Antyangiogenna terapia genowa próby wykorzystania rozpuszczalnej formy receptora FLT 1

Transkrypt

1 PRACE ORYGINALNE Adv Clin Exp Med 2004, 13, 2, ISSN X MACIEJ MAŁECKI 1, ZENON JASTRZĘBSKI 2, MAŁGORZATA PRZYBYSZEWSKA 1, ROBERT PROCZKA 3, PRZEMYSŁAW JANIK 1 Antyangiogenna terapia genowa próby wykorzystania rozpuszczalnej formy receptora FLT 1 Antiangiogenic Gene Therapy Applications of Soluble FLT 1 Receptor 1 Zakład Biologii Komórki, Centrum Onkologii Instytut w Warszawie 2 Zakład Farmakologii Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego w Warszawie 3 II Katedra i Klinika Chirurgii AM w Warszawie Streszczenie Wprowadzenie. Antyangiogenna terapia genowa jest jedną ze strategii terapii genowej nowotworów. Blokowanie powstawania nowych naczyń krwionośnych lub/i niszczenie już istniejących ogranicza wzrost nowotworów i po wstawanie wtórnych ognisk nowotworzenia przerzutów. Rozpuszczalna forma receptora FLT 1 (sflt) jest endo gennym inhibitorem angiogenezy, ma ona silne własności antyangiogenne, głównie skierowane przeciw naczynio wo śródbłonkowemu czynnikowi wzrostu (VEGF). Cel pracy. Celem niniejszej pracy było sklonowanie wektora ekspresyjnego kodującego rozpuszczalną formę re ceptora FLT 1 (inhibitora angiogenezy) oraz przeprowadzenie oceny wpływu sflt 1 na proces angiogenezy i roz wój nowotworów litych i wysiękowych u zwierząt. Materiał i metody. Klonowanie wektora psflt 1 przeprowadzono na podstawie sekwencji cdna z komórek li nii HUVEC. Wykorzystano swoiste startery dla sflt 1. Klonowano do pustego, ekspresyjnego wektora psec. Konstrukt psflt namnażano w bakteriach E. coli i testowano w warunkach in vitro i in vivo. Stosowano test skór nej angiogenezy oraz oceniano wpływ sflt 1 na rozwój nowotworów u myszy. Wyniki. W wyniku klonowania uzyskano wektor ekspresyjny psflt 1, w badaniach wykorzystywano preparat apirogenny. Badania in vitro wykazały, iż komórki mysiego mięsaka L1 transfekowane wektorem psflt 1 ekspry mują sflt 1 i wydzielają białko sflt 1 poza komórkę. Test skórnej angiogenezy ujawnił, iż psflt 1 skutecznie znosi proangiogenną aktywność pvegf165. Badania na zwierzętach laboratoryjnych z indukowanym nowotwo rem wysiękowym L1 wykazały, iż sflt 1 zmniejsza ilość wysięku i przedłuża o 30% czas życia zwierząt, a poda nie wektora bezpośrednio do guzów litych L1 znacznie ogranicza tempo jego wzrostu. Wnioski. Przeprowadzone badania wskazują, iż sflt 1 skutecznie hamuje angiogenezę, co może być wykorzysta ne w badaniach in vivo. Antyangiogenna terapia genowa wykorzystująca endogenny inhibitor angiogenezy (sflt 1) ogranicza wzrost nowotworów wysiękowych i litych u zwierząt i może być rozpatrzona jako metoda pomocna w leczeniu nowotworów w warunkach klinicznych (Adv Clin Exp Med 2004, 13, 2, ). Słowa kluczowe: angiogeneza, terapia genowa, nowotwory. Abstract Background. Angiogenesis plays a fundamental role in many physiological and pathological processes, including embriogenesis and cancer, respectively. Inhibition of angiogenesis is a promising cancer gene therapy strategy. sflt 1 is an alternatively spliced soluble form of FLT 1 receptor that specifically inhibits the mitogenic properties of vascular endothelial growth factor (VEGF). Objectives. The main aim of this study was the construction of the expression vector encoding soluble FLT 1 re ceptor and its studies in vitro and in vivo conditions. Material and Methods. The psflt 1 vector was cloned using a cdna from HUVEC cell line and specific pri mers for sflt 1. The construct was then amplified in E. coli and tested in vitro and in vivo conditions. In vivo angio genesis assay, firstly described by Sidky and Auerbach, was used for angiogenesis study. The largest part of this work is represented by experiments performed on cancer in normal animals.

