EWOLUCJA UK ADU SYMBIOTYCZNEGO RHIZOBIUM ROŒLINY MOTYLKOWATE

Transkrypt

1

2

3 POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 3, EWOLUCJA UK ADU SYMBIOTYCZNEGO RHIZOBIUM ROŒLINY MOTYLKOWATE Jerzy Wielbo i Anna Skorupska 1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu. 2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne. 3. Charakterystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu. 4. Filogeneza roœlinnych gospodarzy. 5. Molekularne pod³o e predyspozycji roœlin do tworzenia brodawek. 6. Filogeneza rizobiów. 7. Ewolucja kompleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy czynników Nod. 8. Geny nod-nif: jednostka genetyczna o odrêbnej filogenezie. 9. Rozprzestrzenianie siê grup genów symbiotycznych. 10. Bakterie i roœliny ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ. 11. Œlepe uliczki ewolucji zjawisko niezgodnoœci uniemo liwiaj¹ce nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a roœlinami motylkowatymi. 12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu perspektywy. 13. Podsumowanie The evolution of Rhizobium-legumes symbiosis Abstract: The process of biological nitrogen fixation was developed by the living organisms over two billions years ago. Since that time it has been undergoing continuous evolution in parallel with the evolution of living organisms which eventually led to development of numerous varieties of this process. Non-symbiotic reduction of N 2 performed by free-living Archea and Bacteria is the oldest form of biological nitrogen fixation. The evolution of terrestrial seminal plants and their common predisposition for symbiotic interactions with microorganisms, especially with fungi, permitted the development of very effective symbiotic systems. The formation of correctly functioning symbiotic systems in which diazotrophic bacteria reduce atmospheric dinitrogen requires the expression of a genetic information, originating from three independently evolving sources: the plant genome, the bacterial genome and the nod-nif region. The plant genome and the nod-nif genes interact most pronouncely (phenotypic interactions), whereas the bacterial genome plays but a secondary role in the creation of symbiotic systems. The group of bacterial diazotrophic microsymbionts enlarges dynamically as an outcome of a significant mobility of the nodnif region and its dissemination among new bacterial species by the lateral gene transfer mechanism. 1. Importance of the biological nitrogen fixation. 2. Symbiotic and non-symbiotic diazotrophs. 3. Symbiotic nitrogen fixation: an overview.4. Phylogeny of plant-host species. 5. The molecular predisposition of plants for nodulation. 6. Phylogeny of rhizobia. 7. The evolution of enzymatic nitrogenase complex and Nod factors biosynthesis pathway. 8. nod-nif genes a region with its own phylogeny. 9. Dissemination of the symbiotic genes among the bacterial species. 10. Bacteria and plants the evolution of species and their interactions. 11. Dead ends of evolution non-effective symbioses as a result of incompatibility between plant host and its microsymbiont. 12. The perspectives of symbiotic nitrogen fixation. 13. Summary 1. Znaczenie biologicznego wi¹zania azotu Ca³kowit¹ iloœæ azotu na Ziemi szacuje siê na oko³o 1, t, z czego 98% znajduje siê w geosferze niedostêpnej dla organizmów ywych. Pozosta³e 2% przypada na trzy rezerwuary azotu: 263

4 atmosferê, gdzie azot gazowy wystêpuje g³ównie w formie cz¹steczkowej (N 2 ), lecz równie jako podtlenek (N 2 O), tlenek (NO) i dwutlenek (NO 2 ) azotu (3, t); organizmy ywe, w których azot wystêpuje jako sk³adnik zwi¹zków organicznych (ok t); glebê, gdzie azot g³ównie wchodzi w sk³ad zwi¹zków organicznych poddawanych mineralizacji, lecz wystêpuje równie w postaci azotanów (NO 3 ), azotynów (NO 2 ) i jonów amonowych (NH 4 + ) (ponad 3, t) [33]. Równowagê reguluj¹c¹ okreœlony iloœciowy udzia³ poszczególnych zwi¹zków azotu w jego ca³kowitej puli zapewnia szereg procesów, z których wiele przeprowadzanych jest przez mikroorganizmy. S¹ to: nitryfikacja utlenianie jonów amonowych poprzez azotyny do azotanów, przeprowadzane przez grupê chemolitotrofów m.in. przez Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrospira, Nitrobacter, Nitrococcus; denitryfikacja (oddychanie azotanowe) beztlenowa redukcja azotanów poprzez azotyny do azotu cz¹steczkowego przebiegaj¹ca z uwolnieniem energii, przeprowadzana m.in. przez Pseudomonas denitrificans, Paracoccus denitrificans, Thiobacillus denitrificans, Pseudomonas aeruginosa; redukcja dysymilacyjna azotanów do jonów amonowych (bez uzyskiwania energii), prowadzona m.in. przez Enterobacter czy Vibrio; asymilacja, czyli zamiana jonów amonowych w azot organiczny, wbudowywany w biomasê; amonifikacja, czyli enzymatyczna hydroliza organicznych zwi¹zków azotu z wydzieleniem jonów amonowych; biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego do jonów amonowych, prowadzona przez zró nicowane pod wzglêdem systematycznym bakterie, okreœlane wspólnym terminem diazotrofy. Biologiczna redukcja azotu cz¹steczkowego jest niezwykle istotnym ogniwem w cyklu obiegu azotu w przyrodzie, poniewa tylko niewielki u³amek nieorganicznych soli azotu znajduje siê w warstwie gleby dostêpnej dla organizmów ywych. Równoczeœnie iloœæ azotu cz¹steczkowego przekszta³canego rocznie w formy dostêpne dla wiêkszoœci organizmów ywych stanowi kilka procent iloœci azotu zawartej w tych organizmach. Aktywnoœæ diazotrofów dostarcza znacznie wiêcej zwi¹zanego N 2 (2, t rocznie) ni ca³kowita produkcja przemys³u nawozów sztucznych (3, t rocznie) i redukcja abiotyczna ( t rocznie), wiêc mo na przyj¹æ, e biologiczne wi¹zanie azotu jest obecnie g³ównym procesem utrzymuj¹cym równowagê pomiêdzy iloœci¹ N 2 a iloœci¹ NO 3 i NH 4 +. Dziêki biologicznej redukcji N 2 utrata azotu z gleby do atmosfery spowodowana denitryfikacj¹ nie jest bezpowrotna, co pozwala na zachowanie w glebie zasobu nieorganicznych soli azotu dostêpnych dla roœlin [5, 37, 43, 45, 73, 77]. Obserwowane obecnie proporcje pomiêdzy poszczególnymi procesami zwi¹zanymi z obiegiem azotu nie by³y sta³e na przestrzeni dziejów Ziemi. Przypuszcza siê, e przed 2,2 mld lat przewa a³a abiotyczna redukcja N 2 poprzez etap NO, która by³a skutkiem wy³adowañ elektrycznych w atmosferze. Wi¹zanie biologiczne pojawi³o 264

