Podstawy genetyki III. Biologia molekularna genu, replikacja, mutageneza, naprawa DNA

Transkrypt

1 Podstawy genetyki III Biologia molekularna genu, replikacja, mutageneza, naprawa DNA

2 2 Zarys biologii molekularnej genu

3 Pionierskie doświadczenia Griffiths Bakterie zawerają czynnik transformujący, zdolny do przekazania informacji z żywych bakterii do martwych Avery, McLeod, McCarthy Czynnikiem transformującym jest DNA 3

4 Materiał genetyczny } Materiałem genetycznym są kwasy nukleinowe } Materiałem genetycznym organizmów komórkowych jest kwas deoksyrybonukleinowy (DNA) 4

5 Budowa DNA DNA zbudowany jest z nukleotydów podwójna helisa DNA 5

6 Zasada komplementarności pozwala na replikację DNA 6 Na podstawie sekwencji jednej nici można jednoznacznie odtworzyć sekwencję nici komplementarnej 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5 5 GATGTACTGATGACATA3 3 CTACATGACTACTGTAT5

7 Model semikonserwatywny replikacji 7

8 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 8

9 Centralna hipoteza ( dogmat ) DNA RNA BIAŁKO 9

10 Droga od DNA do białka } Ekspresja genów jest najważniejszym dla funkcjonowania komórek i organizmów procesem } Ekspresja genów składa się z wielu złożonych etapów, z których kazdy może podlegać regulacji 10

11 Ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych } Prokaryota } dominuje regulacja na poziomie transkrypcji } policistronowe jednostki transkrypcyjne o wspólnej regulacji transkrypcyjnej operony } mrna szybko degradowane, translacja zachodzi zasadniczo równocześnie z transkrypcją 11

12 Ekspresja genów prokariotycznych i eukariotycznych } Eukaryota } Procesy transkrypcji i translacji są rozdzielone w przestrzeni i czasie } Każdy gen ma własny promotor, nie występują operony } Proces ekspresji genu składa się z wielu etapów } Na każdym z etapów możliwe działanie regulacyjne } Informacja kierująca syntezą białka może być modyfikowana po transkrypcji (alternatywne składanie, redagowanie) złożoność proteomu przekracza złożoność genomu 12

13 Transkrypcja U eukariontów występują 3 wyspecjalizowane polimerazy RNA. Za transkrypcję genów kodujących białka odpowiada polii 13

14 Losy mrna w komórce eukariotycznej Transkrypcja Dodanie czapeczki na końcu 5 Składanie (splicing) Poliadenylacja na końcu 3 Transport do cytoplazmy Translacja Degradacja 14

15 Etapy ekspresji/poziomy regulacji u Eukaryota S struktura chromatyny S transkrypcja S obróbka i kontrola jakości RNA S transport RNA S degradacja RNA S translacja S modyfikacje post-translacyjne S degradacja białka 15

16 Elementy systemów regulacji } Elementy cis } Znajdują się w obrębie tej samej cząsteczki, co element podlegający regulacji } Elementy cis w obrębie DNA } np. promotory, operatory, enhancery } Elementy cis w obrębie RNA } sekwencje wiążące białka regulujące translację, splicing, degradację itp. 16

17 Elementy systemów regulacji } Elementy trans } Odrębne cząsteczki oddziałujące z elementami cis i modulujące ekspresję } Białka regulujące transkrypcję (czynniki transkrypcyjne), aktywatory, represory itp. } Białka regulujące inne etapy ekspresji (aktywatory/represory translacji, splicingu itp.) } RNA regulatorowe (sirna, mirna itp.) 17

18 Podstawy regulacji genu } Regulacja pozytywna } czynnik trans jest aktywatorem zwiększa ekspresję } Regulacja negatywna } czynnik trans jest represorem osłabia ekspresję 18