2 228 M. MAŁECKI et al. Results. We successfully cloned the psflt 1 expression vector. The L1/psFLT 1 transfectants effectively expres sed the sflt 1 and secreted the sflt 1 protein to the culture medium. In vivo angiogenesis assay revealed an in hibition of new vessels formation in animals injected with vectors encoding VEGF and sflt 1 as its inhibitor. The psflt 1 transfected L1 cells were also implanted into peritoneal cavity of mice. We observed a decreased perito neal fluid accumulation. The survival time of the animals was extended to 30% in comparison with control group that received normal L1 cells. The naked psflt 1 vector was also injected into solid L1 tumours and the suppres sion of tumour growth was observed. Conclusions. In this study we have shown that antiangiogeneic gene therapy using the soluble FLT 1 receptor may effectively inhibit angiogenesis and tumour growth. We would like to postulate that psflt 1 expression vector may be a helpful tool for cancer treatment in the clinic (Adv Clin Exp Med 2004, 13, 2, ). Key words: angiogenesis, gene therapy, cancer. Obiecującą strategią terapii genowej nowo tworów jest antyangiogeneza. Opiera się na zało żeniu, iż powstawanie sieci naczyń krwionośnych w masie nowotworu jest czynnikiem bezpośrednio determinującym jego rozwój i warunkującym jed nocześnie tworzenie przerzutów nowotworowych [1 3]. Kilka strategii antyangiogennych jest w trakcie badań eksperymentalnych. Zaliczyć tu można, np. próby wykorzystania proteolitycznych fragmentów białek budulcowych (arestyny, angio statyny, endostatyny), przeciwciał monoklonal nych skierowanych przeciw angiogennym czynni kom wzrostu lub rozpuszczalnych fragmentów re ceptorów dla tychże czynników (VEGF) [4]. Do tej pory poznano ponad 40 endogennych inhibito rów angiogenezy, których mechanizm powstawa nia i działania jest różny [1]. Hamują proliferację, migrację komórek śródbłonkowych dzięki czemu ograniczają wzrost nowotworów i powstawanie przerzutów [1, 3]. W wielu badaniach wykorzystu je się czynniki, które bezpośrednio oddziałują z cytokinami proangiogennymi (VEGF, FGF, an giopoetyną 1, Del 1); najczęściej prace dotyczą prób ograniczenia funkcji VEGF [5, 6]. Podejmo wane strategie obejmują wykorzystanie przeciw ciał anty VEGF, blokowanie receptorów dla VEGF, hamowanie syntezy VEGF przez sekwen cje antysensowne oraz wykorzystanie rozpu szczalnych form receptorów dla VEGF [1]. sflt 1 jest przykładem rozpuszczalnej formy receptora VEGFR 1 (FLT 1) dla VEGF, który powstaje w wyniku składania premrna genu FLT 1. Trans krypt sflt 1 koduje 6 z 7 N końcowych, immu noglobulinopodobnych domen charakterystycz nych dla części zewnątrzkomórkowej receptorów VEGF. W mrna sflt 1 brak jest natomiast frag mentu międzybłonowego oraz domeny wewnątrz komórkowej o aktywności kinazy tyrozynowej [7, 8]. Wskazuje się, iż rozpuszczalna forma FLT 1 przez wiązanie naczyniowo śródbłonkowego czyn nika wzrostu (VEGF) i blokowanie natywnych re ceptorów dla VEGF hamuje powstawanie nowych naczyń krwionośnych, ogranicza wzrost masy no wotworów litych i powstawanie przerzutów [7, 9 11]. Potencjalnie sflt 1 może być również wy korzystany w wielu innych stanach chorobowych determinowanych przez angiogenezę, np. w zapo bieganiu wystąpienia ślepoty pojawiającej się jako powikłanie retinopatii cukrzycowej [12 14]. Głównym celem pracy było skonstruowanie wektora ekspresyjnego kodującego