5 siê jako reakcja na rosn¹ce zapotrzebowanie organizmów ywych na zwi¹zki azotu, id¹ce w parze ze zmniejszeniem intensywnoœci wi¹zania abiotycznego [56]. Bior¹c pod uwagê istniej¹ce obecnie drogi przemian zwi¹zków azotu oraz ewolucjê atmosfery ziemskiej sugeruje siê, e biologiczne wi¹zanie N 2 jest ewolucyjnie najm³odszym procesem, powsta³ym po (kolejno): amonifikacji, denitryfikacji (istniej¹cej przed powstaniem atmosfery tlenowej) i nitryfikacji (wymagaj¹cej tlenu) [44]. 2. Diazotrofy symbiotyczne i niesymbiotyczne Mikroorganizmy redukuj¹ce cz¹steczkowy azot atmosferyczny, spotyka siê zarówno w domenie Archea jak i w domenie Bacteria [7, 31]. W domenie Bacteria (Bakterie), mikroorganizmy wi¹ ¹ce azot grupuj¹ siê g³ównie w typach Proteobacteria (Bakterie w³aœciwe), Cyanobacteria (Sinice) i Actinobacteria (Promieniowce). Wœród zdolnych do redukcji N 2 Proteobacteria spotykamy zarówno organizmy tlenowe (Azotobacter, Klebsiella) [31, 50], jak i beztlenowe (Clostridium) [34, 52]. Diazotrofy wystêpuj¹ wœród fotoautotrofów (Rhodospirillum, Rhodobacter) [41, 76], chemolitotrofów (Geobacter, Magnetospirillum) i heterotrofów (Burkholderia, Gluconacetobacter, Herbaspirillum, Azospirillum), czêsto egzystuj¹cych na powierzchni lub w zewnêtrznych warstwach tkanek roœlinnych [14, 17, 22, 42]. Diazotroficzne sinice mog¹ byæ zarówno organizmami l¹dowymi, pochodz¹cymi z ró nych stref klimatycznych, jak i morskimi [59, 72, 97]. Wchodz¹ w efektywn¹ symbiozê z roœlinami nale ¹cymi do mchów (Bryopsida), w¹trobowców (Hepaticopsida), glewików (Anthocerophytina, np. Anthoceros), paprociowych (Pterophytina, np. Azolla), nagozal¹ kowych sagowców (Cycadopsida, np. Cycas) i okrytozal¹ kowych (Myrtales, np. Gunnera). Sinice tworz¹ zewn¹trzkomórkowe symbiozy z ró nymi roœlinami; wyj¹tek stanowi Nostoc tworz¹ca wewn¹trzkomórkow¹ symbiozê z Gunnera. Wi¹zanie azotu u sinic zachodzi w specyficznych komórkach tzw. heterocystach przystosowanych do ochrony labilnej nitrogenazy przed tlenem [1, 10]. Zwi¹zek bakterii zdolnych do redukcji azotu cz¹steczkowego z eukariontami mo e przybieraæ czasem znacznie œciœlejsze formy. Wówczas mikroorganizmy dostarczaj¹ce ³atwo przyswajalnych zwi¹zków azotu staj¹ siê endosymbiontami roœlin lub zwierz¹t (termitów) jak niektóre Spirochaetales (krêtki) [39, 57, 58]. Symbioza diazotrofów (Proteobacteria i Actinobacteria) z roœlinami zachodzi zazwyczaj w obrêbie specjalnych organów roœlinnych brodawek korzeniowych lub (rzadziej) brodawek ³odygowych [63, 80]. Wiêkszoœæ bakterii symbiotycznych to Gram-ujemne bakterie glebowe okreœlane ogólnym terminem rizobiów, wchodz¹ce w interakcje z licznymi gatunkami z rodziny Fabaceae = Leguminoseae (motylkowate) oraz wyj¹tkowo z gatunkiem niemotylkowatej Parasponia z rodziny Ulmaceae (wi¹zowate) [79]. Promieniowce, Gram-dodatnie bakterie z rodzaju Frankia s¹ znacznie mniej wyspecjalizowanymi endosymbiontami ni rizobia [79]. Frankia jest symbiontem wybranych gatunków z 8 rodzin roœlin okrytozal¹ kowych: Betulaceae (1 z 6 gatunków), Casuarinaceae (wszystkie 4 gatunki), Elaeagnaceae (wszystkie 265

6 3 gatunki), Myricaceae (2 z 3 gatunków), Rhamnaceae (7 z 55 gatunków), Rosaceae (5 ze 100 gatunków), Datiscaceae (1 z 3 gatunków) oraz Coriariaceae (1 gatunek). Jednak pomimo znacznie mniejszej liczby potencjalnych gospodarzy nie nale y lekcewa yæ ekologicznego znaczenia wariantu symbiozy realizowanego przez Frankia. Przyjmuje siê, e iloœæ N 2 redukowanego w uk³adach z udzia³em promieniowców dorównuje iloœci azotu przyswajanego przy udziale rizobiów [10]. 3. Charakterystyka procesu symbiotycznego wi¹zania azotu Do nawi¹zania efektywnej symbiozy, w wyniku której nastêpuje redukcja azotu atmosferycznego, potrzebne s¹ dwa niezale ne dopasowane do siebie organizmy, czyli bakterie zdolne do wi¹zania N 2 na poziomie znacznie przekraczaj¹cym ich zapotrzebowanie na ten pierwiastek oraz roœliny, zapewniaj¹ce odpowiednie warunki dla tego procesu, tzn. beztlenowe œrodowisko i energiê konieczn¹ do przebiegu reakcji redukcji azotu cz¹steczkowego. Rhizobia (mikrosymbionty) zdolne do symbiotycznego wi¹zania N 2 maj¹ funkcjonalny kompleks enzymatyczny nitrogenazy redukuj¹cej N 2 do NH 3, komplet enzymów niezbêdnych do funkcjonowania szlaku biosyntezy chitolipooligosacharydów (czynników Nod) indukuj¹cych u roœlin powstanie brodawek korzeniowych, odpowiednio zbudowane struktury powierzchniowe umo liwiaj¹ce roœlinom rozpoznanie bakterii oraz prawid³owo funkcjonuj¹ce mechanizmy kolonizacji korzeni i hamowania reakcji obronnej roœlin. Roœlinny partner symbiozy (makrosymbiont) posiada receptory umo liwiaj¹ce percepcjê bakteryjnych czynników Nod, sprawne mechanizmy reakcji na chitolipooligosacharydy pozwalaj¹ce na wytworzenie brodawek, zestaw bia³ek pozwalaj¹cych bakteriom na kolonizacjê korzeni (noduliny buduj¹ce niæ infekcyjn¹) oraz bia³ka odpowiedzialne za zapewnienie mikroaerofilnych warunków w brodawkach odpowiednich dla redukcji azotu (np. leghemoglobiny czy bia³ka systemów transportu substancji bêd¹cych Ÿród³ami energii dla bakteroidów). Nawi¹zywanie efektywnej symbiozy jest procesem wieloetapowym i precyzyjnym [63, 80]. Rozpoczyna go wymiana sygna³ów pozwalaj¹ca na wzajemne rozpoznanie siê partnerów. Roœliny wydzielaj¹ do ryzosfery szereg zwi¹zków flawonoidowych, które s¹ atraktantami dla zgodnych mikrosymbiontów, hamuj¹ wzrost konkuruj¹cych z nimi bakterii oraz indukuj¹ za poœrednictwem bia³ka regulatorowego NodD ekspresjê bakteryjnych genów nod (ang. nodulation) odpowiedzialnych za brodawkowanie roœlin. Mikrosymbionty ulegaj¹ adhezji do powierzchni w³oœników korzeniowych i produkuj¹ tzw. czynniki Nod (chitolipooligosacharydy, CLOS) specyficzne morfogeny, które wywo³uj¹ zmiany morfologiczne we w³oœnikach korzeniowych oraz indukuj¹ w korze korzenia powstawanie nowych merystemów. Bakterie s¹ odpowiedzialne za supresjê roœlinnych mechanizmów obronnych i za poœrednictwem czynników Nod indukuj¹ nowe merystemy korzeni daj¹c pocz¹tek brodawkom korzeniowym. Rizobia docieraj¹ do zawi¹zków brodawek w obrêbie tubularnych struktur zwanych niæmi infekcyjnymi i zaka aj¹ brodawki. W zaka o- 266

7 nych brodawkach, bakterie otoczone roœlinnymi b³onami peribakteroidalnymi przekszta³caj¹ siê w bakteroidy zdolne do wi¹zania azotu dziêki ekspresji genów nif i fix (ang. nitrogen fixation) koduj¹cych bia³ka kompleksu enzymatycznego nitrogenazy. Struktury brodawki korzeniowej roœliny zapewniaj¹ odpowiednie œrodowisko dla przebiegu procesu redukcji azotu [63, 80]. Proces ten przybra³ swój obecny kszta³t w wyniku trwaj¹cych przez co najmniej kilkadziesi¹t milionów lat prób dopasowania budowy i funkcjonowania organizmów gospodarzy i mikrosymbiontów. Ewolucja symbiozy doprowadzi³a do wypracowania mechanizmów wzajemnego rozpoznawania partnerów oraz obustronnego zredukowania tych mechanizmów lub cech, które mog³yby niekorzystnie wp³yn¹æ na efektywnoœæ procesu. Obecnie zaœ ewolucja symbiotycznego wi¹zania azotu wydaje siê przebiegaæ w kierunku poszerzania krêgu zarówno mikrosymbiontów, jak i ich roœlinnych gospodarzy. 4. Filogeneza gatunków roœlinnych gospodarzy Na ogóln¹ liczbê 380 rodzin roœlin okrytozal¹ kowych, tylko 10 rodzin jest gospodarzami dla diazotroficznych symbiontów. Podanie zadawalaj¹cego wyjaœnienia dla faktu pojawienia siê cech umo liwiaj¹cych nawi¹zanie symbiozy u tej w¹skiej grupy roœlin by³o niemo liwe przy stosowaniu tradycyjnej taksonomii opartej o klasyfikacjê morfologiczn¹. W tym systemie taksonomicznym roœliny gospodarze dla diazotrofów nie stanowi¹ jednej grupy, lecz s¹ rozproszone po ró nych, nie zwi¹zanych ze sob¹ jednostkach systematycznych. Zastosowanie wspó³czesnej klasyfikacji opartej o analizê porównawcz¹ sekwencji genu rbcl koduj¹cego du ¹ podjednostkê chloroplastowej karboksylazy rybulozo-1,5- bisfosforanu pozwala na konstrukcjê drzewa filogenetycznego (kladogramu) grupuj¹cego razem przedstawicieli 10 wspomnianych rodzin w obrêbie taksonu Ró owe-i (ang. Rosid-I clade), wywodz¹c je od wspólnego przodka [79]. Poniewa nie wszystkie gatunki roœlin z ga³êzi ewolucyjnej Ró owe-i s¹ zdolne do nawi¹zywania symbiozy z mikroorganizmami, jedn¹ z jego podgrup, z³o on¹ w wiêkszoœci z potencjalnych gospodarzy, okreœla siê mianem kladu wi¹ ¹cego azot (ang. nitrogen-fixing clade). Uwa a siê, e w przypadku pozosta³ych roœlin z Ró owych-i utrata zdolnoœci do symbiotycznego wspó³ ycia z bakteriami lub promieniowcami jest wtórna i mo e wynikaæ z mutacji pojedynczych genów [11]. Klasyfikacja oparta o sekwencjê rbcl dowodzi równie, e symbioza typu roœlina-sinice (na przyk³adzie Gunnera-Nostoc) [65] to odmienny i ewolucyjnie bardzo odleg³y wariant tego zjawiska [79]. Poszukiwanie cech wspólnych ³¹cz¹cych roœliny z grup potencjalnych gospodarzy dla wi¹ ¹cych azot symbiotycznych diazotrofów wykaza³y, e istniej¹ równie inne, wspólne dla nich cechy genetyczne. Podobnie jak w przypadku rbcl, badanie sekwencji genów leghemoglobin roœlinnych, czy sekwencji ITS (ang. internal transcribed spacer) w obrêbie genów rdna pozwoli³o na skonstruowanie drzew filogenetycznych grupuj¹cych roœliny zdolne do symbiozy w obrêbie blisko spokrewnionych taksonów [86, 91]. 267

