Klinika Ortopedii Dziecięcej Katedry Ortopedii Dziecięcej UM w Lublinie

Transkrypt

1 1 Szymon Skwarcz Klinika Ortopedii Dziecięcej Katedry Ortopedii Dziecięcej UM w Lublinie Wpływ aktywowanego autologicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) oraz fosforanu trójwapniowego hydroksyapatytu na gojenie ubytków kostnych w badaniach doświadczalnych na modelu zwierzęcym Streszczenie WSTĘP: Przebudowa tkanki kostnej jest złożonym procesem, w którym poza wymienionymi komórkami kości: osteoblastami, osteoklastami i osteocytami, biorą udział także pochodzące ze szpiku kostnego komórki limfoidalne, monocyty, makrofagi i komórki tuczne. Proces regeneracji tkanki kostnej podlega ogólnoustrojowej i lokalnej regulacji. Za lokalną regulację procesu regeneracji tkanki kostnej odpowiadają cytokiny, które wpływają na aktywację i różnicowanie komórek tkanki kostnej oraz rekrutację prekursorów proliferacji. Ziarnistości α płytek krwi w procesie aktywacji uwalniają: białka adhezyjne (m.in. fibrynogen, fibronektyna, czynnik von Willebranda), białka biorące udział w krzepnięciu i fibrynolizie (m.in. plazminogen, α2-antyplazmina, a2-makroglobulina, tkankowy aktywator plazminogenu), enzymy proteolityczne (MMP-4, TIMP-4), białka antybakteryjne (m.in. trombocydyny) oraz substancje mitogenne m.in.: płytkopochodny czynnik wzrostu PDGF, który wspomaga m.in. naprawę uszkodzeń naczyń, transformujący czynnik wzrostu - TGF-β (β1, β2), który bierze udział m.in. w agregacji płytek krwi, czynnik wzrostu śródbłonka (VEGF), czynnik płytkowy PF4, interleukinę-1, czynnik wzrostu naskórka EGF, czynnik wzrostu fibroblastów FGF, insulinopodobny czynnik wzrostu IGF-1 oraz BMP. Szeroko stosowaną metodą uzupełniania deficytów tkanki kostnej jest wypełnianie ich przeszczepami kostnymi autologicznymi, które są pobierane od pacjenta z deficytem tkanki kostnej lub substytutami kostnymi. CEL PRACY: Celem niniejszej pracy jest ocena wpływu autologicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) oraz fosforanu trójwapniowego (80%) hydroksyapatytu (20%) (BoneSave Stryker) na wspomaganie gojenia unikortykalnych, eksperymentalnych ubytków

2 2 kostnych w obrębie kości udowych królika oraz ocena przydatności stosowanych metod badawczych: radiologii klasycznej, densytometrii, badań mikro-ct, badań wytrzymałościowych oraz oceny histologicznej. MATERIAŁ I METODY: Badanie zostało przeprowadzone na modelu zwierzęcym po uzyskaniu niezbędnych zgód zgodnie z obowiązującymi przepisami. W pracy zostało użytych 36 królików rasy Termondzkiej białej, które podzielono na 3 grupy (A,B,C) po 12 zwierząt w każdej. We wszystkich grupach (A, B, C) badane preparaty były umieszczane w eksperymentalnych ubytkach trzonów prawych kości udowych (oznaczone w pracy symbolem P ), zaś lewe kości udowe (oznaczone w pracy symbolem L ) stanowiły grupę kontrolną, w której wytworzone ubytki pozostawiane były bez wypełnienia. W grupie A do prawych kości udowych oznaczonych symbolem P w miejsce wytwarzanego ubytku podawano preparat fosforanu trójwapniowego (80%) hydroksyapatytu (20%) (BoneSave Stryker) w ilości 100 mg. W grupie B do prawych kości udowych oznaczonych symbolem P w miejsce wytwarzanego ubytku podawano preparat aktywowanego, autologicznego osocza bogatopłytkowego (PRP) w ilości 0,7 ml. W grupie C do prawych kości udowych oznaczonych symbolem P w miejsce wytwarzanego ubytku podawano preparat fosforanu trójwapniowego (80%) hydroksyapatytu (20%) (BoneSave Stryker) w ilości 100 mg nasączonego w 0,7 ml preparatu aktywowanego, autologicznego osocza bogatopłytkowego (PRP). Na początku i na końcu doświadczenia pobierano krew na badania laboratoryjne i oznaczano poziom płytek we krwi obwodowej i w preparacie PRP, poziom osteokalcyny oraz izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej. Zakończenie doświadczenia we wszystkich grupach nastąpiło po 8 tygodniach (56. dobie) po wykonaniu zabiegów. Po uśmierceniu zwierząt pobierano preparaty kości udowych, które poddawano ocenie: radiologicznej (zdjęcie RTG wykonywane co 7 dni), densytometrycznej, morfologicznej, mikro-ct, biomechanicznej (test trójpunktowy) i histologicznej. WYNIKI: Analiza zdjęć RTG: U wszystkich osobników w grupach kontrolnych (AL, BL, CL) w ośmiotygodniowym przebiegu doświadczenia zaobserwowano stopniowe wypełnianie się ubytków oraz powstanie niewielkiego odczynu okostnowego. W grupach badanych AP i CP charakterystyczne było powstanie dość obfitego odczynu okostnowego z poszerzeniem wymiarów kości w miejscu wytwarzanego defektu. Ponadto zanotowano niewielkie zatarcie struktury materiału. W grupie badanej BP stwierdzono wystąpienie odczynu okostnowego w miejscu ubytków, nieco mniejsze niż w grupach AP i CP. Fakt radiologicznego poszerzenia obrysu kości w miejscu ubytków w prawych kościach udowych świadczy o