rozpuszczalną formę FLT 1 oraz ocena wpływu sflt 1 na proces angiogenezy i rozwój nowotworów litych i wysię kowych u zwierząt. W klonowaniu wykorzystano sekwencję sygnałową mysiej Igκ, zapewniającą wydajną sekrecję powstałego białka poza komór kę. Sklonowany wektor psflt 1 badano w warun kach in vitro i in vivo oraz oceniano wpływ nade kspresji sflt 1 na powstawanie nowych naczyń krwionośnych i rozwój nowotworów u myszy. Materiał i metody Klonowanie wektora psflt 1 Sekwencję kodującą sflt 1 amplifikowano metodą PCR opierając się na cdna z komórek li nii HUVEC (human umbilical endothelial cells). Startery zaprojektowano z miejscami restrykcyjny mi dla EcoRI i XhoI: HFLT 1: 5' ATGAATTCA ATGGTCAGCTACTGGGA3',ExH FLT:5'ATCTCGAGTCATCTGATTGTA ATTTCTT 3'. Reakcję PCR prowadzono w nastę pujących warunkach: wstępna denaturacja 95 C 3 min, 35 cykli: 95 C 50 s, 50,1 C 50 s, 72 C 60 s, końcowa elongacja 72 C 10 min. Produkt PCR oczyszczano zestawem clean up (QIAGEN), trawiono EcoRI i XhoI przez 1 h w temperaturze 37 C i izolowano z żelu agarozo wego zestawem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN). Pusty wektor psec również trawiono EcoRI i XhoI, rozdzielano elektroforetycznie i izo lowano z żelu. Przygotowane substraty ligowano przez 16 h w temperaturze 16 C wykorzystując ak tywność ligazy T4 (Amersham). Bakterie E. coli transformowano otrzymanymi ligantami, a następ nie przeprowadzono selekcję klonów na płytkach

3 Antyangiogenna terapia genowa nowotworów 229 agarowych z ampicyliną. Wyrosłe klony pasażo wano do płynnej pożywki LB z ampicyliną. Hodo wano przez noc w temperaturze 37 C. Z klonów izolowano plazmidy (QIAprep Spin Miniprep, QIAGEN), które poddano dalszej analizie. Wyko nano analizę restrykcyjną i sekwencjonowanie. Badanie czystości farmakopealnej preparatu psflt 1 Ocenę zawartości endotoksyn w preparatach plazmidu psflt 1 przygotowanego na dużą skalę (EndoFree Plasmid Giga Kit, QIAGEN, Germany) wykonano głównie z myślą wykorzystania wekto ra w warunkach klinicznych. Postępowano zgo dnie z wymogami farmakopealnymi (Ph.Eur. IV, FPVI). Analizy przeprowadzono z wykorzysta niem testu LAL oraz na zwierzętach laboratoryj nych. Szczegółowy opis procedur jest zawarty we wcześniejszej pracy poświęconej w całości temu zagadnieniu [15]. Badania in vitro Hodowla komórkowa Badania przeprowadzono na komórkach my siego mięsaka (linia L1). Sklonowany wektor psflt 1 wprowadzano do komórek metodą trans fekcji lipidowej zgodnie z zaleceniami producenta (Life Technologies). Komórki hodowano w stan dardowych warunkach. Klony L1/psFLT 1 oporne na pochodną bleomycyny Zeocin wykorzystano w dalszych badaniach (oporność na Zeocin jest warunkowana przez produkt genu Sh ble w wekto rze psec). Metodą Western blotting określano za wartość białka sflt 1 w płynie hodowlanym znad komórek nietransfekowanych (L1) oraz transfeko wanych (L1/psFLT 1). Western blotting Medium znad komórek L1 oraz L1/psFLT 1 zagęszczano 20 razy (Amicon, Centricon). Stęże nie białka w zagęszczonym medium oznaczono metodą Bredforda (Biorad). Wykonano rozdział elektroforetyczny na 10% żelu poliakrylamido wym i dalej elektrotransfer na błonę nitrocelulozo wą. Do studzienek nanoszono po 58 µg białka cał kowitego. Do immunodetekcji wykorzystano przeciwciała I rzędowe anty VEGFR 1, (Sigma) i II rzędowe (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Wi zualizację białek wykonano metodą