8 5. Molekularne pod³o e predyspozycji roœlin do tworzenia brodawek Uwa a siê, e predyspozycja roœlin do tworzenia brodawek wynika z obecnoœci w ich genomie specyficznych genów regulatorowych. Mog¹ one kodowaæ bia³ka takie jak np. Nmh7, NmhC5 czy Ngl9 w Medicago truncatula, które s¹ czynnikami transkrypcyjnymi typu kaseta-mads (skrót od nazw 4 genów roœlinnych dla czynników transkrypcyjnych: mcm1, ap3, defa, srf) [25, 26, 100]. Bia³ka typu kaseta-mads s¹ szeroko rozpowszechnione wœród roœlin. Uwa a siê, e ich wszystkie obecnie spotykane warianty wywodz¹ siê od prototypu obecnego u roœlin przed rozdzieleniem siê linii rozwojowych paproci i roœlin nasiennych. W wyniku duplikacji pojedynczego genu oraz póÿniejszej ewolucji jego kopii u wspólnych przodków nago- i okrytonasiennych (ok. 340 mln lat temu) prawdopodobnie pojawi³a siê rodzina genów okreœlana mianem kwiatowych genów homeotycznych (ang. floral homeotic genes), z której wywodz¹ siê wszystkie bardzo licznie spotykane warianty genów bia³ek MADS [55]. Obecnie bia³ka tego typu funkcjonuj¹ jako czynniki transkrypcyjne zaanga owane w rozwój kwiatów, i s¹ odpowiedzialne za skierowanie komórek na okreœlon¹ drogê ró nicowania [26]. Wyró nia siê wœród nich 2 podgrupy: bia³ka odpowiedzialne za cechy merystemów, z których rozwijaj¹ siê tkanki kwiatów, oraz bia³ka odpowiedzialne za wykszta³cenie poszczególnych cech kwiatów [25]. Prawdopodobnie pojawienie siê bia³ek typu kaseta-mads oraz realizowanych przez nie mechanizmów regulacyjnych by³o warunkiem niezbêdnym dla wytworzenia przez roœliny nowych organów kwiatów [55]. Mo na przypuszczaæ, e dalsza ewolucja niektórych genów dla bia³ek MADS doprowadzi³a do powstania nowych wariantów, takich jak np. bia³ka Nmh7, NmhC5, Ngl9, w przypadku których dosz³o do zmiany miejsca ekspresji i utworzenia nowych merystemów korzenia oraz nowych organów indukowanych dzia³alnoœci¹ bakterii. Bez zmian pozosta³a natomiast zdolnoœæ bia³ek typu kaseta-mads do kierowania ekspresj¹ innych genów, a przez to do sterowania programem rozwoju okreœlonego organu brodawki korzeniowej. Najwiêksz¹ adaptacjê w tym kierunku wykaza³y niektóre gatunki roœlin z rodziny motylkowatych. Badania Leguminoseae wykaza³y, e w trakcie ewolucji w ich trzech podrodzinach, tzn. Ceasalpinioideae (brezylkowate), Mimosoideae (mimozowate), oraz Papillionoideae (motylkowate w³aœciwe) ró nie kszta³towa³a siê presja selekcyjna zwi¹zana z wykszta³caniem siê cech pomocnych w nawi¹zywaniu symbiozy z diazotrofami. Zdolnoœæ do symbiozy z rizobiami obserwuje siê u oko³o 30% Ceasalpinioideae, podczas gdy u Mimosoideae oraz Papillionoideae, które prawdopodobnie wyewoluowa³y z prymitywnych Ceasalpinioideae, iloœæ gatunków wchodz¹cych w symbiozê wynosi oko³o 90% ogólnej ich liczby [4]. Tworzenie brodawek wynikaj¹ce z regulacyjnej aktywnoœci czynników transkrypcyjnych typu kaseta-mads zale y równie od obecnoœci bakterii i produkowanych przez nie zwi¹zków. Jednak w pewnych warunkach u roœlin motylkowatych takich jak lucerna czy koniczyna mo na zaobserwowaæ spontaniczne (przebiegaj¹ce bez udzia³u bakterii) ukierunkowanie rozwoju zespo³ów komórek, prowadz¹ce do powstania merystemów w korze korzenia lub struktur przypominaj¹cych brodawki 268

9 (tzw. pseudobrodawek). We wnêtrzu pseudobrodawek stwierdzono wystêpowanie du ych iloœci amyloplastów oraz tkanek aktywnych w transporcie metabolitów. Przypuszcza siê, e tego typu lub podobne struktury mog³y u przodków motylkowatych stanowiæ organy przechowywania skrobi, po czym zosta³y zaadaptowane do nowych funkcji [2, 23, 47]. Szereg faktów przemawia za przyjêciem hipotezy, e symbioza roœliny diazotrofy jest szczególnym wariantem ogólnej predyspozycji roœlin do wchodzenia w symbiozê z innymi organizmami. Szacuje siê, e oko³o 80% roœlin l¹dowych jest zdolne do symbiozy z grzybami, czyli endomikoryzy. Jest to najstarszy typ symbiozy wykryty w skamienielinach roœlin l¹dowych pochodz¹cych sprzed 400 mln lat [66]. Istot¹ mikoryzy jest wymiana substancji mineralnych (g³ównie zwi¹zków fosforu) uzyskiwanych przez grzyby, na zwi¹zki wêgla produkowane przez roœliny. Mikoryzê od symbiozy z udzia³em bakterii odró nia znacznie ni sza specyficznoœæ oraz brak zdolnoœci do wywo³ywania precyzyjnie kontrolowanych zmian w tkankach roœlinnych. Istnieje jednak wiele cech wspólnych mikoryzy i symbiozy: stymulacja kie³kowania spor i rozwoju grzybni przez flawonoidy, adhezja i penetracja tkanek roœlinnych, wymiana substancji od ywczych, brak indukcji silnych reakcji obronnych u gospodarza [27]. W wyniku zaka enia roœlin przez grzyby mikoryzowe obserwuje siê wzrost aktywnoœci genów zaanga owanych w procesy odpornoœciowe roœlin, jednak jest to indukcja na bardzo ograniczon¹ skalê podobnie jak w przypadku infekcji Rhizobium [70]. Symbioza i mikoryza maj¹ czêœciowo nak³adaj¹cy siê program genetyczny, co oznacza, e istnieje zwi¹zek pomiêdzy zdolnoœci¹ do tworzenia efektywnych brodawek a zdolnoœci¹ do nawi¹zywania mikoryzy u okreœlonych roœlin. Mutanty roœlin motylkowatych niezdolne do brodawkowania lub tworz¹ce brodawki defektywne mog¹ byæ równie niezdolne do wchodzenia w symbiozê z grzybami [70, 75]. Badania funkcjonuj¹cych w komórkach roœlinnych szlaków transmisji sygna³ów wykaza³y, e za percepcjê sygna- ³ów wysy³anych przez bakteryjne lub grzybowe mikrosymbionty odpowiedzialne s¹ te same bia³ka roœlinne, takie jak SYMRK (ang. symbiosis receptor-like kinase) wystêpuj¹ca u Lotus japonicus (komonica) lub NORK (ang. nodulation receptor kinase) obecna w komórkach Medicago (lucerna) i Pisum (groch). Kinazy te zlokalizowane s¹ w b³onie komórkowej i przypuszczalnie pe³ni¹ funkcjê receptora dla bakteryjnych czynników Nod [15, 83]. Prawdopodobnie mechanizmy funkcjonuj¹ce w mikoryzie zosta³y zaadaptowane i zmodyfikowane do formy obecnie obserwowanej w przypadku symbiozy roœlin i diazotrofów. U³atwieniem dla ewolucji nowego procesu mog³a byæ obecnoœæ roœlin, grzybów i bakterii we wspólnym œrodowisku, niekiedy przejawiaj¹ca siê jako endosymbioza bakterii wi¹ ¹cych azot w organizmach grzybów [51]. Podsumowuj¹c mo na stwierdziæ, e zdolnoœæ roœlin do nawi¹zywania symbiozy z bakteriami, manifestuj¹ca siê morfologicznie jako zdolnoœæ do tworzenia brodawek przeznaczonych do zasiedlenia przez bakterie, jest mo liwa u gatunków wykazuj¹cych szereg okreœlonych cech fizjologicznych. Mo na do nich zaliczyæ zdolnoœæ do syntezy leghemoglobin, czynników transkrypcyjnych typu kaseta-mads oraz wielu innych, dotychczas nieznanych bia³ek. Wiadomo jednak, e ich wystêpowanie jest 269