3 3 osteoindukcyjncyh właściwościach zastosowanego preparatu kościozastępczego jako samodzielnego wypełnienia (grupa A) oraz łącznie z PRP (grupa C), a także o podobnych, korzystnych właściwościach preparatu PRP. Wyniki badań laboratoryjnych: Oznaczony poziom płytek w krwi pełnej w dniu 0. jak i poziom ich zagęszczenia w preparacie PRP nie różnił się istotnie statystycznie pomiędzy grupami B (4,36) i C (4,46). Oznaczone w przebiegu badania poziomy markerów obrotu kostnego: osteokalcyny i izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej (ALP ie-kosntny) wydają się być nieprzydatne do monitorowania gojenia ubytków kostnych. Pomimo dołożenia wszelkich starań co do prawidłowego doboru zwierząt w zakresie masy i wieku, jak i stałej metodyki laboratoryjnej, ich poziomy oznaczone w dniu 0. różniły się istotnie statystycznie pomiędzy grupami, co świadczyć może o dużej zmienności w ich fizjologicznym stężeniu u królików. Ponadto we wszystkich badanych grupach doszło do istotnie statystycznego spadku ich poziomu związanego prawdopodobnie z metaboliczną burzą w związku z rosnącym szkieletem dorastających królików. Wyniki badań densytometrycznych: W grupie A i B nie wykazano istotnych statystycznie różnic pomiędzy kością prawą i lewą w zakresie gęstości mineralnej kości (BMD, BMD-FR) oraz wartość masy kostnej (BMC, BMC-FR), w grupie C średnia wartość wspomnianych parametrów była istotnie statystycznie większa po stronie prawej. Porównując jednak wskaźniki densytometryczne w grupie A i C, w której również zastosowano preparat kościozastępczy nie wykazano istotnej statystycznie różnicy w porównaniu ich różnic pomiędzy kością prawą i lewą (Delta BMD, Delta BMD-FR, Delta BMC, Delta BMC-FR). Badanie densytometryczne w warunkach mojego doświadczenia jest metodą nieprzydatną do oceny gojenia wytwarzanych ubytków kostnych. Ocena makroskopowa kości: Zaobserwowane poszerzenie prostopadłych do siebie wymiarów kości w strefie ubytku we wszystkich grupach badanych w stosunku do grup kontrolnych oraz istotnie statystycznie większą różnicę wymiaru X i Y pomiędzy kością prawą i lewą (Delta-X, Delta-Y) w grupie A niż w grupie B i C. Te obserwacje dowodzić mogą pośrednio osteoindukcyjnego działania preparatu BoneSave w grupie AP i CP i kościotwórczemu wpływowi preparatu PRP na badaną strefę (grupa B) oraz o istotnym statystycznie ujemnym wpływie PRP na poszerzenie wymiarów kości w strefie ubytków (grupa C).