chemilumine scencji, zgodnie z zaleceniami producenta (Life Technologies). Badania in vivo Test skórnej angiogenezy Do badań wykorzystano 6 8 tygodniowe my szy Balb/c (samce). Zwierzęta usypiano 3,6% roz tworem wodzianu chloralu i golono po obu bo kach. Następnie wykonano śródskórne iniekcje wektora psflt 1 (10 µg DNA/0,1 ml 0,9% NaCl). Do iniekcji kontrolnych wykorzystano pusty we ktor psec oraz 0,9% roztwór NaCl. W celu uła twienia wizualizacji miejsca wstrzyknięcia prepa raty podbarwiano 0,1% roztworem błękitu trypa nu. Po 72 godzinach zwierzęta uśpiono prepara tem Morbital, a miejsca wstrzyknięcia analizowa no pod lupą (32 ) liczono nowe naczynia zgo dnie z kryteriami zaproponowanymi przez Sid ky'ego i Auerbacha [16]. Iniekcja dootrzewnowa komórek nowotworowych W badaniach wykorzystano 6 8 tygodniowe myszy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6% roztworem wodzainu chloralu, a następnie wyko nano dootrzewnową iniekcję komórek nowotwo rowych linii L1 i transfektantów L1/psFLT 1, L1/pVEGF165 [17] zawieszonych w 0,9% roz tworze NaCl w ilości na mysz. Wielkość powstającego wysięku określano średnio co 3 dni przez pomiar masy ciała zwierząt. Sporządzono krzywą przeżyć zwierząt. Iniekcja podskórna komórek nowotworowych Do badań wykorzystano 6 8 tygodniowe my szy Balb/c obu płci. Zwierzęta usypiano 3,6% roz tworem wodzianu chloralu, a następnie wykonano podskórną iniekcję /mysz komórek nowo tworowych linii L1 (mysi mięsak) zawieszonych w 0,9% roztworze NaCl. Po osiągnięciu przez guz średnicy 1 3 mm, część zwierząt otrzymywała do guzowo preparat psflt 1 dwa razy w tygodniu (20 µg DNA/0,1 ml 0,9% NaCl). Wpływ sflt 1 na wzrost masy nowotworu oceniano średnio co 3 dni; pomiar wielkości guza wykonywano za po mocą suwmiarki. Wyniki Klonowanie W wyniku klonowania otrzymano wektor eks presyjny kodujący rozpuszczalną formę receptora FLT 1. Analiza restrykcyjna i sekwencjonowanie

4 230 M. MAŁECKI et al. potwierdziły występowanie cdna dla sflt 1 w wektorze psec (ryc. 1). Otrzymano wektor z kasetą ekspresyjną: 5' CMV ATG Igκ sflt 1 TGA poly 3'. Preparat namnażano w bakteriach E. coli i izolowano na dużą skalę zestawem Endo Free. Badania czystości farmakopealnej (Ph.Eur. IV, FP VI) wykazały apirogenność preparatu psflt 1. Stężenie endotoksyn bakteryjnych ozna czane testem LAL nie przekraczało wartości gra nicznej to jest 55,5 EU/mg, a suma przyrostów ciepłoty ciała zwierząt była < 1,2 C [15]. Białko sflt 1 Występowanie białka sflt 1 w medium znad komórek L1 nietransfekowanych i transfekowa nych wektorem psflt 1 stwierdzono metodą We stern blotting. Jak przedstawiono na rycinie 2, w przeciwieństwie do komórek nietransfekowa Ryc. 1. Analiza restrykcyjna wektora psflt 1. Wektor trawiono restryktazami EcoRI (E), XhoI (X) i KpnI (K). Obecność cdna dla sflt 1 potwierdzono wyko nując również reakcję PCR (ścieżka nr 8). 1 psec, 2 psec/e/x, 3 psec/k/x; 4 psflt 1, 5 psflt 1/E/X, 6 psflt 1/K/X; 7 psec (PCR), 8 psflt 1 (PCR); M marker ( fag λ/hindiii) Fig. 1. Restriction digestion mapping of psflt 1 vec tor. The vector was digested with EcoRI (E), XhoI (X) and KpnI (K). Line 8 represent the result of PCR am plification of sflt 1. 