Wydanie niniejszej publikacji zostało dofinansowane przez Komitet Bada Naukowych.

Transkrypt

1 ZWIERZTA LABORATORYJNE HODOWANE W ORODKACH NAUKOWYCH W POLSCE Zebrała i opracowała: Elbieta Krysiak Wydanie niniejszej publikacji zostało dofinansowane przez Komitet Bada Naukowych. Dzikujemy za pomoc techniczn w przygotowaniu i opublikowaniu materiałów instytucjom: Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej Curie, Warszawa Instytut Centrum Medycyny Dowiadczalnej i Klinicznej PAN, Warszawa

2 Opracowanie obecne jest trzecim wykazem zwierzt laboratoryjnych hodowanych w Polsce opracowanym z inicjatywy Komisji Biologii Zwierzt Dowiadczalnych Polskiej Akademii Nauk na podstawie materiałów uzyskanych z ankiet rozesłanych do znanych nam orodków. Opracowanie to pomylane jest jako ródło informacji, gdzie i jakie zwierzta laboratoryjne s hodowane i dostpne do bada dowiadczalnych w kraju. Stwierdzone pewne luki i zaniedbania w stosowanym nazewnictwie, jak te niedobory w wiedzy o kontroli genetycznej i statusie zdrowotnym zwierzt, skłoniły nas do wyposaenia obecnego wykazu w przedstawione w formie krótkich artykułów podstawowe informacje z tego zakresu. Opracowanie zawiera równie wykaz instytucji oraz standardowe skróty, uprzednio przyjte lub zaproponowane obecnie, dotyczce ich nazw lub nazwisk osób hodujcych zwierzta. Te standardowe skróty kody powinny by uywane zgodnie z zaleceniami Midzynarodowego Komitetu ds. Standaryzacji Genetycznego Nazewnictwa Zwierzt Laboratoryjnych do oznaczania podszczepów i do tworzenia symboli stad niekrewniaczych. Opracowanie podobnie jak poprzednie wykazy składa si z tabel, w których wymienione s szczepy wsobne i kongeniczne, stada niekrewniacze myszy i szczurów, myszy transgeniczne oraz inne gatunki zwierzt laboratoryjnych hodowanych w Polsce. W tabelach podano równie informacje o pochodzeniu zwierzt, liczbie pokole, systemie kojarze, stosowanych metodach kontroli genetycznej i zdrowotnej. Mamy nadziej, e opracowanie to przyczyni si do dalszego uporzdkowania opisu zwierzt przeznaczonych do bada dowiadczalnych, tak aby dane te zbliyły si do wymaga wiatowych. Przewodniczca Komisji Biologii Zwierzt Dowiadczalnych PAN Prof. Alina Czarnomska Nazewnictwo najczciej uywanych modeli zwierzt laboratoryjnych. 2

3 Alina Czarnomska, Jadwiga Bryliska Obserwowana w Polsce dua dowolno w posługiwaniu si i brak zrozumienia sensu symboli nadawanych zwierztom laboratoryjnym skłania do przypomnienia reguł obowizujcych w tym zakresie. Próby ujednolicenia nazewnictwa, pocztkowo tylko szczepów wsobnych myszy, sigaj roku W Polsce opracowania majce zapozna badaczy z obowizujcymi regułami podjto ju w latach siedemdziesitych [2,4]. Dziki staraniom ICLAS opracowano i opublikowano podobne zalecenia dotyczce stad niekrewniaczych [6]. W latach póniejszych w miar tworzenia coraz to nowych modeli zwierzt opracowywano reguły tworzenia take dla nich nazw i symboli. W obecnym opracowaniu pragniemy przypomnie zasady tworzenia i odczytywania symboli i nazw najczciej w Polsce uywanych myszy i szczurów laboratoryjnych. Nazewnictwo szczepów wsobnych myszy i szczurów Za szczep wsobny uwaamy grup zwierzt reprezentujcych jeden gatunek, charakteryzujcych si jednorodnoci genetyczn i homozygotycznoci. Pierwszy wykaz wsobnych szczepów myszy przygotowany zgodnie z ujednoliconymi zasadami mianownictwa opracowanymi przez Snella ukazał si w czasopimie Cancer Research w 1952 r. [3] Publikacja ta zawierała reguły dotyczce nadawania nazw szczepom wsobnym oraz wykaz symboli kodowych bdcych skrótem nazwisk osób lub nazw instytucji utrzymujcych te szczepy. Dalsze podobne wykazy publikowane były regularnie co cztery lata a do 1985 r. Zasady nazewnictwa wsobnych szczepów szczurów oparte na tych samych załoeniach co zasady nazewnictwa wsobnych szczepów myszy opublikowane zostały przez Festinga i Staats w 1973 r [7]. Według tych zasad szczep wsobny powinien by oznaczony jedn lub kilkoma duymi literami alfabetu łaciskiego Np. AKR, BALB/c, C3H, BN (myszy), AUG (August), LEW (Lewis), SHR (Spontaneous Hypertensive Rat), WAG (Wistar Albino Glaxo). Mieszace uzyskiwane ze skrzyowania dwóch szczepów wsobnych powinny według zasad mianownictwa opracowanych przez Staats w 1964 r. [14] zawiera w swoim symbolu informacj dotyczc ich pochodzenia. Na pierwszym miejscu umieszcza si zawsze symbol szczepu, z którego pochodzi samica a nastpnie rozdzielony znakiem x symbol szczepu samca uytego do kojarze. Oba zamyka si w nawiasie, po którym wpisuje si numer pokolenia. Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1 Przy oznaczaniu mieszaców uywa si te czsto symboli skróconych. Np. (C57BL/6 x DBA/2)F1 = B6D2F1 Podszczepy stanowi grupy zwierzt wyodrbnione ze szczepu wsobnego mogce si od niego róni genetycznie w wyniku działania czynników przypadkowych lub zamierzonych. Podszczep oznaczamy wprowadzajc do symbolu szczepu rodzicielskiego (wyjciowego) odpowiedni symbol podszczepu, który zwykle stanowi skrót (kod) nazwiska badacza lub nazwy orodka, w którym podszczep został wyhodowany. Kod ten powinien by wyraony jedn lub kilkoma literami, z których tylko pierwsza moe by liter du. Wyjtkowo dopuszcza si utrzymanie tradycyjnego oznaczenia jako symbolu podszczepu cyfry lub małej litery np. DBA/1 i DBA/2, BALB/c. Przykłady oznaczania podszczepów: 3