4 4 Wyniki badań mikro-ct: W grupach A i C zanotowano statystycznie istotne zwiększenie kościotworzenia (Vb 2 ) w miejscu ubytku w grupie badanej (prawe kości) w porównaniu do grupy kontrolnej (lewe kości). W grupie B zaobserwowano zwiększenie objętości młodej kości w miejscu ubytku (Vc 2, Vb 2 ). Nie zaobserwowano korzyści płynących z uzupełnienia terapii preparatem kościozastępczym autologicznym preparatem osocza bogatopłytkowego w zakresie objętości kości w miejscu ubytku, natomiast porównując z grupą A wyniki badań badanych preparatów prawych kości w grupie C zaobserwowano większy udział frakcji tkanki kostnej o wyższej gęstości (Vc 1 Vb 1 ) oraz mniejszy udział frakcji tkanki kostnej o niższej gęstości (Vc 2, Vb 2 ). Ponadto porównując w grupie A i C różnice (Delta) w objętościach badanych frakcji kostnych pomiędzy kością prawą i lewą w grupie C wykazano istotne statystycznie większą objętość frakcji tkanki o wysokiej gęstości w obrębie sroi (Vb 1 ). Wyniki badań wytrzymałościowych: W grupie A i C wykazano korzystny wpływ wynikający z zastosowanego preparatu kościozastępczego na maksymalną siłę [F max] i pracę [W] niezbędną do przełamania kości w teście trójpunktowego zginania, potwierdzając biomechanicznie korzystny wpływ stosowania preparatów hydroksyapatytu wapnia w uzupełnianiu ubytków kości. Jednocześnie, w porównaniu do preparatów z grupy kontrolnej BL wykazano istotny statystycznie, negatywny wpływ PRP na wytrzymałość tkanki kostnej [F max] stosując je jako samodzielną metodę wspomagania gojenia ubytków kostnych (grupa BP), a w połączeniu z preparatem kościozastępczym (grupa C), w porównaniu do grupy A, gdzie podano wyłącznie preparat BoneSave, nie wykazano statystycznej korzyści płynącej z dodania PRP w zakresie różnic [Delta F-max, Delta-W] pomiędzy prawą i lewą kością. Ocena histopatologiczna: W ocenie histopatologicznej preparatów z grup kontrolnych (A preparat L, B preparat L, C preparat L) zaobserwowano całkowite wypełnienie wytworzonych eksperymentalnie ubytków przez nieregularną, osteoidalną tkankę z odszpikowym pogrubieniem bez wyraźnego zewnątrzkorowego pogrubienia pierwotnej warstwy korowej oraz bez śródszpikowych ognisk kościotworzenia w strefie ubytku. W preparatach histopatologicznych pobranych z grupy badanej A kość P obserwowane bezpostaciowe masy preparatu BoneSave, zarówno w warstwie korowej jak i w strefie środszpikowej, otoczone były dość obfitą tkanką osteoidalną. W preparatach z grupy B kość P zaobserwowano wyraźne, zewnątrzkorowe kościotworzenie z wytworzeniem wtórnej jamy szpikowej. Nie zaobserwowano natomiast powstania śródszpikowej tkanki osteiodalnej ani w obrębie jamy szpikowej pierwotnej, ani wtórnej. Preparaty z grupy C kość P cechowały się, poza obfitym

5 5 zewnątrzkorowym kościotworzeniem w postaci nawarstwienia na pierwotnej warstwie korowej, bez powstawania wtórnej jamy szpikowej, oraz śródkorowymi polami tkanki osteoidalnej skupionymi wokół preparatu kościozastępczego, a także obfitym, śródszpikowym kościotworzeniem wokół bezpostaciowych drobin preparatu. To kościotworzenie, zarówno w warstwie korowej jak i w strefie jamy szpikowej, zdawało się być bardziej obfite niż w preparatach z grupy badanej AP. WNIOSKI: 1. Fosforan trójwapniowy hydroksyapatytu stymuluje kościotworzenie w miejscu ubytków kości u zwierząt doświadczalnych (w ocenie radiologicznej, pomiarach makroskopowych, badaniach mikro-ct i badaniach histopatologicznych). 2. Autologiczne, aktywowane osocze bogatopłytkowe stosowane jako samodzielne wypełnienie eksperymentalnych ubytków kostnych: a. pobudza osteogenezę w strefie aplikacji preparatu (w ocenie radiologicznej, pomiarach makroskopowych, ocenie mikro-ct i ocenie histopatologicznej); b. osłabia właściwości biomechaniczne kości w badanej fazie gojenia. 3. Autologiczne, aktywowane osocze bogatopłytkowe połączone z fosforanem trójwapniowym hydroksyapatytu: a. wpływa korzystnie na mineralizację nowotworzonej tkanki kostnej zwiększając udział frakcji o wyższej gęstości w całkowitej objętości kości; b. nie wpływa na poprawę parametrów densytometrycznych, właściwości biomechaniczne i całkowitą objętość tkanki kostnej w strefie ubytków w porównaniu z izolowanym podaniem preparatu kościozastępczego. 4. Różnice stężeń izoenzymu kostnego fosfatazy zasadowej i osteokalcyny w surowicy krwi zwierząt doświadczalnych nie mogą być traktowane jako laboratoryjne wskaźniki dynamiki gojenia eksperymentalnych ubytków kości. 5. Zastosowanie badań mikro-ct w analizie gojenia ubytków kostnych stanowi przydatne narzędzie w jakościowej i ilościowej ocenie zmian objętości kości. 6. Badania nad wpływem PRP na gojenie tkanki kostnej wymagają standaryzacji metody przygotowywania i sposobu podawania PRP oraz opracowania modeli badawczych umożliwiających powtarzalną ocenę ich skuteczności.