1 psec, 2 psec/e/x, 3 psec/k/x; 4 psflt 1, 5 psflt 1/E/X, 6 psflt 1/K/X; 7 psec (PCR), 8 psflt 1 (PCR); M DNA le ader (fag λ/hindiii) Ryc. 2. Występowanie białka sflt 1 w medium znad komórek L1 niestransfekowanych (1) i stransfekowa nych wektorem psflt 1 (2). (3) lizat z komórek OVP 10 kontrola pozytywna. sflt 110 kda Fig. 2. Western blot analyses of the sflt 1 protein se creted to the medium of non transfected L1 cells (1) and psflt 1 transfected l1 cells (2). (3) OVP 10 cells lysate as a positive control. SFLT kda nych genem sflt 1 (L1) komórki transfekowane (L1/psFLT 1) wydzielają do medium hodowlane go białko sflt 1 (110 kda). Białkowy lizat z ko mórek OVP 10 wykorzystano jako pozytywną kontrolę aktywności przeciwciał anty FLT 1 [18]. Test skórnej angiogenezy Test skórnej angiogenezy wykazał, iż sflt 1 skutecznie hamuje angiogenezę. Jak widać w tab. 1, łączona iniekcja wektorów kodujących VEGF165 [17] i sflt 1 powoduje, iż sflt 1 efek tywnie znosi proangioegnną aktywność VEGF165. Wpływ sflt 1 na wzrost guzów L1 Część badań in vivo wykonano na myszach, którym podskórnie wstrzyknięto komórki L1. Drugą grupę stanowiły zwierzęta, którym wstrzyknięto dootrzewnowo komórki L1 bądź ich psflt 1 transfektanty. W pierwszym przypadku, po osiągnięciu przez guz wielkości około 1 3 mm 3, dwa razy w tygodniu podawano doguzowo wektor psflt 1. Na rycinie 3 widać, że bezpośrednie po danie do tkanki nowotworu psflt 1 ogranicza wzrost guzów. Terapeutyczny efekt nadekspresji sflt 1 jest bardziej widoczny w doświadczeniach na zwierzętach z nowotworem wysiękowym (ryc. 4a b). Wydzielane dootrzewnowo, przez trans fekowane plazmidem psflt 1 komórki L1 (L1/psFLT 1), białko sflt 1 wyraźnie ogranicza powstawanie wysięku. i wydłuża czas życia zwie rząt, w porównaniu z grupą kontrolną. Mediany dla zwierząt z L1/psFLT 1, L1 i L1/pVEGF wyno szą odpowiednio 29, 19,5 i 15,5. Omówienie Naczyniowo śródbłonkowy czynnik wzrostu (VEGF) jest jedną z lepiej poznanych cytokin pro angiogennych. Jest silnym stymulatorem prolife racji i migracji komórek śródbłonkowych, zwięk sza przepuszczalność naczyń, indukuje proces an giogenezy w warunkach in vivo [5]. Sygnał angio genny VEGF jest przenoszony do komórek głów nie przez receptory Flt (VEGFR1 fms like tyro sine kinase) oraz Flk/KDR (VEGFR2 fetal liver kinase/kinase insert domain) [5]. Sklonowana przez Kendala i Thomasa [7] rozpuszczalna forma receptora FLT 1 (sflt 1) bezpośrednio blokuje własności mitogenne VEGF. sflt 1 jest produk tem procesu alternatywnego składania genu FLT 1 i zawiera tylko część zewnątrzkomórkową recep tora FLT 1, a mianowicie tylko 6 immunoglobuli nopodobnych domen. Fragment ten, jak wykazują prace eksperymentalne, skutecznie łączy się

5 Antyangiogenna terapia genowa nowotworów 231 Ryc. 3. Wpływ sflt 1 na wzrost guzów litych L1. Wektor psflt 1 podawano w postaci nagiego DNA bezpośrednio do guzów L1 Fig. 3. Influence of psflt 1 tumour growth. The psflt 1 vector was injected into L1 tumour as a na ked DNA z VEGF, blokując tym samym jego własności mi togenne w stosunku do komórek śródbłonkowych [7, 9]. Uważa się również, iż sflt 1 może upośle dzać sygnał angiogenny dodatkowo przez tworze nie z natywnymi receptorami komórkowymi FLT lub FLK nieaktywnych homo lub heterodimerów [7, 10]. Jak już wspomniano, mrna dla genu sflt 1 powstaje w wyniku procesu alternatywnego skła dania pre mrna dla FLT 1. W niniejszej pracy do klonowania sflt 1 wykorzystano cdna z ko mórek HUVEC, które eksprymują zarówno pełną, jak i rozpuszczalną formę receptora FLT 1 [7]. Jak pokazano na rycinie 1, w wyniku klonowania uzy skano wektor ekspresyjny (psflt 1) kodujący re