MINITRANS. Zestaw do elektrotransferu równoległego białek i kwasów nukleinowych z żelu na membrany. Instrukcja Obsługi. Numer katalogowy:

Transkrypt

1 MINITRANS Zestaw do elektrotransferu równoległego białek i kwasów nukleinowych z żelu na membrany Instrukcja Obsługi Numer katalogowy: Aby uzys k ać pomoc techniczną (+48)

2 Spis treści 1. Informacje ogólne Wprowadzenie Skład Zestawu Minitrans Specyfikacja techniczna Zasady bezpiecznego użytkowania 4 2. Użytkowanie Zestawu Minitrans Wykorzystanie aparatu Minitrans w analizie Western blot Wykorzystanie aparatu Minitrans w analizie Southern blot Konserwacja aparatu Diagnozowanie i usuwanie problemów Akcesoria i wyposażenie dodatkowe Warunki gwarancji Formularz naprawy gwarancyjnej Wsparcie techniczne 16

3 1. Informacje ogólne 1.1 Wprowadzenie Serdecznie dziękujemy za zakup Zestawu Minitrans do elektrotransferu białek i kwasów nukleinowych z żeli na membrany. Skuteczna immunodetekcja białek rozdzielnych w żelach SDS-PAGE i przeniesionych na membrany (Western blotting) wymaga skutecznej renaturacji epitopów na powierzchni tych białek, które są rozpoznawane przez przeciwciała pierwszorzędowe. Podwyższona temperatura, która często towarzyszy szybkiemu transferowi półsuchemu może ograniczyć zdolność denaturacji epitopów a przez to obniżać poziom detekcji białek. Aby ograniczyć to zjawisko należy przeprowadzić elektrofotransfer białek z żelu na membrany w temperaturze pokojowej lub niższej. Zestaw Minitrans idealne nadaje się do tego typu transferów. 1.2 Skład Zestawu Minitrans Aby optymalnie korzystać z Zestawu Minitrans, prosimy o zapoznanie się z elementami Zestawu Minitrans przed pierwszym zastosowaniem. 1. Komora do elektrotransferu z elektrodami 1 szt. 2. Ramka do unieruchomienia żelu z zamknięciem 2 szt. 3. Gąbki mineralne 4 szt. 4. Pokrywa komory 1 szt. 5. Kable zasilające 2 szt. 6. Instrukcja obsługi 1 szt. Rysunek 1. Skład Zestawu Minitrans. a) ramka do transferu: 1 klamra spinająca ramkę, 2 ramka; b) komora do elektrotransferu: 1 wtyk elektrody + (kolor czerwony), 2 wtyk elektrody - (kolor czarny), 3 elektroda +, 4 elektroda - ; c) komora do elektrotransferu ze wsuniętą ramką i pokrywą. 3

4 1.3 Specyfikacja techniczna Korpus komory do elektrotransferu Pokrywa Ramka do unieruchomienia żelu i membrany Gąbka mineralna Kable zasilające Elektrody Wymiary aparatu (d x sz x w) Waga PERSPEX PMMA PERSPEX PMMA PERSPEX PMMA włókno mineralne plecionka miedzianka, izolacja silikonowa platyna 150 x 108 x 125 (mm) 0,8 kg 1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania Prosimy o uważne zapoznanie się z instrukcją obsługi oraz zasadami bezpiecznego użytkowania aparatu. 1. Aparat Minitrans jest obsługiwany przez zewnętrzny zasilacz i może być potencjalnym źródłem śmiertelnego napięcia. 2. Zasilacz aparatu (nie wchodzący w skład Zestawu Minitrans), powinien zostać podłączony do uziemienia. 3. Zasilanie aparatu jest podłączone przez pokrywę z kablami zasilającymi. Przed każdym zdjęciem pokrywy aparatu należy pamiętać o wyłączeniu zasilania zasilacza elektroforetycznego. Nie podłączać aparatu bez pokrywy. 4. Aparat Minitrans powinien być obsługiwany wyłącznie przez przeszkolony personel. 5. Aparat Minitrans należy używać wyłącznie zgodnie z jego przeznaczeniem. 6. Należy używać wyłącznie dedykowanych akcesoriów. Stosowanie elementów z innych, niekompatybilnych aparatów może spowodować jego uszkodzenie i utratę ochrony gwarancyjnej. 7. Aparat Minitrans jest wykonany z tworzywa PERSPEX PMMA, który może ulec uszkodzeniu pod wpływem działania rozpuszczalników organicznych. Do mycia aparatu należy stosować wyłącznie łagodne detergenty i wodę dejonizowaną. Urządzenie jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej: 73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa 4