19 Podstawy regulacji genu } Regulacja indukowalna } Sygnał zwiększa (indukuje) ekspresję } Regulacja reprymowalna } Sygnał zmniejsza (reprymuje) ekspresję } Możliwe są różne układy, np. regulacja negatywna indukowalna } Nie należy mylić pojęć: pozytywna/negatywna dotyczy aktywności czynnika trans a indukowalna/reprymowalna odpowiedzi na sygnał 19

20 Przykład operon lac 20 W. S Klug, M.R Cummings Concepts of Genetics 8 th edition, Prentice Hall, 20

21 Kod genetyczny } Trójkowy } 20 aminokwasów } kodony po 3 nukleotydy: 4 3 =64 możliwości } Dowody: badanie mutantów insercyjnych i delecyjnych (3 kolejne insercje lub delecje przywracały funkcje) 21

22 Kod genetyczny } Nienakładający się } Dowody: } załóżmy sekwencję GTACA: jeden kodon: TAC, pozostałe: GTA i ACA (nakładanie 2 nukleotydów). Przy danym kodonie centralnym, możliwe tylko 4 2 = 16 różnych kombinacji trzyaminokwasowych. W naturze natomiast występują wszystkie możliwe kombinacje (20 2 =400). } Pojedyncza zmiana nukleotydowa w sekwencji kodującej zmienia tylko jeden aminokwas, a nie dwa sąsiednie 22

23 Kod genetyczny } Bezprzecinkowy } Zdegenerowany } 3 kodony STOP, pozostałe 61 kodonów koduje 20 aminokwasów 23

24 Kod genetyczny 24

25 Regularności w kodzie } Trzecia pozycja kodonu najmniej znacząca } (np. UCx Ser) } Aminokwasy o podobnych właściwościach często z podobnymi kodonami } Np. } AAA, AAG: lizyna; AGA, AGG: arginina } UCx: seryna; ACx: treonina 25

26 Parowanie wobble } W 3 pozycji kodonu (1 antykodonu) dozwolone parowanie G-U oraz I-U/A/C (I inozyna) 26

27 Translacja 27

28 Nobel chemia 28

29 29

30 Sekwencja białka zawiera sygnały sortowania do przedziałów komórki Kierowanie do ER i szlaku wydzielniczego zachodzi równocześnie z translacją Kierowanie do mitochondrium zachodzi po translacji 30

31 Białka podlegają złożonym modyfikacjom } Fałdowanie wspomagane przez białka opiekuńcze } Białka opiekuńcze odgrywają ważną rolę w patogenezie wielu chorób (nowotwory, choroba Huntingtona i inne choroby agregacyjne, choroba Parkinsona i Alzheimera, mukowiscydoza) } Modyfikacje chemiczne (fosforylacja, glikozylacja itp.) } Ubikwitynacja i degradacja } Zaburzenia w ubikwitynacji i degradacji białek stwierdzono w rodzinnej postaci choroby Parkinsona, zespole Angelmana, anemiach Fanconiego, zespole von Hippel-Landau i innych 31

32 32 Replikacja DNA

33 Model semikonserwatywny replikacji 33

34 Inne modele replikacji Rozproszony Semikonserwatywny Konserwatywny 34

35 Doświadczenie Meselsona i Stahla 35

36 Doświadczenie Meselsona i Stahla 36

37 Etapy replikacji } Inicjacja } Elongacja } Terminacja 37

38 Inicjacja } Rozplecenie (topnienie) podwójnej helisy DNA 38 Inicjacja replikacji u bakterii

39 Inicjacja u Eukaryota 39

40 Elongacja 40

41 Problem topologiczny Replikacja DNA postępując będzie generować naprężenia (superskręty) W DNA liniowym praktycznie nierozwiązywalne ze względu na upakowanie w komórce W DNA kolistym absolutnie nierozwiązywalne ze względu na brak wolnych końców 41

42 Problem topologiczny - topoizomerazy Topoizomeraza typu I wprowadza nacięcie w jednej z nici, przesuwa drugą nić przez przerwę i łączy końce Topoizomerazy typu II nacinają obie nici 42