ceptor sflt 1. Namnożony i oczyszczony do wy magań farmakopealnych konstrukt psflt 1 bada no w warunkach hodowli komórkowej oraz na zwierzętach laboratoryjnych. Badania in vitro wy kazały, iż w komórkach linii L1 transfekowanych wektorem psflt 1 dochodzi do ekspresji transge a Ryc. 4. a krzywa przeżycia zwierząt po dootrzewnowym podaniu komórek L1 nietransfekowanych i transfekowanych wektorem psflt 1. Widoczny jest także wpływ nade kspresji VEGF165 (transfektanty L1/pVEGF) na czas przeżycia zwierząt; b zwierzęta po 20 dniach od i.p. wprowa dzenia komórek L1 i L1/psFLT 1 Fig. 4. a growth of i.p. injected L1 and L1/psFLT 1 tumours. The effect of VEGF165 on animals survival is also presented; b a picture of animals i.p. injected with L1 and L1/psFLT 1 cells b Tabela 1. Liczba nowych naczyń krwionośnych po śródskórnej iniekcji wektorów wpływających na procesy angiogenezy. Nowe naczynia liczono po 3 dniach od podania preparatów. Wektor psec oraz 0,9% roztwór NaCl wykorzystano jako kon trole negatywne Table 1. The number of new blood vessels found in animals injected intradermally with angiogenic vectors. The new ves sels were counted after three days. psec vector and saline solution were injected as negative controls 0,9% NaCl Wektory (Vectors) psec psflt 1 pvegf165 pvegf165 + psflt 1 4,5 ± 1,8 8,90 ± 2,91 9,33 ± 3,40 19,24 ± 4,97 10,27 ± 2,71 n = 18 n = 15 n = 15 n = 33 n = 33

6 232 M. MAŁECKI et al. nu sflt 1 i sekrecji białka sflt 1 do medium ho dowlanego. Jak pokazuje rycina 2 komórki nie transfekowane psflt 1 nie wydzielają sflt 1. Aktywność biologiczną sflt 1 potwierdzono również w teście migracji medium znad ko mórek L1/psFLT 1 hamowało migrację komórek L1 transfekowanych pvegf165 (Małecki et al., praca w przygotowaniu). W badaniach in vivo receptora sflt 1 stoso wano test skórnej angiogenezy Sidky'ego i Auer bacha [16]. W eksperymentach wykorzystano również sklonowany wcześniej wektor kodujący VEGF165. Jak wówczas wykazano [17], wektor pvegf śródskórnie wprowadzany do myszy in dukuje powstanie nowych naczyń krwionośnych. Efekt jest już widoczny po 3 dniach od iniekcji. W niniejszej pracy próbowano ograniczyć angio genezę indukowaną przez VEGF. W eksperymen tach zastosowano jednoczesną iniekcję genów VEGF i sflt 1. W tabeli 1 przedstawiono, iż kombinacja wektorów pvegf i psflt 1 skutecz nie ogranicza powstanie nowych naczyń krwiono śnych; produkt genu sflt 1 efektywnie blokuje aktywność angiogenną VEGF. Badania in vivo prowadzono także na myszach, którym wszczepia no dootrzewnowo bądź podskórnie komórki my siego mięsaka L1. Na rycinie 4a przedstawiono, że czas przeżycia zwierząt po dootrzewnowym poda niu L1/psFLT 1 jest 30% dłuższy niż grupy kon trolnej L1 i grupy, która otrzymała komórki L1 z nadekspresją VEGF165 (L1/pVEGF165). Me diany dla myszy z L1/psFLT 1, L1 i L1/pVEGF wynoszą odpowiednio 29,0, 19,5 i 15,5. Na ryci nie 4b przedstawiono myszy L1 oraz L1/psFLT 1. Otrzymane wyniki są zgodne z pracami innych ba daczy [9, 19 23]. Wydłużenie czasu życia i nie zauważalna ilość wysięku u zwierząt z nadekspre sją sflt 1 w porównaniu z grupą zwierząt L1 i L1/pVEGF wskazują, iż obecny w płynie wysię kowym VEGF jest skutecznie blokowany przez antyangiogenne białko sflt 1. Hasumi et al. [20] wykazali, iż sflt 1 hamuje rozrost raka jajnika i tworzenie wysięku. Badacze wykorzystali ko mórki raka jajnika transfekowane wcześniej ge nem sflt 1, wykazali, że