5 2. Użytkowanie Zestawu Minitrans Elektrotransfer a następnie immunodetekcja białka unieruchomionego na membranie jest jedną z powszechniej stosowanych metod biologii molekularnej. W celu wykrycia obecności określonego antygenu na membranie inkubuje się ją w roztworze specyficznych przeciwciał, a następnie wybraną techniką uwidacznia kompleks antygenprzeciwciało. Minimalna ilość wykrywanego antygenu wynosi ok. 0,1 ng. Białka unieruchamiane (wiązane) na membranie (np. nitrocelulozowej) mogą być poddawane także innym reakcjom, jak np. inkubacja z lektynami w celu wykrycia glikoprotein lub reakcji z DNA w celu wykrycia białek posiadających zdolność wiązania kwasów nukleinowych. Ponadto wycięte prążki bibuły ze związanymi białkami można użyć do elucji białka z membrany a następnie sekwencjonowania (MS) lub jego denaturacji do dalszych badań ich aktywności biologicznej. Metody uwidaczniania kompleksu antygen-przeciwciało na membranie można podzielić na dwie grupy: 1. izotopowe 2. enzymatyczne jedno- i dwustopniowe W metodzie enzymatycznej jednostopniowej przeciwciała związane z antygenem wykrywane są przez przeciwciała anty-igg gatunkowo swoiste (np. najpowszechniej stosowane: kozie anty-igg królicze) związane z peroksydazą chrzanową (POD) - tzw. przeciwciała II-rzędowe. W następnym etapie membranę inkubuje się w roztworze substratu np. 4-chloro-1-naftolu, co powoduje, że w miejscu zetknięcia enzymu (sprzęgniętego z drugim przeciwciałem) z substratem pojawiają się ciemnoniebieskie prążki. Metoda dwustopniowa wymaga większego nakładu czasu, ale jest kilkukrotnie czulsza od metody jednostopniowej. W tym przypadku drugie przeciwciało jest biotynylowane. W kolejnym etapie inkubuje się kompleks (antygen - pierwsze przeciwciała - drugie przeciwciała + biotyna) w roztworze awidyny lub streptawidyny, która jest sprzężona z enzymem (np. alkaliczną fosfatazą - AP). Ostatnia inkubacja w roztworze substratu (np. dla alkalicznej fosfatazy) powoduje powstanie w miejscu związania się enzymu ciemnobrązowych prążków. Ostatnio coraz częściej stosuje się enzym lucyferazę, który w obecności substratu emituje światło. Klisza fotograficzna przyłożona do membrany z kompleksem antygen - pierwsze przeciwciała - drugie przeciwciała + lucyferaza) ulega zaczernieniu w miejscu związania enzymu. Ten układ detekcji kompleksu antygen-przeciwciało jest najczulszy a ponadto daje najtrwalszą dokumentację doświadczenia - kliszę fotograficzną. 2.1 Wykorzystanie aparatu Minitrans w analizie Western blot I. Roztwory 1. Bufor do transferu Skład: 25 mm Tris, 192 mm glicyna (kwas aminooctowy) ph 8.3 Przygotowanie: na 4 litry buforu: 2,1 g Tris, 57,6 g glicyny 2. Bufor TBS Skład: Przygotowanie: 50 mm Tris - HCl ph 7.5, 0,5 M NaCl Rozpuścić 6,05 g Tris i 8,76 g NaCl w 800 ml wody dejonizowanej. Ustalić ph na 7,6 a następnie dopełnić do 1L. 3. Odtłuszczone mleko w proszku 3% roztwór mleka odtłuszczonego w buforze TBS lub 1% BSA w TBS. 5

