik ryzyka wielu chorób o złożonym wieloczynnikowym podłożu, stąd loci stwierdzone w badaniach GWA oceniane są także w kontekście rozwoju chorób zależnych od palenia tytoniu. Wykazano powiązania między wariantami sekwencji w obrębie grupy genów kodujących receptory acetylocholinowe na chromosomie 15q25 a występowaniem raka płuca, choroby tętnic obwodowych [40], choroby obturacyjnej płuc [31, 33] a także spadkiem wydolności płuc u aktywnych palaczy [31]. Również dla polimorfizmów w regionie 19q13 wykazano asocjację z rakiem płuca [7] i rozwojem choroby obturacyjnej płuc [8]. Większe znaczenie, w odniesieniu do zmian warunkujących nałóg palenia, mają w tym przypadku zmiany wpływające na międzyosobniczą zmienność we wrażliwości na ekspozycję na dym tytoniowy, wykazujące interakcję z paleniem. Przykładem tych oddziaływań jest wykazana w badaniach własnych interakcja pomiędzy allelem rs t genu podjednostki α czynnika odpowiedzi na hipoksję (HIF1A) a paleniem tytoniu, która nasilała rozwoju tętniaka aorty brzusznej u osób palących [38]. Podsumowanie Zakłada się, że odkrycie genów warunkujących cechy związane z uzależnieniem od palenia tytoniu przyczyni się do opracowania nowych leków pomocnych w zaprzestaniu palenia wszystkim, którzy tylko będą tego chcieli. Aktualnie jako środki wspomagające stosowane są NTZ, terapia bupropionem i warenikliną. Wskazuje się, że indywidualne zróżnicowanie metabolizmu podawanych substancji oraz wrażliwości receptorów nach na ich działanie może przesądzać o sukcesie danej terapii. Dlatego też kluczową sprawą jest indywidualizacja leczenia. Testy genetyczne opierające się na ocenie określonych polimorfizmów warunkujących zmienność osobniczą w odpowiedzi na leki oraz fenotypowe wskaźniki metabolizmu nikotyny mogą być pomocne w opracowaniu wskazań do właściwej farmakoterapii. Badania GWA, jako podejścia odkrywcze bez wstępnej hipotezy, przyczyniły się do wykrycia loci, które są zasocjowane z intensywnością palenia i uzależnieniem od nikotyny. Polimorfizmy w obrębie dwóch regionów chromosomowych 15q25 i 19q13, w których zlokalizowane są geny kodujące odpowiednio: podjednostki acetylocholinergicznych receptorów nikotynowych i enzymy metabolizujące nikotynę wykazują potwierdzony w innych badaniach związek z różnymi aspektami palenia tytoniu. Jedynie dwa loci udało się w tych badaniach powiązać ze skutecznością zaprzestania palenia: znacząco 9q34.2 lub z wysokim prawdopodobieństwem 14q24, przy czym wyniki tych badań nie doczekały się jeszcze powtórzenia w innych grupach badanych. Przełożenie stwierdzanych asocjacji na efekty biologiczne oraz ocena przydatności diagnostycznej SNPs identyfikowanych w badaniach GWA są skomplikowane i wymagają dalszych badań, z uwagi że ponad 90% wariantów wykrytych tą drogą zlokalizowanych jest w regionach niekodujących. Jednocześnie powtórzenie wyników dotyczących znaczenia określonych wariantów jest utrudnione z powodu rozbieżności w definicji fenotypu i kryteriach włączenia próby [20]. Pojawiają się już pierwsze doniesienia odnośnie wpływu wariantów genetycznych na odpowiedź na stosowanie każdej z obecnie dostępnych farmakologicznych terapii wspomagających zaprzestanie palenia. Podstawowym ograniczeniem tego typu badań jest brak dostępności odpowiednio dużej grupy badanej, co wynika z ogólnie niskiej skuteczności prób zaprzestania palenia. Z drugiej strony brak jest wiedzy w zakresie stopnia akceptacji przez pacjentów testów genetycznych, oraz szerszych doświadczeń klinicznych w opracowaniu i wdrażaniu protokołów postępowania. Pilotażowe badanie przeprowadzone w USA wskazało na możliwość przeprowadzenia tego typu indywidualizacji farmakoterapii w ramach podstawowej opieki zdrowotnej, dzięki wdrożeniu poradnictwa drogą telefoniczną i elektroniczną. Jednocześnie wskazano, że wdrożenie testów genetycznych nie miało negatywnych psychologicznych skutków dla pacjenta, w tym nie skutkowało wystąpieniem depresji, zmniejszeniem kontroli nad zaprzestaniem palenia oraz zmianą motywacji do zaprzestania palenia [30]. Poważnym ograniczeniem wnioskowania z większości dotychczas przeprowadzonych badań asocjacji z paleniem tytoniu jest ich retrospektywny charakter. Wyjaśnienie procesów rozwojowych, które łączą nowo odkryte genetyczne czynniki ryzyka z intensywnym paleniem w wieku dorosłym wymaga przeprowadzenia wieloletnich badań o charakterze prospektywnym Dostępne są wyniki tylko jednego badania (u 1037 osób z Nowej Zelandii) obejmującego 4 dekady życia, w którym uwzględniono wielogenową ocenę ryzyka dla predykcji rozwoju nasilonego palenia, utrwalenia nałogu i stopnia uzależnienia od nikotyny [2]. Wskaźnik ryzyka genetycznego oszacowano na podstawie wyników trzech metaanaliz badań GWA dotyczących intensywności palenia. Wykazano, że wartość tego parametru nie jest powiązana z wiekiem rozpoczęcia palenia, przy czym osoby obciążone wyższym ryzykiem genetycznym były bardziej skłonne do podjęcia codziennego palenia już w nastoletnim wieku, w krótszym czasie od rozpoczęcia palenia stawały się nałogowymi palaczami, miały silniej utrwalony nałóg, częściej rozwijały uzależnienie od nikotyny, częściej jako motywację do palenia wymieniały radzenie sobie ze stresem, a także zgłaszały więcej niepowodzeń przy próbach zaprzestania palenia. W dalszych badaniach wyodrębniono dwa fenotypy występujące u osób młodocianych: wczesną konwersję do codziennego palenia i szybką progresję do intensywnego palenia, które powiązane były z genetycznie warunkowanym ryzykiem rozwoju fenotypu trwałego nałogowego palenia w wieku dorosłym. Stopień ryzyka określony na podstawie genotypu okazał się wyższy od wartości oszacowanych na podstawie badań rodzinnych oraz dokładniejszy w ocenie indywidualnego ryzyka. Oczywistym ograniczeniem GWAS, wynikającym z metodyki badań, jest ich zawężenie do oceny polimorfizmów pojedynczych nukleotydów. Dalsze badania nad uwarunkowaniem palenia powinny być uzupełnione o ocenę wariantów liczby kopii i zmian insercyjno-delecyjnych. Na rolę CNV (ang. copy number variation) wskazują wyniki badania populacji japońskiej, w których na skalę genomu oceniono zarówno SNPs, jak i CNVs. Zidentyfikowano haplotypy genu CYP2A6 w regionie 19q13, składające się z obu typu wariantów, silnie powiązane z intensywnością palenia, a także z ryzykiem wystąpienia chorób związanych z paleniem tytoniu [23]. Podsumowując, aktualne wyniki GWAS wydają się przydatne do opracowania testów genetycznych służących indywidualizacji farmakoterapii wspomagającej zaprzestanie palenia i uzyskanie trwałej abstynencji. Konieczne są jednak dalsze badania nad wytypowaniem wariantów istotnych dla danej populacji, z uwzględnieniem zmienności liczby kopii, a także nad opracowaniem podejść umożliwiających zastosowanie tej wiedzy w praktyce klinicznej. Podziękowania Praca wykonana w ramach projektu badawczego finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki nr NN nad genetycznym uwarunkowaniem chorób układu krążenia związanych z paleniem tytoniu. Piśmiennictwo 1. Baker T.B., Weiss R.B., Bolt D. et al.: Human neu- 856 E. Strauss

6 ronal acetylcholine receptor A5-A3-B4 haplotypes are associated with multiple nicotine dependence phenotypes. Nicotine Tob. Res. 2009, 11, Belsky D.W., Moffitt T.E., Baker T.B. et al.: Polygenic risk and the developmental progression to heavy, persistent smoking and nicotine dependence: Evidence from a 4-decade longitudinal study. JAMA Psychiatry 2013, 70, Bergen A.W., Javitz H.S., Krasnow R. et al.: Nicotinic acetylcholine receptor variation and response to smoking cessation therapies. Pharmacogenet. Genomics 2013, 23, Breitling L.P., Dahmen N., Mittelstraß K. et al.: Smoking cessation and variations in nicotinic acetylcholine receptor subunits α-5, α-3, and β-4 genes. Biol. Psychiatry 2009, 65, Broms U., Silventoinen K., Madden P.A.F., et al.: Genetic architecture of smoking behavior: a study of Finnish adult twins. Twin. Res. Hum. Genet. 2006, 9, Caporaso N., Gu F., Chatterjee N. et al.: Genome-wide and candidate gene association study of cigarette smoking behaviors. PLoS One 2009, 4, e Chen L.S., Baker T.B., Grucza R. et al.: Dissection of the phenotypic and genotypic associations with nicotinic dependence. Nicotine. Tob. Res. 2012, 14, Cho M.H., Castaldi P.J., Wan E.S. et al.: A genome-wide association study of COPD identifies a susceptibility locus on chromosome 19q13. Hum. Mol. Genet. 2012, 21, Conti D.V., Lee W., Li D. et al.: Nicotinic acetylcholine receptor beta 2 subunit gene implicated in a systemsbased candidate gene study of smoking cessation. Hum. Mol. Genet. 2008, 17, David S.P., Brown R.A., Papandonatos G.D. et al.: Pharmacogenetic Clinical Trial of Sustained-Release Bupropion for Smoking Cessation. Nicotine. Tob. Res. 2007, 9, David S.P., Hamidovic A., Chen G.K. et al.: Genome-wide meta-analyses of smoking behaviors in African Americans. Transl. Psychiatry 2012, 2, e Faucette S.R., Hawke R.L., Lecluyse E.L. et al.: Validation of bupropion hydroxylation as a selective marker of human cytochrome P450 2B6 catalytic activity. Drug Metab. Dispos. 2000, 28, Freathy R.M., Ring S.M., Shields B. et al.: A common genetic variant in the 15q24 nicotinic acetylcholine receptor gene cluster (CHRNA5-CHR- NA3-CHRNB4) is associated with a reduced ability of women to quit smoking in pregnancy. Hum. Mol. Genet. 2009, 18, Gabrielsen M.E., Romundstad P., Langhammer A. et al.: Association between a 15q25 gene variant, nicotine-related habits, lung cancer and COPD among individuals from the HUNT study in Norway. Eur. J. Hum. Genet. 2013, ejhg Gold A., Lerman C.: Pharmacogenetics of smoking cessation: role of nicotine target and metabolism genes. Hum. Genet. 2012, 131, Gu D.F., Hinks L.J., Morton N.E. et al.: The use of long PCR to confirm three common alleles at the CYP2A6 locus and the relationship between genotype and smoking habit. Ann. Hum. Genet. 2000, 64, Guillem K., Vouillac C., Azar M.R. et al.: Monoamine oxidase inhibition dramatically increases the motivation to self-administer nicotine in rats. J. Neurosci. 2005, 25, Henningfield J., London E., Pogun S. et al.: Nicotine Psychopharmacology. Springer Berlin Heidelberg 2009, 192, Hindorff L.A., Sethupathy P., Junkins H.A. et al.: Potential etiologic and functional implications of genome-wide association loci for human diseases and traits. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009, 106, Hoft N.R., Corley R.P., McQueen M.B. et al.: Genetic association of the CHRNA6 and CHRNB3 genes with tobacco dependence in a nationally representative sample. Neuropsychopharmacology 2008, 34, King D.P., Paciga S., Pickering E. et al.: Smoking Cessation Pharmacogenetics: Analysis of Varenicline and Bupropion in Placebo-Controlled Clinical Trials. Neuropsychopharmacology 2012, 37, Kubota T., Nakajima-Taniguchi C., Fukuda T. et al.: CYP2A6 polymorphisms are associated with nicotine dependence and influence withdrawal symptoms in smoking cessation. Pharmacogenomics J. 2006, 6, Kumasaka N., Aoki M., Okada Y. et al.: Haplotypes with copy number and single nucleotide polymorphisms in CYP2A6 locus are associated with smoking quantity in a Japanese population. PLoS One 2012, 7, e Kuryatov A., Berrettini W., Lindstrom J.: Acetylcholine receptor (AChR) α5 subunit variant associated with risk for nicotine dependence and lung cancer reduces (α4β2)2α5 AChR function. Mol. Pharmacol. 2011, 79, Lee A.M., Jepson C., Hoffmann E. et al.: CYP2B6 Genotype Alters Abstinence Rates in a Bupropion Smoking Cessation Trial. Biological Psychiatry 2007, 62, Li M.: The genetics of nicotine dependence. Curr. Psychiatry. Rep. 2006, 8, Liu J.Z., Tozzi F., Waterworth D.M. et al.: Meta-analysis and imputation refines the association of 15q25 with smoking quantity. Nat. Genet. 2010, 42, Liu Y.Z., Pei Y.F., Guo Y.F. et al.: Genome-wide association analyses suggested a novel mechanism for smoking behavior regulated by IL15. Mol. Psychiatry 2009, 14, Loukola A., Wedenoja J., Keskitalo-Vuokko K. et al.: Genome-wide association study on detailed profiles of smoking behavior and nicotine dependence in a twin sample. Mol. Psychiatry 2013, mp McClure J.B., Swan G.E., St. John J. et al.: Pharmacogenetic Smoking Cessation Intervention in a Health Care Setting: A Pilot Feasibility Study. Nicotine Tob. Res. 2013, 15, Mohamed Hoesein F.A., Wauters E., Janssens W. et al.: Variants in the 15q24/25 locus associate with lung function decline in active smokers. PLoS One 2013, 8, e Munafo M.R., Johnstone E.C., Walther D. et al.: CHRNA3 rs genotype and short-term smoking cessation. Nicotine Tob. Res. 2011, 13, Pillai S. G., Ge D., Zhu G. et al.: A genome-wide association study in chronic obstructive pulmonary disease (COPD): identification of two major susceptibility loci. PLoS Genet. 2009, 5, e Ray R., Mitra N., Baldwin D. et al.: Convergent evidence that choline acetyltransferase gene variation is associated with prospective smoking cessation and nicotine dependence. Neuropsychopharmacology 2010, 35, Ray R., Tyndale R.F., Lerman C.: Nicotine dependence pharmacogenetics: role of genetic variation in nicotine-metabolizing enzymes. J. Neurogenet. 2009, 23, Sarginson J.E., Killen J.D., Lazzeroni L.C. et al.: Markers in the 15q24 nicotinic receptor subunit gene cluster (CHRNA5-A3-B4) predict severity of nicotine addiction and response to smoking cessation therapy. Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet. 2011, 156, Shi G., Boerwinkle E., Morrison A.C. et al.: Mining gold dust under the genome wide significance level: a two-stage approach to analysis of GWAS. Genet. Epidemiol. 2011, 35, Strauss E., Waliszewski K., Oszkinis G. i wsp.: Interakcja genetyczno-środowiskowa pomiędzy polimorfizmem HIF1-A 1772C>T a paleniem tytoniu zwiększa ryzyko rozwoju tętniaka aorty brzusznej. Przegl. Lek. 2012, 69, Tobacco and Genetics Consortium: Genome-wide meta-analyses identify multiple loci associated with smoking behavior. Nat. Genet. 2010, 42, Thorgeirsson T.E., Geller F., Sulem P. et al.: A variant associated with nicotine dependence, lung cancer and peripheral arterial disease. Nature 2008, 452, Thorgeirsson T. E., Gudbjartsson D. F., Surakka I. et al.: Sequence variants at CHRNB3-CHRNA6 and CYP2A6 affect smoking behavior. Nat. Genet. 2010, 42, Thorleifsson G., Walters G.B., Gudbjartsson D. F. et al.: Genome-wide association yields new sequence variants at seven loci that associate with measures of obesity. Nat. Genet. 2009, 41, Uhl G.R., Drgon T., Johnson C. et al.: Genome-wide association for smoking cessation success in a trial of precessation nicotine replacement. Mol. Med. 2010, 16, Uhl G.R., Drgon T., Johnson C. et al.: Genomewide association for smoking cessation success: participants in the Patch in Practice trial of nicotine replacement. Pharmacogenomics 2010, 11, Uhl G.R., Liu Q.R., Drgon T. et al.: Molecular genetics of successful smoking cessation: convergent genome-wide association study results. Arch. Gen. Psychiatry 2008, 65, Vink J.M., Smit A.B., de Geus E.J. et al.: Genomewide association study of smoking initiation and current smoking. Am. J. Hum. Genet. 2009, 84, Yoon D., Kim Y.J., Cui W.Y. et al.: Large-scale genome-wide association study of Asian population reveals genetic factors in FRMD4A and other loci influencing smoking initiation and nicotine dependence. Hum. Genet. 2012, 131, Zabetian C.P., Anderson G.M., Buxbaum S.G. et al.: A quantitative-trait analysis of human plasmadopamine beta-hydroxylase activity: evidence for a major functional polymorphism at the DBH locus. Am. J. Hum. Genet. 2001, 68, Zhu A.Z.X., Cox L.S., Nollen N. et al.: CYP2B6 and bupropion s smoking-cessation pharmacology: the role of hydroxybupropion. Clin. Pharmacol. Ther. 2012, 92, Zhu S-H., Melcer T., Sun J. et al.: Smoking cessation with and without assistance: A population-based analysis. Am. J. Prev. Med. 2000, 18, 305. Przegląd Lekarski 2013 / 70 /