43 Synteza DNA - polimeraza Synteza DNA (i RNA też) zawsze zachodzi przez dołączanie nowych nukleotydów do grupy OH na końcu 3 syntetyzowanej cząsteczki Substratem są trójfosforany nukleotydów, enzymem polimeraza (zależna od DNA polimeraza DNA) Polimeraza DNA potrafi dobudowywać nukleotydy do istniejącego łańcucha, nie potrafi rozpocząć syntezy 43

44 Startery 44

45 Prymaza Prymaza (polimeraza RNA zależna od DNA) syntetyzuje starter (RNA) dla polimerazy DNA, która go wydłuża. 45

46 Aktywności polimeraz DNA Synteza DNA Egzonukleaza 3-5 korekcja błędów 46 Egzonukleaza 5-3 naprawa uszkodzeń, usuwanie starterów

47 Problem nici nieciągłej Na nici nieciągłej trzeba co pewien odcinek ponawiać syntezę startera fragmenty Okazaki 47

48 Maszyneria replikacyjna 48

49 Maszyneria replikacyjna Topoizomeraza - usuwa naprężenia Helikaza (DnaB) - rozdziela nici SSB stabilizuje jednoniciowy DNA Prymaza syntetyzuje startery Polimeraza (-y) Ligaza skleja fragmenty 49

50 Widełki replikacyjne - topologia 50

51 U Eukaryota - PCNA } Proliferating Cell Nuclear Antigen } Kompleks białkowy w formie pierścienia przesuwającego się po nici DNA w czasie replikacji } Koordynuje różne etapy replikacji i syntezy DNA 51

52 Inne kompleksy białkowe Eukaryota } MCM Mini Chromosome Maintenance pierścień przesuwający się razem z widełkami replikacyjnymi } GINS (Go, Ichi, Nii, San; 5,1,2,3) pierścień współdziałający z MCM, przejście z fazy inicjacji do elongacji i utrzymanie elongacji GINS 52

53 Polimerazy bakteryjne PolIII (PolC) główny enzym replikacyjny, ma aktywność Exo 3-5 (korekta błędów), synteza do 1000 nt/s PolIII nie ma aktywności Exo5-3 PolI (PolA) ma dodatkowo aktywność Exo 5-3, usuwa startery i dokańcza syntezę, do 20 nt/s Ligaza łączy zsyntetyzowane fragmenty (nie jest polimerazą) 53

54 Polimerazy bakteryjne c.d. PolII (PolB) naprawa uszkodzonego DNA w fazie stacjonarnej PolIV i polv synteza DNA w fazie stacjonarnej (poliv) i przy znacznych uszkodzeniach genomu (polv) 54

55 Mutacje w polimerazach E. coli } PolI i polii mutacje nie są letalne, zwiększona wrażliwość na czynniki mutagenne (np. UV) } PolIII (i niektóre poli) mutacje letalne, badana przez mutanty warunkowe (np. termowrażliwe) 55

56 Polimerazy Eukaryota Pol α prymaza, wydłuża startery Pol β naprawa DNA Pol δ główny enzym replikacyjny, nić opóźniona Pol ε replikacja (nić wiodąca), kontrola cyklu kom., naprawa DNA Pol γ replikacja DNA w mitochondriach Polimerazy eukariotyczne nie mają aktywności Exo 5-3, startery RNA usuwają nukleazy FEN1, RNazaH i inne białka 56

57 Mutacje polimeraz eukariotycznych } U drożdży (przykłady) } } } } } POL1 (pol α) letalny, ts POL2 (pol ε) letalny, ts CDC2 (pol δ) letalny POL4 (pol β) zwiększona częstość rekombinacji i wrażliwość na mutageny MIP1 (pol γ) utrata funkcji mitochondrialnej, utrata mtdna } U człowieka } POLG (pol γ) mutacje powodują dziedziczoną autosomalnie chorobę mitochondrialną PEO -postępująca zewnętrzna oftalmoplegia (porażenie mięśni gałki ocznej) związana z uszkodzeniami mtdna opadanie powiek, niezdolność do poruszania gałkami oczu, ogólne osłabienie mięśni, zaburzenia neurologiczne, 57