6 II. Materiały 1. Nitroceluloza (np. BA 83 lub BA 85) 2. Bibuła Whatman 3MM pocięta na prostokąty o wymiarach większych o 1 cm od żelu poliakrylamidowego, z którego będzie dokonywany transfer. 3. Pierwsze przeciwciała - roztwór specyficznej surowicy np. króliczej (lub frakcja przeciwciał IgG) skierowanej przeciwko wybranemu antygenowi. Zazwyczaj stosuje się rozcieńczenia 1:100 do 1: w buforze TBS. 4. Drugie przeciwciała: - przeciwciała anty-igg grupowo specyficzne związane z peroksydazą. - przeciwciała anty-igg grupowo specyficzne związane z biotyną (np. biotynylowane przeciwciała kozie anty-igg królicze, jeżeli do detekcji antygenu na membranie użyta była surowica królicza). 5. Streptawidyna lub awidyna związana z alkaliczną fosfatazą. 6. Substrat enzymu markerowego: - dla peroksydazy: 30% H2O2 i 4-chloro-1-naftol (może być przechowywany w stanie stałym przez kilka miesięcy w 20 C). - dla alkalicznej fosfatazy: BCIP (sól p-toluidynowa 5-bromo-4-chloro-3- indolyfosforanu) i NBT (błękit nitroterazoliowy). BCIP można przechowywać w stanie stałym w 20 C. 7. Bufor AP: 100 mm Tris ph 9,5, 50 mm MgCl2, 100 mm NaCl III. Wyposażenie dodatkowe 1. Pojemniki szklane o wymiarach nieco większych niż od wymiarów użytej membrany. (Polecamy pojemniki szklane przezroczyste z pokrywami w trzech rozmiarach: nr. kat , , , lub pojemniki ze szkła nieprzezroczystego z pokrywami [do reakcji z alkaliczną fosfatazą] nr. kat , , ). 2. Kołyska laboratoryjna 3. Kuweta (plastikowa lub ceramiczna) o wymiarach większych od ramki aparatu do elektrotransferu. IV. Procedura elektrotransferu białek z żelu poliakrylamidowego na membranę. 1. W czasie rozdziału elektroforetycznego próby na żelu poliakrylamidowym przygotować 4 litry buforu do transferu oraz trzy pojemniki szklane (Nr kat ) oraz kuwetę plastikową. Do trzech kolejnych pojemników szklanych wlać po ok. 200 ml buforu do transferu a następnie umieścić w nich kolejno: - 1 lub 2 (w zależności od ilości żeli poddawanych transferowi) komplety gąbek mineralnych - 2 lub 4 kawałki bibuły Whatman 3MM oraz taką samą ilość bibuły laboratoryjnej - 1 lub 2 odpowiednio przycięte kawałki membrany (np. nitrocelulozy lub immobilonu). 2. Otwartą ramkę do transferu umieścić w kuwecie plastikowej. Na jedną jej stronę położyć nawilżoną buforem do transferu gąbkę mineralną, następnie podobnie zwilżone arkusze bibuły zwykłej i arkusz wilgotnej bibuły Whatman 3MM. 3. Żel po elektroforezie wyjąć spomiędzy szyb i usunąć żel zagęszczający (górny). 4. Delikatnie położyć żel na zwilżony arkusz bibuły Whatman 3MM zwracając uwagę na to, aby unikać powstawania bąbli powietrza między bibułą a żelem. 5. Żel polać buforem do transferu. 6. Na żelu ułożyć nawilżoną wcześniej membranę a na niej kolejno arkusz bibuły Whatman 3MM, bibuły zwykłej oraz gąbkę mineralną. Ramkę zamknąć i spiąć klamrą. 6

7 7. Ramkę z żelem i membraną wstawić do komory aparatu wypełnionej w 2/3 buforem do transferu. Należy pamiętać o prawidłowym usytuowaniu żelu i membrany względem elektrod - membrana powinna znajdować się od strony anody (elektroda + ) a żel od strony katody (elektroda - ). W celu uniknięcia błędów proponujemy wprowadzenie stałej zasady, iż np. membrana znajduje się zawsze po jasnej stronie ramki a żel kładziony jest na ciemnej (zabarwionej) stronie. Rysunek 2. Kolejność ułożenia kolejnych elementów w czasie transferu. 1 ścianki ramki do elektrotransferu, 2 arkusz bibuły laboratoryjnej, 3 arkusz bibuły Whatman 3MM, 4 membrana (nitroceluloza, immobilon), 5 żel poliakrylamidowy. Strzałka wskazuje kierunek przemieszczania się białka z żelu SDS-PAGE na membranę. 8. Uzupełnić komorę buforem do pełna starając się usunąć ewentualne pęcherze powietrza i przykryć komorę pokrywką. 9. Aparat połączyć z zasilaczem (polecamy mikroprocesorowy zasilacz stabilizowany STABNAP 300; nr kat ). 10. Po upewnieniu się, iż podłączenie kabli do elektrod (kierunek przepływu prądu) jest poprawne, włączyć zasilacz ustawiając odpowiednie parametry prądu np: 60 V, 2 godziny - w przypadku buforu do transferu z 20% dodatkiem metanolu 30 V, przez noc - w przypadku buforu do transferu z 20% dodatkiem metanolu 20 V, przez noc - w przypadku buforu do transferu bez metanolu V. Immunodetekcja białek UKŁAD JEDNOSTOPNIOWY; DRUGIE PRZECIWCIAŁA ZWIĄZANE Z PEROKSYDAZĄ CHRZANOWĄ [POD] 1. Po zakończeniu transferu wyjąć nitrocelulozę z ramki aparatu. Stronę membrany przylegającą do żelu można zaznaczyć ołówkiem - z tej strony związane są białka. Płukać przez 5 min. w 200 ml buforu TBS. UWAGA! Wszystkie płukania i inkubacje należy wykonywać w temperaturze pokojowej w pojemnikach szklanych ustawionych na kołysce laboratoryjnej. 2. W celu sprawdzenia efektywności transferu białka, które pozostały w żelu można wybarwić np. metodą Coomassie stosując barwnik COOMASSIE S. Jednocześnie 7

8 można odwracalnie zabarwić białka przeniesione na membranę umieszczając ją na 10 min. w barwniku PONCEAU S. 3. Po odpłukaniu nadmiaru barwnika PONCEAU S przy pomocy wody zaznaczamy za pomocą ołówka np. pozycję wzorców masowych i wybranych białek na membranie (czułość barwnika PONCEAU S jest porównywalna z metodą Coomassie - ok. 0,5 g/prążek) a następnie odpłukujemy barwnik kilkoma porcjami wody lub buforu TBS. 4. Wolne miejsca wiążące na nitrocelulozie blokuje się inkubując membranę w 3% roztworze mleka odtłuszczonego (w proszku) lub w 1% BSA w TBS przez 1 godzinę. 5. Specyficzne wiązanie się przeciwciał z antygenem unieruchomionym na nitrocelulozie odbywa się w czasie jednogodzinnej inkubacji membrany w 50 ml roztworu specyficznych przeciwciał (pierwsze przeciwciała) rozpuszczonych w buforze TBS. Inkubacji dokonuje się w temperaturze pokojowej na kołysce laboratoryjnej pozwalającej na ciągłe omywanie membrany roztworem przeciwciał oraz jego mieszanie. Najczęściej stosuje się rozcieńczenia 1:200 do 1: Po godzinie inkubacji należy odpłukać nadmiar specyficznych przeciwciał poprzez 3- krotne, 10-cio minutowe płukanie w 200 ml porcjach 3% roztworu mleka odtłuszczonego w TBS. 7. Kolejnym etapem jest godzinna inkubacja membrany (z antygenem i pierwszymi przeciwciałami) w roztworze przeciwciał anty-igg związanych z peroksydazą chrzanową POD (drugie przeciwciała). Inkubacji dokonuje się w temperaturze pokojowej na kołysce laboratoryjnej pozwalającej na ciągłe omywanie membrany roztworem przeciwciał oraz jego mieszanie. Roztwór drugich przeciwciał sporządzić w 3% roztworze mleka odtłuszczonego lub 1% BSA w TBS w objętości ml. Zalecane rozcieńczenie przeciwciał podawane jest przez ich producenta w dołączonej specyfikacji, zazwyczaj wynosi ono od 1:1000 do 1: Po godzinie inkubacji w roztworze drugich przeciwciał należy odpłukać ich nadmiar przez jednokrotne płukanie w 200 ml 3% mleka w TBS oraz dwukrotne w 200 ml TBS. Płukania powinny trwać do 10 min. każde. 9. W czasie wykonywania czynności wymienionych w punkcie poprzednim przygotować roztwór substratu dla peroksydazy: 60 mg 4-chloro-1-naftolu rozpuścić w 20 ml schłodzonego w -20 C etanolu; zmieszać 100 ml TBS z 60 l 30% roztworu wody utlenionej (H2O2). Obydwa roztwory zmieszać ze sobą bezpośrednio przed zanurzeniem w nich membrany. 10. Nitrocelulozę przenosi się do roztworu substratów a następnie inkubuje delikatnie mieszając przez 5-10 min. Prążki (ciemnoniebieskie) pojawiają się po ok. 1-2 min. 11. Po zakończeniu reakcji wywoływania nitrocelulozę przepłukać kilkukrotnie w niewielkich porcjach wody dejonizowanej w celu odpłukania nieprzereagowanego substratu. 12. Membranę po płukaniu wysuszyć miedzy kilkoma warstwami bibuły. Tak wysuszoną membranę należy sfotografować (bardzo dobry kontrast uzyskuje się w białym świetle przechodzącym - polecamy podświetlacz na światło białe - nr kat ). Membranę przechowywać bez dostępu światła. 8

9 UKŁAD DWUSTOPNIOWY; DRUGIE PRZECIWCIAŁA BIOTYNYLOWANE, ENZYM ALKALICZNA FOSFATAZA ZWIĄZANA ZE STREPTAWIDYNĄ 1. Barwienie białek na nitrocelulozie, blokowanie wolnych miejsc, inkubacja z pierwszymi przeciwciałami oraz płukanie przeprowadza się analogicznie jak w punktach 1-6 części 3a. 2. Po zakończeniu odpłukiwania nadmiaru pierwszych przeciwciał przenieść membranę do roztworu biotynylowanych przeciwciał anty-igg (np. biotynylowane kozie anty-igg królicze) w 3% roztworze mleka odtłuszczonego w TBS. Inkubację przeprowadzać przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na kołysce laboratoryjnej pozwalającej na ciągłe omywanie membrany roztworem przeciwciał oraz jego mieszanie. Stosowane rozcieńczenia drugich przeciwciał: 1:300 do 1: Usunąć nadmiar drugich przeciwciał poprzez odpłukanie membrany w 200 ml 3% roztworu mleka odtłuszczonego w TBS (10 min.) oraz dwukrotne w 200 ml TBS (2 10 min.) 4. Inkubować membranę w roztworze kompleksu streptawidyny z alkaliczną fosfatazą (AP) w 1% BSA w TBS. Czas inkubacji wynosi min. 5. Po inkubacji usunąć nadmiar kompleksu streptawidyna - AP przez trzykrotne płukanie w 200 ml TBS (3 10 min.). 6. Przepłukaną membranę przenieść do naczynia zawierającego 200 ml buforu AP. Inkubować 5-10min. w temperaturze pokojowej na kołysce laboratoryjnej pozwalającej na ciągłe omywanie membrany buforem oraz jego mieszanie. 7. Mieszanie NBT (66 l) z buforem AP (15 ml) a następnie BCIP (50 l) oraz wywołanie reakcji barwnej przeprowadzić w ciemnym, nieprzezroczystym dla światła pojemniku szklanym (nr kat ). Inkubację membrany w powyższej mieszaninie substratów prowadzić należy przez 20 min., ale można przedłużyć czas wywoływania do kilku godzin, kontrolując wzrost zabarwienia tła. 8. Po zakończeniu reakcji wywoływania nitrocelulozę przepłukać kilkukrotnie w niewielkich porcjach wody dejonizowanej w celu odpłukania nieprzereagowanego substratu. 9. Membranę po płukaniu wysuszyć miedzy kilkoma warstwami bibuły. Tak wysuszoną membranę należy sfotografować (bardzo dobry kontrast uzyskuje się w białym świetle przechodzącym - polecamy podświetlacz na światło białe - nr kat ). Membranę przechowywać bez dostępu światła. UWAGI a. Wszystkie czynności wymagające dotykania membrany trzeba wykonywać w rękawiczkach. b. Zamiast nitrocelulozy można używać membran innego rodzaju, np. Immobilon P, Immobilon N, membrany nylonowe. c. W celu zminimalizowania ryzyka odwrotnego transferu (tzn. przeniesienia białka nie na membranę a do otaczającego buforu) jedna strona ramki jest zabarwiona. Dzięki temu można wprowadzić zasadę kładzenia żelu na zabarwioną stronę ramki, przed położeniem membrany. Nitroceluloza będzie znajdowała się zawsze bliżej anody (elektrody + ) niż żel, jeśli ramka będzie zawsze wkładana stroną zabarwioną w kierunku katody (elektrody - ) a bezbarwną w kierunku anody. 9

10 2.2 Wykorzystanie aparatu Minitrans w analizie Southern blot Metoda hybrydyzacji DNA/RNA (z ang. Southern blot) polega na specyficznym wiązaniu wyznakowanej radioaktywnie bądź nieradioaktywnie sondy do fragmentów DNA unieruchomionych na membranie. W pierwszym etapie procedury analizowane DNA (np. chromosomalne lub plazmidowe) po trawieniu enzymami restrykcyjnymi zostaje rozdzielone w żelu agarozowym, a następnie zdenaturowane działaniem NaOH w roztworze o wysokiej sile jonowej. Po zobojętnieniu żelu do ph ok. 7,4, DNA zostaje przeniesione na stabilny nośnik jakim jest membrana (nylon lub nitroceluloza). Następnie filtr ze związanym DNA jest hybrydyzowany do wyznakowanej np. markerem chemiluminescencyjnym sondy i eksponowany wobec światłoczułej błony fotograficznej. Miejsca związania sondy, a tym samym obecności interesującego nas fragmentu DNA, uwidaczniają się na błonie w postaci zaczernień (Rysunek 3). Rysunek 3. Przykład analizy typu Southern blot. Oznaczenie ilości kopii transgenu w transgenicznych roślinach tytoniu metodą Southern blot (sonda wyznakowana digoksygeniną [DIG]). Do hybrydyzacji typu Southern stosuje się sondy znakowane izotopami radioaktywnymi (np.: fosforem 32P) oraz sondy znakowane nieizotopowo (np.: DIG, biotyną). Hybrydyzacje przy pomocy sond znakowanych nieizotopowo są przeprowadzane przy użyciu standardowych protokołów, natomiast metody detekcji są analogiczne do wykorzystywanych w technice Western blotting. Do zalet nieizotopowych metod znakowania sondy należy zaliczyć przede wszystkim większe bezpieczeństwo pracy oraz możliwość wielokrotnego wykorzystywania raz wyznakowanej sondy, która może być przechowywana w odpowiednich warunkach przez co najmniej 12 miesięcy. Metody izotopowe z kolei, charakteryzują się większą czułością, są natomiast znacznie bardziej kłopotliwe w stosowaniu, ze względu na konieczność dysponowania specjalnie przystosowanymi pomieszczeniami do pracy z materiałami promieniotwórczymi, specjalistycznym sprzętem oraz dość krótkim okresem użyteczności. Czułość hybrydyzacji DNA/DNA zależy od wielu czynników, m.in.: wielkości sondy, metody jej znakowania ilości DNA przetransferowanego na membranę, zawartości sekwencji komplementarnych do używanej sondy, obecnych w analizowanym DNA, zastosowanych metod transferu, immobilizacji DNA, rodzaju membrany oraz metodyki hybrydyzacji i detekcji. 10

11 Przy optymalnych warunkach hybrydyzacji pojedynczą sekwencję o wielkości 1000 par zasad tą metodą można wykryć w 10 g DNA chromosomalnego z genomu człowieka transferowanego na membranę, po nocnej hybrydyzacji z sondą mającą wielkość kilkuset par zasad. I. Roztwory 1. Bromek etydyny 10 mg/ml 2. TAE: 20 mm Tris, ph 7,8, 10 mm octan sodu, 0.5 mm EDTA 3. TBE: 50 mm Tris, ph 8,3, 50 mm kwas borowy, 1.0 mm EDTA 4. Roztwór do depurynacji: 0,25 M HCl 5. Roztwór do denaturacji: 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl 6. Roztwór do neutralizacji: 0,5 M Tris-HCl ph 7,5; 3 M NaCl 7. Roztwór do neutralizacji: 0,5 M Tris-HCl ph 7,5; 3 M NaCl 8. 20xSSC: 3 M NaCl, 0,3 M cytrynian sodu; ph 7,0 II. Materiały 1. Membrana nylonowa 2. Bibuła filtracyjna Whatman 3MM 3. Bibuła laboratoryjna III. Procedura Southern blot transfer i hybrydyzacja DNA/RNA na membrany 1. Po zakończonej elektroforezie zabarwić żel przez inkubację w roztworze bromku etydyny przez 5-7 min. Kuwetę z żelem należy ustawić na kołysce laboratoryjnej. Następnie odbarwić żel w wodzie przez 15 min. 2. Obejrzeć żel na transiluninatorze, wykonać zdjęcie przyłożywszy uprzednio linijkę z podziałką wzdłuż żelu. 3. Inkubować żel w roztworze do depurynacji ( ok ml). Inkubować 15 min., przepłukać żel wodą. 4. Inkubować j.w. 2 x po 15 min. w ml roztworu do denaturacji, przepłukać żel wodą. 5. Inkubować j.w. 2 x po 15 min. w ml roztworu do neutralizacji 6. Zwilżyć bibułę filtracyjną i membranę zgodnie z zaleceniami producenta 7. Złożyć kanapkę do transferu zgodnie z Rys. nr 4. a. Na namoczonej w buforze TAE lub TBE bibule ułożyć membranę przeciętą na wymiar żelu. b. Ułożyć ostrożnie żel zawierający DNA na membranie tak, aby jego boki nie wystawały poza membranę. Usunąć pęcherze powietrza spomiędzy żelu a membrany. c. Złożyć bibułę namoczoną w roztworze TBE lub TAE w zależności od tego w którym z buforów prowadzona była elektroforeza. 11

12 Rysunek 4. Kolejność ułożenia kolejnych elementów w czasie transferu. 1 ścianki ramki do elektrotransferu, 2 arkusz bibuły laboratoryjnej, 3 arkusz bibuły Whatman 3MM, 4 membrana (nitroceluloza, immobilon), 5 żel poliakrylamidowy. Strzałka wskazuje kierunek przemieszczania się DNA/RNA z żelu na membranę. 8. Prowadzić transfer przez noc przy napięciu 30 V. 9. Po zakończeniu transferu zaznaczyć ołówkiem na membranie prawy górny róg, a następnie przełożyć membranę na folię do żywności i związać DNA z błoną promieniami UV (1200 kj/cm2). 10. Przemyć membranę wodą destylowaną 11. Przejść do prehybrydyzacji i hybrydyzacji DNA. 12

13 3. Konserwacja aparatu Korpus aparatu, kasety do elektrotransferu oraz pokrywa są wykonane z materiału PERSPEX PMMA. Materiał typu PERSPEX PMMA jest podatny na uszkodzenia pod wpływem stężonych rozpuszczalników organicznych, w szczególności alkoholi. Do mycia aparatu należy używać łagodnych detergentów i wody dejonizowanej. Gąbki mineralne należy dokładnie umyć i pozostawić do wyschnięcia. Filtry papierowe używać jednorazowo. 13

14 4. Diagnozowanie i usuwanie problemów Problem Możliwa przyczyna Rozwiązanie 1. Nieefektywny transfer białek na membranę (Western blot) a. Nieodpowiednia membrana a. Użyj membrany PVDF. Membrana nitrocelulozowa posiada większe pory, dlatego białka o małej masie mogą zostać niezwiązane na membranie b. Niewłaściwie przeprowadzona procedura transferu b. Upewnij się, że filtry papierowe i gąbki użyte do transferu są dokładnie namoczone w buforze c. Upewnij się, czy bufor do transferu ma odpowiedni skład d. Upewnij się, że membrana została aktywowana w roztworze metanolu przed złożeniem kanapki transferowej 2. Natężenie prądu jest wyższe od zadanego 3. Po włączeniu zasilacza wskaźnik natężenia prądu wskazuje wartość 0 a. Za wysokie stężenie buforu do transferu a. Brak przepływu prądu b. Za niski poziom buforu e. Zoptymalizuj czas trwania i napięcie transferu. a. Przygotuj świeżą porcję buforu lub rozcieńcz już przygotowany. Upewnij się, że przygotowując bufor użyto Tris Base a nie Tris-HCl a. Sprawdź podłączenie aparatu do zasilacza b. Upewnij się, że w zbiorniku znajduje się odpowiednia ilość buforu c. Za wysoka siła jonowa buforu c. Przygotuj bufor o niższym stężeniu d. Używany zasilacz ma za mały zakres regulacji napięcia d. Użyj zasilacza o wyższym zakresie napięcia 14

15 5. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe Numer katalogowy Opis produktu Kasetka do aparatu Minitrans Gąbka do aparatu Minitrans Aparat do elektroforezy Minipol Pojemnik szklany z pokrywą do barwienia żeli DryOut do suszenia żeli z foliami na 35 żeli 15

16 6. Warunki gwarancji Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. gwarantuje, że dostarczony Państwu sprzęt został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 24 miesiące tylko wtedy, gdy produkt i jego funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi i przeznaczeniem aparatu. Producent nie ponosi odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z nieprawidłowego użytkowania aparatu. Gwarancji nie podlega sprzęt, który nosi znamiona naprawy przez osoby inne niż wskazane przez firmę Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy lub wymiany urządzenia, lub zwrotu kosztów zakupu. Firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne zastrzega sobie prawo do zmiany specyfikacji urządzenia bez wcześniejszego powiadomienia. Urządzenie powinno być obsługiwane wyłącznie przez osoby przeszkolone. 6.1 Formularz naprawy gwarancyjnej W przypadku wystąpienia awarii, uprzejmie prosimy o wypełnienie Formularza naprawy gwarancyjnej dostępnego na kolejnej stronie i skontaktowanie się z firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Prosimy o zachowanie oryginalnych opakowań aparatu do czasu zakończenia okresu gwarancyjnego. 7. Wsparcie techniczne Jeżeli macie Państwo jakieś pytania dotyczące obsługi urządzenia lub dostępności akcesoriów i sprzętu uzupełniającego prosimy o kontakt z naszą Firmą. Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. ul. Pawińskiego 5a/ blok D Warszawa Tel Fax info@kucharczyk 16

17 ZGŁOSZENIE SERWISOWE Nazwa Instytucji Adres Instytucji Osoba zgłaszająca Dane kontaktowe (tel., ) Nazwa DANE URZĄDZENIA Model / nr katalogowy Numer seryjny Opis problemu/uszkodzenia Oświadczenie Niniejszym potwierdzam, że przesłane do serwisu urządzenie nie zawiera substancji chemicznych ani czynników infekcyjnych szkodliwych dla zdrowia człowieka. Data Podpis osoby zgłaszającej 17

18