10 skorelowane z obecnoœci¹ okreœlonych wariantów genów rbcl, leghemoglobin, czy sekwencji ITS, co wskazuje na istnienie wspólnej filogenetycznie linii rozwojowej dla tego typu roœlin. 6. Filogeneza rizobiów Podobnie jak roœliny, które s¹ gospodarzami dla wi¹ ¹cych azot mikrosymbiontów, równie rizobia nie stanowi¹ z punktu widzenia systematyki jednolitej grupy o wspólnej filogenezie. Metody klasyfikacji oparte o podobieñstwo sekwencji genów 16S rdna (koduj¹cego 16S rrna) umieszczaj¹ zdecydowan¹ wiêkszoœæ wi¹- ¹cych azot bakterii symbiotycznych w obrêbie rodziny Rhizobiaceae (Rys. 1) [99]. Okreœla siê je równie mianem ga³êzi Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium (ang. Mesorhizobium / Rhizobium / Sinorhizobium branch), nale ¹c¹ wraz z trzema 270 Rys. 1. Drzewo filogenetyczne Rhizobiaceae oparte na sekwencji 16S rdna wykonane metod¹ najbli szego s¹siedztwa (ang. neighbor-joining) [wg. 99]

11 pozosta³ymi ga³êziami Bradyrhizobium, Azorhizobium i Methylobacterium do podklasy " Proteobacteria. Bakteryjne endosymbionty roœlin spotyka siê równie wœród gatunków zaliczanych do podklasy $ Proteobacteria. S¹ to niektóre szczepy Burkholderia, znajduj¹ce siê tam obok wi¹ ¹cych N 2 niesymbiotycznych Herbaspirillum i Azoarcus [29, 53]. Niewykluczone, e w miarê postêpu badañ odkrywane bêdzie coraz wiêcej ewolucyjnie odleg³ych od siebie gatunków bakterii zdolnych do nawi¹zania efektywnej symbiozy z roœlinami. Nale y bowiem pamiêtaæ, e do tej pory scharakteryzowano mikrosymbionty dla zaledwie 10% z 750 istniej¹cych rodzajów roœlin motylkowatych [53, 87]. Sekwencja genu koduj¹cego 16S rrna nie jest jedynym kryterium, na podstawie którego mo na tworzyæ drzewa filogenetyczne (dendrogramy) bakterii. Jako referencyjne wykorzystuje siê równie geny takie jak 23S rdna [88], czy geny syntetazy glutaminowej (GS) [64]. Wykorzystanie wszystkich trzech wymienionych genów daje w zasadzie podobne wyniki, potwierdzaj¹c ugruntowan¹ pozycjê systematyczn¹ wiêkszoœci gatunków rizobiów. Obserwowane niewielkie ró nice, pojawiaj¹ce siê w przypadku opierania klasyfikacji o ró ne geny s¹ nie do unikniêcia, ze wzglêdu na ró ne tempo ewolucji tych genów; obserwuje siê je nawet w przypadku definiowania jednostek taksonomicznych w oparciu o ró ne fragmenty tego samego genu [13]. Niezale nie od wyboru genu u ytego w celach taksonomicznych, przeprowadzone badania wykazuj¹, e bakterie symbiotyczne zdolne do wi¹zania azotu w komórkach roœlin nale ¹ do kilku ró nych, czasem bardzo od siebie ewolucyjnie odleg³ych linii rozwojowych. Dlatego uwa a siê, e zdolnoœæ do indukowania brodawek i wi¹zania w nich azotu wyp³ywaj¹ca z faktu posiadania przez bakterie genów brodawkowania nod i genów nitrogenazy nif ma niewiele wspólnego z pozycj¹ systematyczn¹ poszczególnych gatunków bakterii, okreœlan¹ na podstawie analizy sekwencji genów takich jak 16S rdna. 7. Ewolucja kompleksu enzymatycznego nitrogenazy i szlaku biosyntezy czynników Nod Kompleks nitrogenazy sk³ada siê z homodimeru metaloproteiny Fe o masie cz¹st. oko³o 60 kda (kodowanej przez gen nifh) oraz tetrameru metaloproteiny Mo-Fe (" 2 $ 2 ) o masie oko³o 240 kda (kodowanych przez geny nifd i nifk) [32]. Do ekspresji i dzia³ania nitrogenazy wymagana jest ponadto obecnoœæ kilkunastu bia³ek, kodowanych przez geny nif i tworz¹cych operony. Takie operony wraz z towarzysz¹cymi im jednostkami monocistronowymi mog¹ byæ zgrupowane w obrêbie wydzielonego regionu genetycznego po³o onego na plazmidzie lub chromosomie lub lokowaæ siê w ró nych, odleg³ych od siebie miejscach chromosomu stanowi¹c regulon [50, 69, 84, 85]. Przypuszcza siê, e istnienie wielu genów nif jest skutkiem ewolucji prototypu genu nitrogenazy powsta³ego u wspólnych przodków Archea i Bacteria [36]. Duplikacje i dywergencja poszczególnych jego kopii prawdopodobnie spowodowa³a powstanie genów nifh oraz operonów nifdk i nifen [18]. Z kolei ewolucja genów nifdk doprowadzi³a do powstania nowych wariantów kompleksu metaloprotein 271

12 Mo-Fe, w których dosz³o do wymiany molibdenu na wanad (metaloproteina V-Fe, kodowana przez geny vnfdk, spotykana u Azotobacter saliestris, A. chroococcum czy Anabaena variabilis), lub do utraty zdolnoœci wi¹zania atomów dwu ró nych metali na korzyœæ wy³¹cznoœci elaza (metaloproteina Fe, kodowana przez geny anfdk, spotykana u Clostridium pasteurianum, Rhodobacter capsulatus, Rhodospirillum rubrum czy Azomonas macrocytogenes) [31, 32, 41, 76]. Obecnie spotyka siê trzy g³ówne typy nitrogenaz, przy czym mo liwe jest wystêpowanie dwóch ró - nych izoform enzymu w komórkach jednego szczepu bakterii [40, 41, 76]. Zakres wystêpowania poszczególnych typów nitrogenaz w populacjach bakteryjnych w znacznej czêœci zale y od zjawiska poziomego transferu genów [7]. Czynniki Nod (chitolipooligosacharydy) s¹ g³ównymi czynnikami bakteryjnymi wyzwalaj¹cymi u roœlin mechanizm brodawkowania. Poszczególne rodzaje czynników Nod produkowane przez ró ne szczepy rizobiów mog¹ wykazywaæ znaczne ró nice dotycz¹ce ich struktury jak równie zakresu reaguj¹cych na nie roœlin. Tym niemniej wszystkie zbudowane s¹ z oligosacharydowego rdzenia i przy³¹czonych do niego podstawników, do których zawsze nale y reszta d³ugo³añcuchowego nienasyconego kwasu t³uszczowego [49]. Istniej¹ przes³anki wskazuj¹ce, e szlak biosyntezy tego typu zwi¹zków móg³ powstaæ dziêki modyfikacji szlaku biosyntezy zwi¹zków wchodz¹cych w sk³ad struktur powierzchniowych bakterii, takich jak np. BF-7 z grupy diglikozylodiacylogliceroli (DGDG). Prawdopodobnie z powodu ró nic w strukturze chemicznej, BF-7 nie wywo³uje tak rozleg³ych zmian w tkankach roœlin jak CLOS, tym niemniej jego synteza jest powi¹zana z syntez¹ czynników Nod [60]. Przyk³ad BF-7 mo e wyjaœniaæ mechanizm zmian prowadz¹cych do syntezy zwi¹zków sekrecyjnych o charakterze morfogenów (chitolipooligosacharydy) w wyniku ewolucji szlaków biosyntezy zwi¹zków buduj¹cych struktury powierzchniowe bakterii. Analiza sekwencji genów nod (noda, nodc, nodd) ujawni³a, e ich ewolucja przebiega³a wspólnie (jako ca³ych zespo³ów), lecz z ró nie ukierunkowan¹ presj¹ selekcyjn¹ [91]. W przypadku tzw. genów wspólnych nod (ang. common nod genes), spotykanych u wszystkich rizobiów, presja selekcyjna zapewni³a zachowanie wzglêdnie du ej konserwatywnoœci sekwencji. W przypadku genów nod okreœlaj¹cych specyficznoœæ gospodarza (ang. host specifity nod genes) presja selekcyjna innego rodzaju pozwoli³a na wyewoluowanie wielu nowych genów, których wystêpowanie ograniczone jest do niewielkiej liczby szczepów. Poniewa w wyniku ekspresji genów nod bakterie tworz¹ lipooligosacharydowe morfogeny przeznaczone do dzia³ania na komórki i tkanki œciœle okreœlonego gatunku roœlin, dlatego struktura tych zwi¹zków musi byæ dopasowana do mo liwoœci percepcyjnych okreœlonych roœlin. Dziêki temu bakterie ró nych gatunków wchodz¹ce w symbiozê z tym samym gospodarzem [np. w uk³adzie Phaseolus (fasola) Rhizobium leguminosarum bv. phaseoli, R. etli, R. gallicum czy Sinorhizobium sp. (Phaseolus)] wykazuj¹ bardzo wysokie podobieñstwo sekwencji swoich genów nod [35]. Równie mikrosymbionty roœlin zbli onych pod wzglêdem fizjologicznym (tworz¹cych podobny typ brodawek) wykazuj¹ bliskie pokrewieñstwo genów nod, rizobia zasiedlaj¹ce brodawki typu niezdeterminowanego R. leguminosarum bv. viciae, bv. trifolii i S. meliloti, czy obecne w brodawkach typu zdeterminowanego R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91]. 272