58 Dwie klasy polimeraz } O dużej wierności mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy } zatrzymują się w miejscu uszkodzenia } standardowe enzymy replikacyjne } O niskiej wierności więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy } są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy TLS (trans-lesion synthesis) } mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu) 58

59 Rola PCNA } Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną 59

60 Więcej o replikacji (u Eukaryota) 60

61 Replikacja genomu kolistego pętla D 61

62 Replikacja genomu kolistego rolling circle 62

63 Problem zakończenia replikacji DNA liniowego } Na końcu cząsteczki nie ma skąd zacząc nowego fragmentu Okazaki na nici opóźnionej } Cząsteczka potomna będzie skrócona 63

64 Telomery i telomeraza } } } } Końce chromosomów posiadają serię powtórzonych fragmentów telomerów Telomeraza może wydłużać telomery wykorzystując fragment RNA Skracanie telomerów ogranicza liczbę podziałów niektórych komórek Aktywacja telomerazy związana jest z unieśmiertelnianiem komórek nowotworowych 64

65 Telomery } Końce chromosomów } Sekwencje powtórzone (TTAGGG) } Skracają się przy każdym podziale komórki } W niektórych komórkach mogą jednak być odtwarzane Aubert & Lansdorp, Physiol Rev vol 88 65

66 Kompleks chroniący końce chromosomów } Shelterin (ang. shelter = schronienie) } Pozbawienie telomerów białek indukuje odpowiedź naprawy uszkodzeń DNA 66 Denchi, DNA Repair 8 (2009)

67 Telomery a starzenie } Komórki somatyczne mają ograniczoną liczbę możliwych podziałów granica Hayflicka } Komórki linii płciowej dzielą się bez orgraniczeń } Granica Hayflicka związana jest ze skracaniem się telomerów } Aktywacja telomerazy wystarcza do unieśmiertelnienia i umożliwienia nieograniczonych podziałów } Limitująca jest ekspresja białkowej podjednostki telomerazy (htert), składnik RNA wyrażany konstytutywnie 67

68 Los komórki, która utraciła telomery } Aktywacja szlaków odpowiedzi na uszkodzenia DNA } Sygnał uszkodzeń genomowych zastopowanie cyklu komórkowego (tzw. kryzys replikacyjny) } Ograniczenie zdolności podziałowej jest ważnym mechanizmem ochronnym } Zapobieganie nowotworom } Utrzymywanie zróżnicowania klonalnego populacji komórek macierzystych 68

69 Telomery a odpowiedź na uszkodzenia DNA 69 Denchi, DNA Repair 8 (2009)

70 Telomery a nowotwory } W komórkach z defektywnym szlakiem odpowiedzi na uszkodzenia DNA (np. defekty p53) komórki ze skróconymi (lub uszkodzonymi) telomerami wciąż się dzielą } Efektem są rearanżacje chromosomów (fuzje, translokacje) } Prowadzi to do transformacji nowotworowej } W komórkach nowotworowych ponowna aktywacja telomerazy 70 Denchi, DNA Repair 8 (2009)

71 Dwa oblicza telomerów } Telomery chronią przed uszkodzeniami DNA i zaburzeniami chromosomów, które mogą prowadzić do nowotworzenia, ale... } Aktywność telomerazy unieśmiertelnia komórki (aktywna w 90% nowotworów) 71

72 Telomery a starzenie } U drożdży defekt telomerazy ustanie podziałów po kilku pokoleniach } U roślin, bezkręgowców i myszy podobnie (defekt po kilku pokoleniach) } U człowieka nawet częściowa utrata telomerazy (heterozygota) powoduje poważne defekty: } niedokrwistość } defekty układu odpornościowego } zwłóknienie płuc } Związek z wydłużeniem życia? 72 Aubert & Lansdorp, Physiol Rev vol 88