np. objętość wysięku, liczba komórek nowotworowych były zdecydowa nie niższe w tej grupie niż w kontrolnej. W pracy Yanga et al. [23] stwierdzono natomiast, iż fibro blasty z nadekspresją sflt 1 mogą efektywnie ha mować wznowienie procesów nowotworowych. Hoshida et al. [24] oraz Takayama et al. [25] do wodzą, iż sflt 1 może również hamować rozwój guzów litych. Nasze badania wskazują (ryc. 3), iż sflt 1 znacznie ogranicza tempo wzrostu guzów L1. Jak można przypuszczać, efekt terapeutyczny psflt 1 po podaniu doguzowym, jest najprawdo podobniej związany z powszechnie opisywanymi trudnościami transferu genów i uzyskaniem ich wysokiej i długiej ekspresji w tkance docelowej. Nierzadko wskazuje się, iż wydajność transfekcji komórek zależy od stężenia endotoksyn w prepa racie genowym [15, 26]. Zawartość substancji go rączkotwórczych w dużej mierze zależy od meto dy izolacji plazmidów [15]. W niniejszej pracy otrzymany wektor psflt 1 izolowano sprawdzoną wcześniej procedurą EndoFree, a stężenie endoto ksyn oznaczano metodą LAL i na zwierzętach la boratoryjnych (króliki) [15]. Analizy wykazały, iż preparat psflt 1 jest apirogenny. Klonowanie wektora ekspresyjnego psflt 1 kodującego rozpuszczalną formę receptora FLT 1, jego badania in vitro i in vivo oraz analizę czysto ści farmakopealnej preparatu wykonano głównie z myślą o możliwości zastosowania strategii anty angiogennej w klinice. Najprawdopodobniej wio sną 2004 r. rozpoczną się pierwsze badania klinicz ne wykorzystujące wektor psflt 1 w leczeniu ra ka sromu i jajnika (w Klinice Nowotworów Narzą dów Płciowych Kobiecych, COI w Warszawie). Piśmiennictwo [1] Feldman AL, Libutti SK: Progress in antiangiogenic gene therapy of cancer. Cancer 2000, 89, [2] Wilczyńska U, Szary J, Szala S: Antyangiogenna terapia genowa. Współczesna Onkologia 1999, 4, [3] Szala S, Szary J, Cichoń T, Sochanik A: Antiangiogenic gene therapy in inhibition of metastasis. Acta Biochim Pol 2002, 49, [4] Zhang H T, Harris AL: Anti angiogenic therapies in cancer clinical trials. Exp Opin Invest Drugs 1998, 7, [5] Ferrara N, Gerber H P, LeCouter J: The biology of VEGF and its receptors. Nat Genet 2003, 9, [6] Scappaticci FA: Mechanisms and future directions for angiogenesis based cancer therapies. J Clinic Oncol 2002, 20, [7] Kendall RL, Thomas KA: Inhibition of vascular endothelial cell growth factor activity by an endogenously en coded soluble receptor. Proc Natl Acad Sci USA 1993, 90, [8] Hornig CH, Weich HA: Soluble VEGF receptors. Angiogenesis 1999, 3, [9] Hornig CH, Barleon B, Ahmad S, Vuorela P, Ahmed A, Weich HA: Release and complex formation of solu ble VEGFR 1 from endothelial cells and biological fluids. Lab Invest 2000, 80,

7 Antyangiogenna terapia genowa nowotworów 233 [10] Roeckl W, Hecht D, Sztajer H, Waltenberger J, Yayon A, Weich HA: Differential binding characteristics and cellular inhibition by soluble VEGF receptors 1 and 2. Exp Cell Res 1998, 241, [11] Goldman CK, Kendall RL, Cabrera G, Soroceanu L, Heike Y, Gillespie GY, Siegal GP, Mao X, Bett AJ, Huckle WR, Thomas KA, Curiel DT: Paracrine expression of a native soluble vascular endothelial growth fac tor receptor inhibits tumor growth, metastasis, and mortality rate. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95, [12] Bainbridge JW, Mistry A, de Alwis M, Paleolog E, Baker A, Thrasher AJ, Ali RR: Inhibition of retinal neo vascularization by gene transfer of soluble VEGF receptor sflt 1. Gene Ther 2002, 9, [13] Gehlbach P, Demetriades AM, Yamamoto S, Deering T, Xiao WH, Duh EJ, Yang HS, Lai H, Kovesdi I, Car rion M, Wei L, Campochiaro PA: Periocular gene transfer of sflt 1 suppresses ocular neovascularization and vascular endothelial growth factor induced breakdown of the blood retinal barier. Hum Gene Ther 2003, 14, [14] Lai YK, Shen WY, Brankov M, Lai CM, Constable IJ, Rakoczy PE: Potential long term inhibition of ocular neovascularisation by recombinant adeno associated virus mediated secretion gene therapy. Gene Ther 2002, 9, [15] Jastrzębski Z, Małecki M, Janik P: Badanie stopnia oczyszczenia z endotoksyn bakteryjnych preparatów pla zmidowych przygotowanych dla potrzeb angiogennej terapii genowej. Farmacja Polska 2003, 59, [16] Sidky YA, Auerbach R: Lymphocyte induced angiogenesis: a quantitative and sensitive assay of the graft vs host reaction. J Exp Med 1975, 141, [17] Małecki M, Przybyszewska M, Janik P: In vitro and in vivo study of the expression vector encoding vascular endothelial growth factor. Arch Immun Ther Exp 2001, 49, [18] Szary J, Kalita K, Przybyszewska M, Dus D, Kieda C, Janik P, Szala S: KDR promoter can transcriptionally target cytosine deaminase suicide gene to cancer cells of nonendothelial origin. Anticancer Res 2001, 21, [19] Mahasreshti PJ, Navarro JG, Kataram M, Wang MH, Carey D, Siegal GP, Barnes MN, Nettelbeck DM, Alvarez RD, Hemminki A, Curiel DT: Adenovirus mediated soluble FLT 1 gene therapy for ovarian carcinoma. Clin Cancer Res 2001, 7, [20] Hasumi Y, Mizukami H, Urabe M, Kohno T, Takeuchi K, Kume A, Momoeda M, Yoshikawa H, Tsuruo T, Shibuya M, Taketani Y, Ozawa K: Soluble FLT 1 expression suppresses carcinomatous ascites in nude mice be aring ovarian cancer. Cancer Res 2002, 62, [21] Boocock CA, Charnock Jones DS, Sharkey AM, McLaren J, Barker PJ, Wright KA, Twentyman PR, Smith SK: Expression of vascular endothelial growth factor and its receptors flt and KDR in ovarian carcinoma. J Nat Cancer Instit 1995, 87, [22] Mori A, Arii S, Furutani M, Mizumoto M, Uchida S, Furuyama H, Kondo Y, Gorriu Rivas MJ, Furumoto K, Kaneda Y, Imamura M: Soluble Flt 1 gene therapy for peritoteal metastases using HVJ cationic liposomes. Gene Ther. 2000, 7, [23] Yang W, Arii S, Mori A, Furumoto K, Nakao T, Isobe N, Murata T, Onodera H, Imamura M: sflt 1 gene transfected fibroblsts: a wound specific gene therapy inhibits local cancer recurrence. Cancer Res 2001, 61, [24] Hoshida T, Sunamura M, Duda DG, Egawa S, Miyazaki S, Shineha R, Hamada H, Ohtani H, Satomi S, Matsuno S: Gene therapy for pancreatic cancer using an adenovirus vector encoding soluble flt 1 vascular endo thelial growth factor receptor. Pancreas 2002, 25, [25] Takayama K, Ueno H, Nakanishi Y, Sakamato T, Inoue K, Shimizu K, Oohashi H, Hara N: Suppression of tumor angiogenesis and growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelial growth factor receptor into a remote organ. Cancer Res 2000, 60, [26] Budryk M, Cichoń T, Szala S: Direct in vivo transfer of plasmid DNA into murine tumors: Effects of endotoxin presence and transgene localization. Acta Biochim Pol 2001, 48, Adres do korespondencji: Maciej Małecki Zakład Biologii Komórki Centrum Onkologii Instytut ul. Roentgena Warszawa mahan@poczta.wp.pl Praca wpłynęła do Redakcji: r. Po recenzji: r. Zaakceptowano do druku: r. Received: Revised: Accepted: