TytuI rozprawy : Nieinwazyjne obrazowanie komorkowe jako narz^dzie. przyspieszaj^ce post^p w dziedzinie terapii komorkowej cliorob uktadu nerwowego

Transkrypt

1 Dr hab.med. Barbara Bobek-Billewicz prof.nadzw. Recenzja rozprawy doktorskiej Piotra Walczaka TytuI rozprawy : Nieinwazyjne obrazowanie komorkowe jako narz^dzie przyspieszaj^ce post^p w dziedzinie terapii komorkowej cliorob uktadu nerwowego (Non-invasive cell tracking as a tool for advancing cell-based therapy of neurological diseases). Promoter: prof.dr.hab. med. Wojeiech Maksymowicz Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska sktada si z trzech prac opubiikowanych, streszczeh w j^zyku polskim i angielskim, celow i wnioskow. Dwie z prac zostafy opublikowane w Magnetic Resonance in Medicine : "Instant MR labeling of stem cells using megnetoelectroporation" w 2005 r (cz^sc plerwsza pracy) i "Applicability and limitations of MR tracking of neural stem cells with rapid turnover: the case of the shiverer dysmyelinated mouse brain " w 2007 (cz^sc druga pracy). W obu tych pracach Doktorant jest pierwszym autorem. W trzeciej pracy" Using MR! cell tracking to evaluate targeting of glial precursor cells to inflammatory tissue using the VLA-4 docking receptor" przyj^tej do druku w Radiology w grudniu 2011 Doktorant jest senior autorem (cz^sc trzecia pracy). Do dokumentacji dol^czono oswiadczenie Doktoranta o jego znacz^cym wwadzie w poszczegolne publikacje b^d^ce podstaw^ wnioskowania o wszcz^cie przewodu doktorskiego. Wybor tematu uwazam za wtasciwy tak z punktu widzenia rozwoju diagnostyki MR jak i rozwoju metod leczenia chorob uktadu nerwowego. Niew^tpliwie obrazowanie komorek byloby czy raczej b^dzie milowym krokiem w rozwoju badati metodq rezonansu magnetycznego bye moze prowadz^c w przysztosci do zastqpienia t^ metod^ badania PET. Doniesienia o czulosci - co prawda bardzo wysoko polo wych - systemow MR w uwidocznianiu znakowanych tienkami zelaza (SPIO ) komorek musz^ budzic zachwyt i zdumienie. Natomiast wykorzystanie komorek macierzystych w leczeniu chorob uktadu nerwowego czy innych narz^dow jest nadal w fazie wczesnych prob i badan klinicznych, ktorych wyniki s^ co prawda zach^caj^ce, ale klinicznie nie w petni satysfakcjonuj^ce a leczenie obciqzone objawami niepoz^danymi. Jest oczywistym, ze dia zastosowania komorek macierzystych w leczeniu chorob OUN u ludzi konieczne jest nieinwazyjne monitorowanie tkankowej biodystrybucji tych komorek. Tak wi^c poszukiwanie nowych jak i weryfikacja istniej^cych metod obrazowania komorkowego MR i wykorzystania komorek 1

2 macierzystych do leczenia chorob uktadu nena^owego jest zadaniem waznym i z naukowego punktu widzenia porywajqcym wyzwaniem. Gtownym celem Doktoranta bylo dopracowanie i udoskonalenie technik utatwiaj^cych nieinwazyjne obrazowanie przeszczepionych do osrodkowego uktadu nerwowego komorek macierzystych. Celami szczegotowymi byto: 1. Opracowanie metody magnetycznego znakowania komorek macierzystych nie wymagaj^cej zaktadania hodowli komorkowych 2. Ocena przydatnosci MRI dia dtugotrwatego sledzenia komorek macierzystych znakowanych nanocz^steczkami tienku zelaza 3. Opracowanie metody skutecznego, monitorowanego obrazem dostarczenia komorek macierzystych do uszkodzonego/ zniszczonego obszaru mozgu Cele szczegotowe sq syntetycznie przedstawionymi celami kolejnych prac stanowi^cych rozprawy doktorsk^. W pierwszej pracy Doktorant przedstawil szczegolowo metodyk^ znakowania tienkiem zelaza hodowanych in vitro roznych linii komorkowych zarowno pochodzenia zwierz^cego (mysz, szczur) jak i ludzkich. Osi^gni^cie przez Doktoranta znakomitych wynikow zywotnosci, zdolnosci proliferacyjnych znakowanych komorek oraz wysokiej wydajnosci znakowania jest rezultatem oryginalnego opracowania parametrow procesu magnetoelektroporacji. Autor nie poprzestat wyl^cznie na opracowaniu techniki znakowania tienkiem zelaza (Feridex) komorek macierzystych zwierz^cych in vitro lecz zbadat takze jak znakowane komorki macierzyste szpiku ludzkiego roznicujq si^ w wybrane linie komorkowe takie jak komorki tkanki tluszczowej, kostnej czy w neurony. Zastosowane immune- i histo-chemiczne metody identyfikacji post mortem wszczepionych do striatum znakowanych komorek pozwolity zarowno na identyfikacji tych komorek zawieraj^cych Feridex jak i tych, ktore pozbyty si^ go w tkance, lecz byty pochodzenia zewn^trznego Niew^tpliwym osi^gni^ciem autora jest takze interesuj^ca propozycja wyjasnienia mechanizmu internalizacji tienku zelaza przez komork^ mimo zastosowania napiecia 2-3 razy nizszego ( 130mV) niz stosowane w klasycznym transfekowaniu DNA. Wg autora szybkosc (od 5-15 min) i prostota zabiegu znakowania komorek opracowan^ technik^ magnetoelektroporacji oraz brak wpfywu tej metody na zdolnosci proliferacji i roznicowania si^ komorek macierzystych (takze ludzkich) stwarzaj^ potencjaln^ mozliwosc wykorzystania tej techniki w celach klinicznych ^ zwlaszcza, ze stosowany do znakowania komorek Feridex byl srodkiem kontrastowym zaaprobowanym przez FDA do celow klinicznych. Niestety Feridex zostat wycofany z produkcji w 2008 roku i w chwili obecnej nie ma na rynku zadnego kontrastu SPIO (zreszt^ USPIO takze) stosowanego klinicznie. Tak wi^c wniosek drugi z pierwszej pracy w czasie gdy ona powstawate byt uzasadniony, natomiast

3 nie powinien lub nawet nie moze bye powtorzony jako wniosek rozprawy doktorskiej ztozonej w 2012 roku. W materiale i metodzie pierwszej z prae nie znalaztem informaeji na ilu zwierz^taeli wykonano eksperyment In vivo, jak wynika z dyskusji byfy to 4 myszy. Niezaleznie od interesuj^eyeh wynikow mam wqtpliwosei ezy na podstawie tak matej liezby mozna wyei^gac wi^zqee wnioski. Badanie MR jest od kilku lat wykorzystywane w modelaeh doswiadezalnyeh do sledzenia przeszezepionyeh komorek maeierzystyeh znakowanyeh magnetyeznie m.in. w chorobaeh dysmielinizaeyjnych i demielinizaeyjnyeh. W publikaeji b^d^eej drug^ ez^seiq rozprawy doktorskiej Doktorant wykorzystal znakowane tienkiem zelaza komorki do leezenia postaei ostrej i przewlektej ehoroby dysmielinizacyjnej na modelu mysim. Sehorzenie to i jego etiologia s^ dobrze znane, jednak brak jak dotychezas skuteeznyeh metod jego leezenia. DIatego proba wykorzystania do tego eelu linii CI 7.2 mysieh komorek maeierzystyeh, transfekowanych genem LaeZ w eelu sledzenia ich losu w preparataeh histologieznyeh oraz znakowanyeh Feridexem w eelu sledzenia ich losu z wykorzystaniem MR, jest jak najbardziej uzasadniona i stanowi wazne z naukowego i klinicznego punktu widzenia zadanie badawcze. Metodyka pracy jak i dobor modelu schorzenia s^ dogt^bnie przemyslane. Obrazy MRI korelowaty z obrazami histopatologicznymi do 6. dnia doswiadczenia. Nast^pnie w badaniu MR sygnal wykorzystanego do znakowania komorek kontrastu gwattownie zanikai, natomiast kontrast ten byt nadal widoczny w preparataeh histologieznyeh. W obrazach histologieznyeh zelazo byto widoczne w komorkach potomnych przeszezepionyeh komorek macierzystych co wg Doktoranta doprowadzito do tak znacznego rozciehezenia kontrastu iz sygnal MR zanikal. Po dwoch tygodniach po przeszczepieniu komorek macierzystych w preparataeh histologieznyeh Feridex byt widoczny w miejscu podania takze poza komorkami. Te pozakomorkowo potozone ez^stki Feridexu mogly pochodzic z martwych komorek macierzystych lub mogty bye aktywnie wydalone przez zywe komorki. W tej pracy (opublikowanej w 2007r) zastosowano znakowanie komorek metody 24 godzinnej inkubaeji z Feridexem, a nie opracowan^ i uznan^ za znakomit^ w pierwszej pracy (opublikowanej w 2005r) magnetoelektroporacji. Nasuwa to pytanie diaczego? Czy diatego, ze metoda magnetoelektro / sonoporaeji cechuje si^ jednak wysok^ smiertelnosci^ komorek oraz koniecznosci^ kazdorazowego jej optymalizowania w zaieznosci od zastosowanych komorek. Nie jest wi^c taka obiecuj^ca jak wynikato z pierwszej pracy?. Na wysok^ smiertelnosc komorek macierzystych znakowanych technik^ elektropracji zwracal zreszt^ juz wezesniej uwag^ m.in. przez zespot kierowany przez Darlup-Link. Moim zdaniem najwi^kszym osi^gni^ciem Doktoranta w tej publikaeji jest wykazanie, iz technika znakowania komorek maeierzystyeh tienkiem zelaza w celu sledzenia ich losu w organizmie gospodarza za pomoc^ badania MR ma istotne ograniezenia i nie moze bye wykorzystana w eksperymentach dtugotrwatych lub z

4 uzyciem komorek dziel^cych si^ szybko i/lub asymetrycznie oraz komorek o aktywnym metabolizmie co jest charakterystyczne dia linii uniesmiertelnionych komorek macierzystych. Jak wynika z przedstawionych rezultatow nie udalo si^ osi^gn^c zamierzonego celu tzn. poprawic stanu klinicznego uzytych do eksperymentu myszy z chorobq dysmielinizacyjn^. W trzeciej pracy Doktorant zaj^l si istotnym zagadnieniem dostarczenia znakowanych komorek macierzystych do uszkodzonych cz^sci mozgowia. Najmniej traumatyczna technika jakq byto podanie dozylne zwi^zana byla z duz^ strata podanych komorek w sledzionie i w^trobie diatego Doktorant zastosowat podanie do t^tnicy szyjnej wspolnej po uprzednim wyt^czeniu z kr^zenia t. szyjnej zewn^trznej, t^tnic potylicznych i t. skrzydtowo-podniebiennej. Aby zwi^kszyc skutecznosc leczenia Doktorant zaproponowat genetyczn^ modyfikacj^ uniesmiertelnionych komorek macierzystych wyposazaj^c je w nadekspresj^ receptora adhezyjnego VLA-4 co zaowocowato istotnym wzrostem liezby komorek osi^gaj^cych zamierzony cel. Podobnie jak w poprzednich pracach Doktorant sledzit drog^ przemieszczania si^ znakowanych tienkiem zelaza komorek za pomocq rezonansu magnetycznego, ale tyiko w czasie do 30 minut po iniekcji. Tak wi^c obserwowany byl tyiko proces zasiedlania. Polemizowatabym z Doktorantem odnosnie zasadniczego celu trzeciej pracy podanego przez Doktoranta, ktory na stronie 7. rozprawy doktorskiej stwierdzil, ze ostatnia, trzecia cz^sc rozprawy skupia si^ na praktycznym zastosowaniu technologii obrazowania komorkowego i celem tej pracy byto opracowanie metody dot^tniczego podawania komorek macierzystych". Zgadzam si^ z celem jednak nie widz^ owego skupienia si^ na obrazowaniu. Z pracy nie wynika, iz Doktorant stosowat rozne parametry akwizycji w badaniu MR w celu poszukiwania optymalnych. ' - W cz^sci kohcowej rozprawy doktorskiej Doktorant przedstawil wnioski kohcowe (Final Conclusions), ktore s^ prawie dostownym powtorzeniem wnioskow z poszczegolnych prac. Jednak pierwsz^ prac^ opublikowano w 2005, a drug^ w 2007 roku i od tego czasu wiedza w rozpatrywanym przedmiocie ulegia zmianie. Tak wi^c wnioski kohcowe (Final coclusions) rozprawy doktorskiej moim zdaniem powinny bye dostosowane do stanu wiedzy z roku 2011 i bye wnioskami z rozprawy doktorskiej skladajqcej si^ z trzech publikaeji, a nie przepisaniem wnioskow z publikaeji sprzed kilku lat. Bytoby bardzo interesuj^eym i pozytecznym gdyby Doktorant w czasie publicznej obrony przedstawil wnioski z rozprawy doktorskiej. Wniosek 1.2 (z pierwszej pracy),ze znakowanie komorek moze bye wykonane zaaprobowanym przez FDA Feridexem pozwala uznac metody za potencjalnie kliniczn^ byl niew^tpliwie uprawomoeniony w roku 2005 ale dzisiaj, kiedy na rynku nie ma praktyeznie zadnych kontrastow SPIO (USPIO zresztq tez) jest raczej zyezeniem niz wnloskiem.. 4

5 Takze wniosek 1.3 aczkolwiek zawiera prawdziwe stwierdzenie nie wynika bezposrednio z przeprowadzonych przez Doktoranta i przedstawionycli w pracy badan i wynikow. to tyiko sugestie odnosnie ewentualnego zastosowania innych zwi^zkow kontrastowych np. o wi^kszych cz^steczkach, a nie wniosek oparty o uzyskane przez doktoranta rezultaty. Do wnioskow wkradt si^ bl^d numerowania, trzecia grupa wnioskow zamiast pierwszej cyfry 3 ma 1 jak wnioski grupy pierwszej. Natomiast uzyskane w trzeciej pracy rezultaty staty si^ podstaw^ sformutowanania trzech poprawnych wnioskow, ktore oczywiscie (praca opublikowana w 2012 ) s^ aktualne i stusznie znalazly si^ we wnioskach rozprawy doktorskiej. Reasumuj^c przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska sktada si^ z trzech interesuj^cych, wartosciowych prac opubiikowanych w renomowanych czasopismach. Wartosc kazdej z tych prac oceniam bardzo wysoko. Natomiast -jak juz napisatam wezesniej - prace te nie stworzyty spojnej catosci jak^ powinna si^ cechowac rozprawa doktorska. Uwazam, ze w pracy brakuje szerszego omowienia przedstawianych zagadnieh z wnioskami aktualnymi teraz w roku 2011 czy 2012 a nie w Przedstawione uwagi nie zmieniaj^ mojej pozytywnej oceny przedstawionej mi do recenzji pracy. Uwazam, ze przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska lekarza Piotra Walczaka Nieinwazyjne obrazowanie komorkowe jako narz^dzie przyspieszaj^ce post^p w dziedzinie terapii komorkowej chorob uktadu nerwowego" spetnia wymogi stawiane rozprawom doktorskim. DIatego wnosz^ do Wysokiej Rady Wydziatu Nauk Medycznych Uniwersytetu Warmihsko-Mazurskiego w Olsztynie o dopuszczenie lekarza Piotra Walczaka do dalszych etapow przewodu doktorskiego. Gliwice, dr hab. n. med. Barbara Bobek-Billewicz profesor Centrum Onkologii-Instytutu