73 Co nam może dać telomeraza } Wieczna młodość?? } Leki przeciwnowotworowe?? 73

74 Wieczna młodość? } Starzenie się komórek somatycznych, nie dzielących się (np. układ nerwowy) nie zależy od telomerów } Telomery odgrywają rolę w starzeniu się komórek macierzystych i komórek układu odpornościowego } Skracenie telomerów jest ważnym mechanizmem przeciwnowotworowym } Z drugiej strony dostarcza silnej selekcji na komórki z defektami naprawy DNA, niestabilność chromosomów } Systemy podtrzymujące stabilność DNA komórek somatycznych nie są lepsze, niż jest to absolutnie niezbędne ( disposable soma ) 74

75 Naiwnych nie sieją... 75

76 Magiczna moc telomerazy c.d. 76

77 Terapie przeciwnowotworowe } Telomeraza jest aktywna w >90% nowotworów } Inhibitory telomerazy } chemiczne } sirna } przeciwciała (szczepienia) 77

78 78

79 79 Mutageneza i naprawa DNA

80 Zmiany genomu } Wielkoskalowe } Zmiany liczby i formy chromosomów, duplikacje całych genomów } Rearanżacje chromosomowe } Dotyczą dużej liczby genów, fenotyp plejotropowy } Mutacje } Dotyczą jednego, bądź niewielkiej liczby genów 80

81 Mutacja } Trwała, przekazywana przy replikacji zmiana sekwencji nukleotydowej w materiale genetycznym } Nie każde uszkodzenie DNA jest mutacją staje się nią dopiero po utrwaleniu i przekazaniu do cząsteczki (lub cząsteczek) potomnych 81

82 Mutacja i naprawa 82

83 Replikacja utrwala zmianę 83

84 Przyczyny mutacji } Mutacje spontaniczne } Nieuniknione błędy podczas replikacji } Mutacje indukowane } Błędy w wyniku działania czynników uszkadzających DNA lub zaburzających replikację mutagenów } Podział nie jest ścisły mechanizmy nieraz są podobne, wiele mutagenów zwiększa częstość błędów o mechanizmie takim, jak przy mutacjach spontanicznych 84

85 Dokładność replikacji } Specyficzność parowania nukleotydów nie jest zbyt wysoka (~5%) } Mechanizm selekcji nukleotydów polimerazy: na 3 etapach: } } } wiązanie nukleotydu z polimerazą przenoszenie do centrum aktywnego dołączanie do 3 końca syntetyzowanego łańcucha } Mechanizm korekcji błędów: } Aktywność egzonukleazy 3-5 } Usuwanie niewłaściwie wstawionego nukleotydu } Zasada konkurencji między aktywnością polimerazy a egzonukleazy 85

86 Dokładność replikacji } Ostatecznie polimeraza jest bardzo dokładnym enzymem } U E. coli częstość błędów 1:10 7 wstawianych nukleotydów } Częstość błędów na nici opóźnionej 20x wyższa niż na wiodącej } PolI mniej dokładna niż PolIII 86

87 Mutacje spontaniczne tautomeria zasad } Zasady azotowe występują w fomach tautomerycznych keto i enol (T, G, U) oraz amino i imino (A, C) } Dominuje forma ketonowa (lub aminowa) i ona daje właściwe parowanie } Rzadszy tautomer enolowy/iminowy może dać niewłaściwe parowanie 87

88 Poślizg replikacji } Częsty na sekwencjach powtórzonych, powoduje insercje i delecje } Zmienne sekwencje mikrosatelitarne } Wykorzystywane jako markery w badaniach populacyjnych, kryminalistycznych itp. } Niestabilność mikrosatelitów jest jednym z fenotypów komórek nowotworowych } Ekspansje powtórzeń trójnukleotydowych mutacje dynamiczne 88

89 Poślizg replikacji } Przesunięcie nici matrycowej i potomnej o jedną (lub więcej) jednostkę (zachowane parowanie) 89

90 Ekspansje trójkowe } Wydłużanie serii powtórzeń trójnukleotydowych } Mechanizm złożony: możliwe zaburzenia syntezy nici opóźnionej, efekt struktury DNA } Trójki bogate w pary G-C } Drożdżowy mutant genu RAD27 kodującego endonukleazę FEN1 } Przyczyna szeregu chorób genetycznych } Niekiedy efekt antycypacji: } liczba powtórzeń rośnie z pokolenia na pokolenie, aż osiągnie wartość krytyczną } fenotyp w każdym kolejnym pokoleniu coraz cięższy 90

91 Przykłady chorób } Zespół kruchego chromosomu X } norma (CAG) 6-35, chorzy (CAG) >60 } w sekwencji liderowej genu } Choroba Huntingtona } norma (CAG) 6-35, chorzy (CAG) } w sekwencji kodującej, trakt poliglutaminowy } cecha dominująca, agregacja białka } Ataksja Friedreicha } norma (CTG) 5-37, chorzy (CTG) } w intronie, zaburza splicing, obniżony poziom białka 91

92 Mutageny } Chemiczne } analogi zasad błędnie wykorzystywane jako substraty } reagujące bezpośrednio z DNA np. czynniki alkilujące, deaminujące, interkalujące tworzące addukty } działające pośrednio np. zwiększające produkcję reaktywnych form tlenu (nadtlenki, rodniki) w komórce } działające na polimerazę np. jony Mn 2+ (zamiast Mg 2+ )jako kofaktory polimerazy γ powodują wzrost częstości błędów } Fizyczne } Np. UV, promieniowanie jonizujące, temperatura } Biologiczne } Wirusy i ruchome elementy genetyczne integrujące się do genomu 92

93 Mutagen chemiczny - przykład } 5-bromouracyl } analog tyminy, ale równowaga przesunięta w stronę formy enolowej, tworzącej pary z G 93

94 Mutageny chemiczne } EMS (metanosulfonian etylu) } alkiluje zasady azotowe } Czynniki deaminujące (kwas azotawy, dwusiarczyn sodowy) } Deaminacja adeniny daje hipoksantynę: paruje z C zamiast T 94

95 Czynniki interkalujące } Płaskie cząsteczki, wciskają się między pary zasad, zmieniają skok helisy najczęściej insercje i delecje } np. bromek etydyny, akryflawiny 95

96 Działanie temperatury } Hydroliza wiązania β-n-glikozydowego, powstaje miejsce AP (apurynowe/apirymidynowe) i luka } Zwykle wydajnie naprawiane, ale w sytuacjach przeciążenia systemów naprawczych może być mutagenne } W ludzkich komórkach powstaje miejsc AP dziennie 96

97 Działanie UV } Powstają fotoprodukty np. dimery cyklobutylowe sąsiadujących zasad (najczęściej T-T), uszkodzenia

98 Naprawa DNA } U E. coli częstość błędów polimerazy 1:10 7 wstawianych nukleotydów } Ogólna częstość błędów przy replikacji: 1: :10 11 wstawianych nukleotydów } genom ~4, bp, czyli błąd raz na ~ podziałów } Za zmniejszenie częstości błędów replikacji o 3-4 rzędy wielkości odpowiadają systemy naprawy DNA 98

99 Systemy naprawy DNA } Naprawa bezpośrednia (DR) } Naprawa przez wycinanie (ER) } Naprawa przez wycinanie zasad (BER) } Naprawa przez wycinanie nukleotydów (NER) } Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) } Naprawa pęknięć dwuniciowych (DSBR) } system łączenia końców niehomologicznych (NHEJ) } rekombinacja homologiczna (HR) 99

100 Systemy naprawy DNA 100

101 Naprawa bezpośrednia } Naprawa pęknięć jednoniciowych przez ligazę } Odwrócenie reakcji alkilacji } np. MGMT (metylotransferaza O 6 -metyloguanino DNA) usuwa grupy alkilowe z atomu 6 guaniny } Fotoreaktywacja dimerów cyklobutylowych } fotoliaza DNA } Występuje u mikroorganizmów i wielu zwierząt, ale brak u ssaków łożyskowych, w tym u człowieka (jej rolę przejmuje system NER tzw. naprawa ciemna) 101

102 Naprawa przez wycinanie zasad (BER) } Usunięcie uszkodzonej zasady azotowej przez specyficzną glikozydazę DNA } Powstaje miejsce AP } Endonukleaza AP oraz fosfodiesteraza usuwają resztkę nukleotydu } Luka wypełniana jest przez polimerazę 102

103 Glikozydazy przykłady (ssaki) 103

104 Naprawa przez wycinanie nukleotydów U bakterii dwa systemy krótkich łat (wycinane ~12 nt) długich łat (wycinane ~ 2 kb) U Eukaryota wycinane ~25-30 nt naprawa sprzężona z transkrypcją 104

105 Xeroderma pigmentosum } Pol. skóra pergaminowata i barwnikowa } Choroba genetyczna związana z mutacjami genów kodujących białka systemu NER (7 grup komplementacji) } U człowieka to NER odpowiada za naprawę fotoproduktów } Działanie światła słonecznego wywołuje liczne przebarwienia i nowotwory skóry } Nie ma lekarstwa pacjenci muszą całkowicie unikać światła słonecznego 105

106 Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) } W odróżnieniu od DR, BER i NER nie dotyczy uszkodzeń w DNA, tylko błędów replikacji wstawionych niewłaściwych nukleotydów (np. błędy wynikające z tautomerii zasad) } Rozpoznawane zaburzenie podwójnej helisy, błędny nukleotyd wraz z otoczeniem (nawet do 1 kb) usuwany, po czym polimeraza uzupełnia lukę } Problem: jak rozpoznać, która nić jest rodzicielska (i ma właściwy nukleotyd), a która potomna (z błędem) 106

107 Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) } U bakterii nić rodzicielska jest metylowana } U Eukaryota metylacja też ma znaczenie (u ssaków, u drożdży już nie), ale są też inne mechanizmy (sprzężenie z replikacją, białka naznaczające nić rodzicielską) 107

108 Naprawa błędnie sparowanych nukleotydów (MMR) } MMR u bakterii } kilka systemów różniących się długością wycinanej łaty 108

109 Naprawa pęknięć DNA } Pęknięcia w jednej nici są łatwe do naprawienia: polimeraza + ligaza. Białka PARP chronią jednoniciowe fragmenty przed dalszą degradacją } Pęknięcia dwuniciowe są trudniejsze do naprawienia } Powstają np. w wyniku działania promieniowania jonizującego } Blokują replikację, nienaprawione mogą doprowadzić do utraty dużych fragmentów chromosomu podczas podziału 109

110 Naprawa pęknięć dwuniciowych } Łączenie końców niehomologicznych (NHEJ) } Rekombinacja homologiczna 110

111 Łączenie końców niehomologicznych } Występuje u Eukaryota, uproszczony wariant może też u bakterii 111

112 System SOS u bakterii } } } } Przy rozegłych uszkodzeniach matrycy (miejsca AP, fotoprodukty, uszkodzone zasady) Białko RecA pokrywa matrycę Polimeraza V z RecA tworzy mutasom Replikacja zachodzi, ale generuje wiele błędów 112

113 U eukariontów też dwie klasy polimeraz } O dużej wierności mało błędów, ale wrażliwe na uszkodzenia w matrycy } zatrzymują się w miejscu uszkodzenia } standardowe enzymy replikacyjne } O niskiej wierności więcej błędów, ale mniej wrażliwe na uszkodzenia matrycy } są w stanie kontynuować syntezę mimo uszkodzeń matrycy TLS (trans-lesion synthesis) } mechanizm umożliwiający dokończenie replikacji uszkodzonego DNA (zapobiega rearanżacjom genomu) 113

114 Rola PCNA } Ubikwitynacja i deubikwitynacja PCNA przełącza między replikacją TLS i wierną 114