13 8. Geny nod-nif: jednostka genetyczna o odrêbnej filogenezie Geny nif oraz geny nod stanowi¹ region genomu rizobiów, zlokalizowany najczêœciej na jednym z plazmidów, nazwanym symbiotycznym (psym). Szacuje siê, e wystêpuje 45 typów zespo³ów genów nod oraz 41 typów grup genów nif, daj¹cych w sumie ponad 50 typów zespo³ów genów symbiotycznych [35]. Drzewa filogenetyczne rizobiów konstruowane w oparciu o sekwencje genów nod lub nif s¹ do siebie zbli one. Jednoczeœnie obserwuje siê du e rozbie noœci przy porównaniu ich do dendrogramów tworzonych w oparciu o sekwencje genów takich jak geny koduj¹ce 16S rrna, 23S rrna czy syntetazê glutaminow¹ (GS). Grupowanie gatunków mikrosymbiontów na podstawie homologii regionu nod-nif jest w wysokim stopniu zgodne z grupowaniem ich roœlinnych gospodarzy opartym o analizê sekwencji genów leghemoglobin, genu rbcl czy sekwencji ITS. Pozwala to na stwierdzenie, e istot¹ ewolucji procesu symbiozy rizobia roœliny motylkowate jest dopasowanie siê fenotypów roœlin i fenotypów bakterii bêd¹cych wynikiem dzia³ania okreœlonych zestawów genów nod-nif. Pozosta³a czêœæ genomu bakterii pe³ni w tym procesie raczej drugoplanow¹ rolê [10, 86, 91]. 9. Rozprzestrzenianie siê grup genów symbiotycznych Obecnoœæ regionu nod-nif w genomach odleg³ych ewolucyjnie gatunków bakterii glebowych wynika z pionowego lub poziomego mechanizmu przekazywania zespo³u tych genów. Badania populacyjne dowiod³y, e w przekazywaniu i rekombinacji materia³u genetycznego u rizobiów preferencyjnie wykorzystywana jest œciœle okreœlona strategia [3, 20, 46, 48, 71, 82]. Jej charakterystycznymi cechami s¹: du e potencjalne mo liwoœci przekazywania materia³u genetycznego na drodze koniugacji (do 40% materia³u genetycznego rizobiów znajduje siê w plazmidach); wysoka czêstoœæ rekombinacji wynikaj¹ca z wystêpowania sekwencji insercyjnych, sekwencji powtórzonych i zduplikowanych genów (ang. reiterrated genes); wystêpowanie zjawiska przesuniêcia równowagi sprzê eñ miêdzy genami (sprzê enia niezrównowa one) (ang. linkage disequilibrium) pozwalaj¹cego na nieprzypadkowe segregowanie alleli, co prowadzi do powstania kilku odrêbnych linii w populacji; sporadyczna wymiana materia³u genetycznego pomiêdzy liniami/gatunkami; swobodna wymiana genetyczna w obrêbie linii/gatunku. Poziomy transfer genów, czêsto zlokalizowanych na plazmidach i przekazywanych za ich poœrednictwem, obserwowany pomiêdzy liniami (czy gatunkami) zdarza siê wprawdzie niezbyt czêsto [78, 94], lecz mo e mieæ szczególne znaczenie w przypadku drastycznej zmiany warunków ycia mikroorganizmów lub spotkania dwu do tej pory nie kontaktuj¹cych siê linii/gatunków. W takich warunkach mo e wydatnie pomóc w wygenerowaniu nowego fenotypu, potrzebnego do zasiedlenia nowych terenów lub gospodarzy [95]. O du ym znaczeniu koniugacyjnego 273

14 przekazywania plazmidu symbiotycznego dla rozprzestrzeniania siê w populacjach bakteryjnych zdolnoœci do wchodzenia w efektywn¹ symbiozê z roœlinami motylkowatymi œwiadcz¹ takie zjawiska jak: uderzaj¹ce podobieñstwo genów wspólnych nod w grupie obejmuj¹cej R. leguminosarum bv. trifolii, bv. viciae i S. meliloti, jak równie obserwowane w grupie skupiaj¹cej m.in. R. leguminosarum bv. phaseoli i Bradyrhizobium [91]; wystêpowanie tego samego plazmidu psym, pochodz¹cego z R. leguminosarum bv. trifolii, w komórkach R. tropici i S. meliloti, zajmuj¹cych tê sam¹ co R. leguminosarum bv. trifolii niszê ekologiczn¹ [78]; badania genetyczne nad Rhizobium galegae wykazuj¹ce, e jest to prawdopodobnie Agrobacterium (podobieñstwo sekwencji 16S rdna) wyposa ony w region symbiotyczny nod-nif rizobiów szybkorosn¹cych (R. leguminosarum bv. trifolii, bv. viciae czy S. meliloti) [86]; symbiotyczne wi¹zanie azotu przez Methylobacterium nodulans, Burkholderia sp. STM678 i STM815 czy Ensifer adhaerens, bêd¹ce wynikiem nabycia przez te bakterie genów nod i nif [53, 68, 87]. Przeniesienie plazmidu symbiotycznego czêsto oznacza dla jego biorcy ca³kowit¹ zmianê behawioru np. zmianê z patogena lub z bakterii ywi¹cej siê innymi bakteriami w symbionta roœlin [68, 86]. Z drugiej strony stwierdzono, e niektóre z cech bakterii opisywanych jako charakterystyczne dla patogena (a nie dla rizobiów) utrzymuj¹ siê tak e u symbiotycznych rizobiów, jak np. synteza opin (typowa dla komórek roœlinnych zaka onych przez Agrobacterium) obserwowana w brodawkach korzeniowych indukowanych przez S. meliloti [54]. W genomie bakterii z rodzaju Rhizobium stwierdzono równie wystêpowanie genów koduj¹cych bia³ka nale ¹ce do III systemu sekrecyjnego (ang. type III secretion system, TTSS) [62, 93]. W sk³ad tego systemu wchodzi ca³y szereg bia³ek pozwalaj¹cych mikroorganizmom na infekcjê komórek eukariotycznych, dlatego bia³ka TTSS wystêpuj¹ powszechnie u wielu bakteryjnych patogenów roœlin i zwierz¹t [21, 92]. Na przyk³adzie bakteryjnych endosymbiontów owadów wykazano, e prowadz¹ce do mutualizmu zacieœnianie symbiozy jest skorelowane z postêpuj¹c¹ redukcj¹ III systemu sekrecyjnego od zmniejszania aktywnoœci transkrypcyjnej genów koduj¹cych bia³ka TTSS po ca³kowit¹ ich utratê [8]. Mo na wiêc przypuszczaæ, e gatunki rizobiów uwa ane obecnie za typowe i modelowe (jak np. Sinorhizobium meliloti), to bakterie dawniej saprofityczne lub patogenne dla roœlin, a zmiana ich behawioru na dostosowany do warunków symbiozy nast¹pi³a stosunkowo niedawno w porównaniu do czasu ewolucji gatunków bakterii. Uwa a siê, e wystêpuj¹ce obecnie geny nod i nif maj¹ monofiletyczne pochodzenie. Rizobia nale ¹ce do linii ewolucyjnej, w której po raz pierwszy pojawi³ siê zespó³ genów nod-nif otrzyma³y go w wyniku pionowego transferu genów, a rizobia nale ¹ce do linii, które uleg³y dywergencji przed pojawieniem siê zespo³u genów nod-nif jako integralnej ca³oœci, naby³y go w wyniku transferu poziomego. Poniewa proces ten trwa nadal, nale y spodziewaæ siê, e grupa bakterii okreœlanych mianem rizobiów bêdzie wzbogaca³a siê wci¹ o nowe gatunki, powsta³e w sposób naturalny [53, 86, 87] lub sztuczny [68]. 274

15 Przekazywanie plazmidów psym nie jest jedyn¹ drog¹ rozprzestrzeniania siê genów symbiotycznych w populacjach bakteryjnych. Na chromosomach szczepów Mesorhizobium loti spotyka siê regiony DNA o wielkoœci oko³o kb, zawieraj¹ce m.in. geny nod, nif oraz geny odpowiedzialne za syntezê biotyny, kwasu nikotynowego i tiaminy, którego przekazanie do szczepu nieefektywnego w symbiozie powoduje jego zmianê w szczep efektywny. Region ten nazwany zosta³ wysp¹ symbiotyczn¹ (ang. symbiosis island), ze wzglêdu na uderzaj¹ce podobieñstwo do opisanych wczeœniej wysp patogenicznoœci (ang. pathogenicity islands) wystêpuj¹cymi u bakterii chorobotwórczych. Podobnie jak wyspy patogenicznoœci, równie wyspy symbiotyczne charakteryzuje szereg specyficznych cech jak ró na od reszty chromosomu zawartoœæ par G/C, mo liwoœæ przemieszczania siê na drodze rekombinacji wynikaj¹ca z obecnoœci sekwencji IS i genów koduj¹cych bia³ka homologiczne do integraz fagowych oraz przenoszenie zestawu genów powoduj¹cych gwa³town¹ zmianê fenotypu biorcy umo liwiaj¹c¹ kolonizowanie organizmu tkankowego [84, 85]. 10. Bakterie i roœliny ewolucja gatunków i ich wzajemnych oddzia³ywañ Badania filogenezy poszczególnych linii ewolucyjnych zarówno mikro- jak i makrosymbiontów sugeruj¹, e powstanie poszczególnych gatunków rizobiów znacznie wyprzedzi³o ewolucjê gatunków ich roœlinnych gospodarzy. Uwa a siê, e dywergencja pomiêdzy Bradyrhizobium a rizobiami szybkorosn¹cymi (Rhizobium, Sinorhizobium) nast¹pi³a mln lat temu, po czym mln lat temu dosz³o do wyodrêbnienia poszczególnych gatunków rizobiów szybkorosn¹cych. Z drugiej strony rozdzia³ roœlin na jedno- i dwuliœcienne zarysowa³ siê prawdopodobnie mln lat temu, a wyodrêbnienie siê roœlin motylkowatych zasz³o oko³o mln lat temu. Dopiero ten fakt pozwoli³ na szybk¹ ewolucjê regionu genów nod-nif, opart¹ o ich jednoczesne rozprzestrzenianie siê w istniej¹cych gatunkach bakterii i dopasowywanie ich funkcji do postêpuj¹cej ewolucji roœlin motylkowatych [90]. Istniej¹ równie dowody przemawiajace na korzyœæ hipotezy, która zak³ada istnienie znacznie starszych powi¹zañ bakterii przodków rizobiów z eukariontami. Analiza sekwencji wspomnianego ju genu syntetazy glutaminowej wykaza³a, e enzym ten, uwa any za bardzo dobry zegar molekularny pozwalaj¹cy na odtworzenie jego ewolucji do oko³o 2,5 mld lat wstecz, wystêpuje w dwóch ró nych formach: GSI i GSII. Forma GSI spotykana jest w komórkach bakterii, GSII w komórkach eukariontów, a oba typy enzymu razem jedynie w komórkach Rhizobium. Filogeneza GSI rizobiów jest zgodna z filogenez¹ ich 16S rrna. Brak zgodnoœci filogenezy GSII z filogenez¹ 16S rrna pozwala na przypuszczenie, e rizobia otrzyma³y ten gen od eukariontów na drodze poziomego transferu, i mia³o to miejsce oko³o 1,2 mld lat temu. Byæ mo e ju wtedy dochodzi³o do tworzenia zwi¹zków pomiêdzy zdolnymi do redukcji azotu przodkami dzisiejszych rizobiów i prymitywnymi organizmami eukariotycznymi [64, 90], chocia nie by³a to symbioza realizowana w brodawkach korzeniowych. 275

16 11. Œlepe uliczki ewolucji zjawisko niezgodnoœci uniemo liwiaj¹ce nawi¹zanie symbiozy pomiêdzy rizobiami a roœlinami motylkowatymi Symbioza pomiêdzy diazotrofami i roœlinami istnieje dziêki predyspozycji roœlin do reakcji na bakteryjne morfogeny, prowadz¹cej do wytworzenia brodawek, oraz dziêki wykorzystaniu zdolnoœci rizobiów do kolonizacji tkanek roœlinnych i redukcji azotu atmosferycznego. W uk³adach symbiotycznych pomiêdzy rizobiami a roœlinami motylkowatymi zazwyczaj dochodzi do zrealizowania obu tych aktywnoœci. Tym niemniej opisano szereg przyk³adów wskazuj¹cych, e w obrêbie gatunku, pomiêdzy poszczególnymi szczepami bakteryjnymi lub odmianami roœlin istniej¹ drobne, lecz istotne ró nice genetyczne, uniemo liwiaj¹ce nawi¹zanie efektywnej symbiozy. Przyk³adami takiego zjawiska mog¹ byæ: opornoœæ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup (koniczyna œródziemnomorska) na zaka enie przez R. leguminosarum bv. trifolii ANU794 [9]; opornoœæ Trifolium subterraneum cv. Woogenellup na zaka enie przez R. leguminosarum bv. trifolii TA1, prawdopodobnie spowodowana wystêpowaniem pojedynczego genu roœlinnego oraz genu nodm w genomie bakterii [38]; opornoœæ Pisum sativum cv. Afghanistan (groch zwyczajny) posiadaj¹cego unikalny allel sym2a, na zaka enie szczepami pozbawionymi genu nodx [28]; utrata zdolnoœci grochu do efektywnej symbiozy z naturalnym endosymbiontem R. leguminosarum bv. viciae TOM, w przypadku zmiany iloœci produkowanych przez ten szczep specyficznych morfogenów [28]; opornoœæ odmian Vicia faba (bób) posiadaj¹cych allele sym-2 i sym-3 na zaka- enie przez niektóre szczepy takie jak R. leguminosarum bv. viciae St48 czy St53 [16]; istnienie niezgodnoœci uniemo liwiaj¹cej zaka enie izolowanych geograficznie odmian Medicago truncatula okreœlonymi szczepami Sinorhizobium meliloti (brak mo liwoœci wzajemnej wymiany gospodarzy i mikrosymbiontów pochodz¹cych z ró nych siedlisk) [89]; zjawisko fenotypowego zró nicowania populacji Amphicarpaea (gospodarza Bradyrhizobium) i jego mikrosymbionta [96], zale ne od zdolnoœci do produkcji rizobiotoksyny przez Bradyrhizobium i wra liwoœci/opornoœci na rizobiotoksynê w ró nych odmianach i populacjach roœlin [12, 61]. Wymienione przypadki niezgodnoœci dotycz¹ce okreœlonych odmian roœlin i szczepów bakteryjnych kontrastuj¹ z ogóln¹ zgodnoœci¹ obserwowan¹ na poziomie gatunków. Niezgodnoœci te wynikaj¹ z obecnoœci lub braku pojedynczych genów lub ich alleli, a zasiêg zjawiska ogranicza siê do wybranych populacji danego gatunku. Z tego powodu populacje roœlinne ró nicuje siê na niewyspecjalizowane pod wzglêdem symbiotycznym (ang. symbiotic generalists), nawi¹zuj¹ce symbiozê z wiêkszoœci¹ szczepów danego gatunku bakterii, oraz na symbiotycznie wyspecjalizowane (ang. symbiotic specialists), wchodz¹ce w symbiozê jedynie z wybranymi szczepami. Z kolei w przypadku bakterii wyró nia siê o szczepy o szerokim zakresie gospodarza (ang. broad host range), zaka aj¹ce wiêkszoœæ populacji danego gatunku roœlin, ró ne gatunki a nawet rodzaje roœlin. Natomiast mianem szczepów 276

17 o w¹skim zakresie gospodarza (ang. narrow host range), okreœla siê szczepy zaka aj¹ce jedynie niewielk¹ liczbê odmian danego gatunku lub pojedyncze gatunki roœlin. Zjawisko niezgodnoœci obserwowane jest najczêœciej w przypadku zetkniêcia siê bakteryjnego szczepu o w¹skim zakresie gospodarza z symbiotycznie wyspecjalizowan¹ odmian¹ roœlin [96]. 12. Symbiotyczne wi¹zanie azotu perspektywy Zdolnoœæ rizobiów do kolonizacji tkanek roœlinnych i przeprowadzania w nich redukcji azotu atmosferycznego nie ogranicza siê do gatunków rodziny Leguminoseae zdolnych do tworzenia brodawek. Obecnoœæ diazotrofów wi¹ ¹cych azot atmosferyczny stwierdzono równie w tkankach korzeni roœlin motylkowatych niezdolnych do tworzenia brodawek [4]. Ponadto zarejestrowano szereg przypadków kolonizacji przez rizobia korzeni roœlin spoza rodziny Leguminoseae. Stwierdzono: obecnoœæ R. leguminosarum bv. trifolii na powierzchni korzeni pszenicy czy kukurydzy [74]; kolonizacjê korzeni ry u przez R. leguminosarum bv. trifolii [67, 98]; obecnoœæ Rhizobium etli w tkankach kukurydzy [24]; symbiozê pomiêdzy roœlinami ry u a Bradyrhizobium [6]. Efekt kolonizacji uzale niony jest od wspó³dzia³ania danego szczepu bakteryjnego i okreœlonej odmiany roœlin. Decyduj¹c¹ rolê odgrywa fakt d³ugotrwa³ego bytowania roœlin i potencjalnych bakteryjnych endosymbiontów we wspólnym œrodowisku. W przypadku Rhizobium i ry u bakterie mog¹ wystêpowaæ w przestworach miêdzykomórkowych oraz w zlizowanych komórkach gospodarza, co wywo³uje indukcjê reakcji obronnych roœlin, manifestuj¹cych siê jako wytwarzanie pogrubionych œcian celulozowych w komórkach kory korzenia [67]. W przypadku d³ugiego i powtarzanego kontaktu R. leguminosarum bv. trifolii z roœlinami ry u (np. wskutek stosowania p³odozmianu ry koniczyna) mo na doprowadziæ do sytuacji, w której bakterie staj¹ siê endosymbiontami ry u [98]. Podobny mechanizm obserwuje siê w uk³adzie R. etli kukurydza, który wyewoluowa³ w wyniku d³ugotrwa³ego stosowania w bezpoœrednim s¹siedztwie upraw fasoli i kukurydzy [24]. Z kolei zdolnoœæ Bradyrhizobium do symbiozy z wybranymi odmianami ry u pojawi³a siê w wyniku dostosowania bakterii do wspó³ ycia z dzikimi odmianami ry u (Oryza brevilingulata) spotykanymi na tych samych terenach co Aeschynomene (naturalny symbiont fotosyntetyzuj¹cych bradyrizobiów) [19], po czym zdolnoœæ ta zosta³a zaadaptowana do potrzeb uk³adu Bradyrhizobium uprawne odmiany ry u (Oryza glaberriana) [6]. W wiêkszoœci opisywanych przypadków bakterie s¹ endosymbiontami wspomagaj¹cymi wzrost roœlin (ang. PGPR, plant growth promoting rhizobacteria), nie dostarczaj¹cymi gospodarzom zwi¹zków azotu [24, 98]. Jednak w pewnych okolicznoœciach diazotrofy kolonizuj¹ce korzenie roœlin niezdolnych do wytworzenia brodawek s¹ zdolne do redukcji N 2 przeznaczonego na potrzeby roœlin [6, 29, 30]. Obserwowane dynamiczne przystosowywanie siê rizobiów do kolonizacji systemów korzeniowych i nawi¹zywania symbiozy z nowymi gatunkami roœlin jest 277

18 wyraÿnym przyk³adem ukazuj¹cym ci¹g³oœæ procesu ewolucji i powszechnoœæ adaptacji gatunków do zmieniaj¹cych siê warunków œrodowiskowych. Byæ mo e jesteœmy œwiadkami kolejnego rozszerzania zasiêgu uk³adu symbiotycznego z udzia³em roœlin i diazotrofów tym razem o roœliny jednoliœcienne [29, 81]. Jednak na razie musi pozostaæ bez odpowiedzi pytanie o koñcowy (ewolucyjnie stabilny) efekt tych procesów czy dojdzie do wytworzenia struktur analogicznych do brodawek korzeniowych np. u roœlin zbo owych, czy te bêdzie to symbioza realizowana w innych ni brodawki zespo³ach tkanek roœlinnych. Podsumowanie Proces biologicznego wi¹zania azotu pojawi³ siê na Ziemi ponad 2 mld lat temu. Od tego czasu ulega ci¹g³ej ewolucji, podobnie jak wci¹ ewoluuj¹ mikroorganizmy redukuj¹ce azot cz¹steczkowy. Zjawisko to doprowadzi³o do powstania licznych odmian procesu biologicznego wi¹zania azotu. Najstarsz¹ form¹ wi¹zania azotu jest niesymbiotyczna redukcja N 2 wystêpuj¹ca u wolno yj¹cych archebakterii, sinic i bakterii w³aœciwych. Ewolucja l¹dowych roœlin nasiennych i ich powszechna predyspozycja do wchodzenia w symbiozê z mikroorganizmami, szczególnie z grzybami, pozwoli³a na powstanie bardzo wydajnych uk³adów symbiotycznych z udzia³em roœlin i bakterii. Wytworzenie prawid³owo funkcjonuj¹cych uk³adów symbiotycznych wymaga zaanga owania informacji genetycznej pochodz¹cej z trzech odrêbnych, posiadaj¹cych w³asn¹ filogenezê Ÿróde³: genomu roœlinnego, genomu bakteryjnego i regionu nod-nif. Spoœród nich najaktywniej wspó³dzia³aj¹ ze sob¹ (poprzez interakcje fenotypów) genom roœlinny i region nod-nif, natomiast genom bakteryjny odgrywa drugoplanow¹ rolê. Region nod-nif jest bardzo mobilny, a dziêki mo liwoœci poziomego transferu grupa diazotroficznych mikrosymbiontów roœlin wci¹ siê powiêksza. Piœmiennictwo 1. Bergman B., Matveyev A., Rasmussen U.: Chemical signalling in cyanobacterial-plant symbioses. Trends Plant Sci. 1, (1996) 2. Blauenfeldt J., Joshi P.A., Gresshoff P.M., Caetano-Anollés G.: Nodulation of white clover (Trifolium repens) in the absence of Rhizobium. Protoplasma, 179, (1994) 3. Brom S., de los Santos A.G., de Lourdes-Girard, Davilla G., Palacios R., Romero D.: High- -frequency rearrangements in Rhizobium leguminisarum bv. trifolii plasmids. J. Bacteriol. 173, (1991) 4. Bryan J.A., Berlyn G.P., Gordon J.C.: Toward a new concept of the evolution of symbiotic nitrogen fixation in the Leguminoseae. Plant Soil, 18, (1996) 5. Burris R.H., Roberts G.P.: Biological nitrogen fixation. Annu. Rev. Nutr. 13, (1993) 6. Chaintreuil C., Giraud E., Prin Y., Lorquin J., Bâ A., Gillis M., de Lajudie P., Dreyfus B.: Photosynthetic bradyrhizobia are natural endophytes of the African wild rice Oryza breviligulata. Appl. Environ. Microbiol. 6, (2000) 7. Chien Y.T., Auerbuch V., Brabban A.D., Zinder S.H.: Analysis of genes encoding an alternative nitrogenase in the archaeon Methanosarcina barkeri 227. J. Bacteriol. 182, (2000) 278

19 8. Dale C., Plague G.R., Wang B., Ochman H., Moran N.A.: Type III secretion system and the evolution of mutualistic endosymbiosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99, (2002) 9. de Boer M.H., Djordjevic M.A.: The inhibition of infection thread development in the cultivarspecific interaction of Rhizobium and subterranean clover is not caused by a hypersensitive response. Protoplasma, 185, (1995) 10. Doyle J.J.: Phylogenetic perspectives on nodulation: evolving views of plants and symbiotic bacteria. Trends Plant Sci. 3, (1998) 11. Doyle J.J., Doyle J.L., Ballenger J.A., Dickson E.E., Kajita T., Ohashi H.: A phylogeny of the chloroplast gene rbcl in the Leguminoseae: taxonomic correlations and insights into the evolution of nodulation. Am. J. Bot. 84, (1997) 12. Duodu S., Bhuvaneswari T.V., Stokkermans T.J.W., Peters N.K.: A positive role for rhizobiotoxine in Rhizobium-legume symbiosis. Mol. Plant-Microbe Interact. 12, (1999) 13. Eardly B.D., Wang F.S., van Berkum P.: Corresponding 16S rrna gene segments in Rhizobiaceae and Aeromonas yield discordant phylogenies. Plant Soil, 186, (1996) 14. Elbeltagy A., Nishioka K., Sato T., Suzuki H., Ye B., Hamada T., Isawa T., Mitsui H., Minamisawa K.: Endophytic colonization and in planta nitrogen fixation by a Herbaspirillum sp. isolated from wild rice species. Appl. Environ. Microbiol. 67, (2001) 15. Endre G., Kereszt A., Kevei Z., Mihacea S., Kalo P., Kiss B.G.: A receptor kinase gene regulating symbiotic nodule development. Nature, 417, (2002) 16. Esser-Mönning K., Roskothen P., Röbbelen G.: Two host genes in Vicia faba for nodulation defficiency with strain specifity for Rhizobium leguminosarum. Plant Bred. 114, (1995) 17. Estrada-De Los Santos P., Bustillos-Cristales R., Caballero-Mellado J.: Burkholderia, a genus rich in plant associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution. Appl. Environ. Microbiol. 67, (2001) 18. Fanni R., Gallo R., Lio P.: Molecular evolution of nitrogen fixation: the evolutionary history of the nifd, nifk, nife and nifn genes. J. Mol. Evol. 51, 1 11 (2000) 19. Fleischman D., Kramer D.: Photosynthetic rhizobia. Biochim. Biophys. Acta, 1364, (1998) 20. Flores M., Gonzalez V., Pardo M.A., Leija A., Martínez E., Romero D., Piñero D., Dávila G., Palacios R.: Genomic instability in Rhizobium phaseoli. J. Bacteriol. 170, (1988) 21. Foultier B., Troisfontaines P., Muller S., Opperdoes F.R., Cornelis G.R.:Characterization of the ysa pathogenicity locus in the chromosome of Yersinia enterocolitica and phylogeny analysis of type III secretion system. J. Mol. Evol. 55, (2002) 22. Fuentes-Ramirez L.E., Bustillos-Critales R., Tapia-Hernandez A., Jimenez-Salgado T., Wang E.T., Martinez-Romero E., Caballero-Mellado J.: Novel nitrogen-fixing acetic acid bacteria, Glukonacetobacter johannae sp. nov. and Glukonacetobacter azotocaptans sp. nov., associated with coffee plants. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, (2001) 23. Grosjean C., Huguet T.: A persistent meristem is formed in nodular structures elicited by Nod factor or by a Rhizobium meliloti exopolysaccharide mutant in alfalfa plants which nodulate spontaneously. Plant Sci. 127, (1997) 24. Gutirrez-Zamora M.L., Martinez-Romero E.: Natural endophytic association between Rhizobium etli and maize (Zea mays L.). J. Biotechnol. 91, (2001) 25. Heard J., Caspi M., Dunn K.: Evolutionary diversity of symbiotically induced nodule MADS-box genes: characterization of nmhc5, a member of a novel subfamily. Mol. Plant-Microbe Interact. 10, (1997) 26. Heard J., Dunn K.: Symbiotic induction of a MADS-box gene during development of alfalfa root nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, (1995) 27. Hirsch A., Kapulnik Y.: Signal transduction pathways in mycorrhizal associations: comparisons with the Rhizobium-legume symbiosis. Fungal Genet. Biol. 23, (1998) 28. Hogg B., Davies A.E., Wilson K.E., Bisseling T., Downie A.: Competitive nodulation blocking of cv. Afghanistan pea is related to high levels of nodulation factors made by some strains of Rhizobium leguminosarum bv. viciae. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, (2002) 29. Hurek T., Handley L.L., Reinhold-Hurek B., Piche Y.: Azoarcus grass endophytes contributes fixed nitrogen to the plant in an unculturable state. Mol. Plant-Microbe Interact. 15, (2002) 279

20 30. James E.K.: Nitrogen fixation in endophytic and associative symbiosis. Field Crops Research, 65, (2000) 31. Kessler P.S., McLarnan J., Leigh J.A.: Nitrogenase phylogeny and the molybdenum dependence of nitrogen fixation in Methanococcus maripaludis. J. Bacteriol. 179, (1997) 32. Kim J., Rees D.C.: Nitrogenase and biological nitrogen fixation. Biochemistry, 33, (1994) 33. Krug E.C., Winstanley D.: The need for comprehensive and consistent treatment of the nitrogen cycle in nitrogen cycling and mass balance studies: I. Terrestial nitrogen cycle. Sci. Total Environ. 293, 1 29 (2002) 34. Kuhner C.H., Matthies C., Acker G., Schmittroth M., Gossner A.S., Drake H.L.: Clostridium akagii sp. nov. and Clostridium acidisoli sp. nov.: acid-tolerant, N 2 -fixing clostridia isolated from acidic forest soil and litter. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, (2000) 35. Laguerre G., Nour S.M., Macheret V., Sanjuan J., Drouin P., Amarger N.: Classification of rhizobia based on nodc and nifh gene analysis reveals a close phylogenetic relationship among Phaseolus vulgaris symbionts. Microbiology, 147, (2001) 36. Leigh J.A.: Nitrogen fixation in methanogenes: the archaeal perspective. Curr. Issues Mol. Biol. 2, (2000) 37. Levine J.S., Augustsson T.R., Anderson I.C., Hoell J.M. Jr.: Troposferic sources of NO x : lightning and biology. Atmos. Environ. 18, (1984) 38. Lewis-Henderson W.R., Djordjevic M.A.: A cultivar-specific interaction between Rhizobium leguminosarum bv. trifolii and subterranean clover is controlled by nodm, other bacterial cultivar specificity genes, and a single recessive host gene. J. Bacteriol. 173, (1991) 39. Lilburn T.G., Kim K.S., Ostrom N.E., Byzek K.R., Leadbetter J.R., Breznak J.A.: Nitrogen fixation by symbiotic and free-living spirochetes. Science, 292, (2001) 40. Loveless T.M., Bishop P.E.: Identification of genes unique to Mo-independent nitrogenase systems in diverse diazotrophs. Can. J. Microbiol. 45, (1999) 41. Loveless T.M., Saah J.R., Bishop P.E.: Isolation of nitrogen-fixing bacteria containing molybdenum-independent nitrogenases from natural environments. Appl. Environ. Microbiol. 65, (1999) 42. Magalhaes Cruz L., de Souza E.M., Weber O.B., Baldani J.I., Dobereiner J., Pedrosa Fde O.: 16S ribosomal DNA characterization of nitrogen-fixing bacteria isolated from banana (Musa spp.) and pineapple (Ananas comosus (L.) Merril). Appl. Environ. Microbiol. 67, (2001) 43. Mancinelli R.L.: The nature of nitrogen: an overview. Life Support Biosph. Sci. 3, (1996) 44. Mancinelli R.L., McKay C.P.: The evolution of nitrogen cycling. Orig. Life Evol. Biosph. 18, (1988) 45. Mandermack K.W., Kinney C.A., Coleman D., Huang Y.S., Freeman K.H., Bogner J.: The biogeochemical controls of N 2 O production and emission in landfill cover soils: the role of methanotrophs in the nitrogen cycle. Environ. Microbiol. 2, (2000) 46. Maynard Smith J., Smith N.H., O Rourke M., Spratt B.G.: How clonal are bacteria? Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, (1993) 47. McIver J., Djordjevic M.A., Weinman J.J., Rolfe B.G.: Influence of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii host specific nodulation genes on the ontogeny of clover nodulation. Protoplasma, 172, (1993) 48. Mercado-Blanco J., Toro N.: Plasmids in rizobia: the role of nonsymbiotic plasmids. Mol. Plant- Microbe Interact. 9, (1996) 49. Mergaert P., van Montagu M., Holsters M.: Molecular mechanisms for Nod factor diversity. Mol. Microbiol. 25, (1997) 50. Merrick M.J.: Nitrogen control of the nif regulon in Klebsiella pneumoniae: involvement of the ntra gene and analogies between ntrc and nifa. EMBO J. 2, (1983) 51. Minerdi D., Fani R., Gallo R., Boarino A., Bonfante P.: Nitrogen fixation genes in endosymbiotic Burkholderia strain. Appl. Environ. Microbiol. 67, (2001) 52. Monserrate E., Leschine S.B., Canale-Parola E.: Clostridium hungatei sp. nov., a mesophilic, N 2 -fixing cellulolytic bacterium isolated from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, (2001) 280