4 C3H/W, CBA/Kw, CFW/Han W pimiennictwie spotka mona czasem nazwy podszczepów ze złoonymi symbolami kodowymi, co pozwala na odtworzenie pochodzenia danego podszczepu. Np.: C3H/AW podszczep hodowany w Centrum Onkologii w Warszawie (W) sprowadzony z Instytutu Raka w Amsterdamie (A) CBA/KwHan podszczep hodowany w Hanowerze (Han) sprowadzony z Zakładu Genetyki Uniwersytetu Jagielloskiego w Krakowie (Kw) Nazewnictwo szczepów kongenicznych i koizogenicznych Dwie linie szczepu wsobnego rónice si jednym zmutowanym genem okrelane s jako pary koizogeniczne. Natomiast szczepy kongeniczne róni si krótkim odcinkiem jednego chromosomu a otrzymuje si je na drodze szeregu krzyówek genetycznych połczonych z równoczesn selekcj. Jeli rónica midzy dwoma szczepami kongenicznymi dotyczy odcinka chromosomu zawierajcego locus zgodnoci tkankowej, szczepy te nazywamy kongenicznie opornymi CR (congenic resistant). Zwierzta z takich dwóch szczepów odrzucaj wzajemnie swoje przeszczepy tkankowe. Zasady nazewnictwa stosowanego dla szczepów CR opracował ich twórca Snell w 1958 r. [13] a opublikował J.Klein w 1973 r. [9] razem z wykazem dostpnych w owym czasie szczepów CR. Szczep kongeniczny oznaczamy symbolem złoonym z dwóch czci przedzielonych kropk lub kresk poziom. Cz pierwsz stanowi pełny lub skrócony symbol szczepu tła genetycznego. Cz druga zawiera skrócony symbol szczepu lub stada dawcy, albo te symbol okrelajcy gen wprowadzony ze szczepu dawcy. W przypadku szczepów koizogenicznych w czci drugiej symbolu podaje si nazw locus, w którym nastpiła mutacja. Przykłady: B10.A - szczep tła C57BL/10 (B10), szczep dawca A C3H.B10 - szczep tła C3H, szczep dawca C57BL/10 (B10) C57BL/10-H-2 d - szczep róni si od szczepu tła haplotypem: H-2 d C3H-p - szczep róni si od szczepu tła genem: p C57BL/6J-ob - szczep róni si od szczepu tła genem: ob Nazewnictwo szczepów wsobnych rekombinacyjnych (RIS Recombinant Inbred Strains) Seri szczepów wsobnych rekombinacyjnych stanowi zbiór szczepów wyhodowanych z losowo skojarzonych par zwierzt wybranych z drugiego pokolenia mieszaców z krzyówki midzy dwoma znanymi szczepami wsobnymi nazywanymi tu szczepami przodków (progenitor strains) charakteryzujcymi si odpowiednio brakiem lub ekspresj badanej cechy. Kady nowy szczep RIS jest homozygotyczny w stosunku do jednego z dwóch alleli wniesionych przez przodków we wszystkich loci, w których przodkowie rónili si. W ten sposób w wyniku losowej rekombinacji niesprzonych loci kady szczep z danej serii RIS ma własn szczególn kombinacj materiału genetycznego pochodzcego od obu szczepów rodzicielskich. Pierwsz seri szczepów wsobnych rekombinacyjnych wyhodował Bailey w 1971 r. [1] z krzyówki BALB/c x C57BL/6 i oznaczył j symbolem CXB składajcym si ze skrótów nazw szczepów rodzicielskich rozdzielonych X. Ten system oznacze szczepów RIS przyjł si i jest obecnie powszechnie stosowany. Szczepy RIS stanowi doskonałe narzdzie do wykrywania nowych sprze i mapowania loci genetycznych warunkujcych cechy jednogenowe oraz do bada nad plejotropowym działaniem znanych genów (Swank i Bailey [15]). W ostatnich latach liczba serii szczepów RIS bardzo wzrosła. Nazewnictwo szczepów kongenicznych rekombinacyjnych (RCS Recombinant Congenic Strains) Szczepy te zostały wyhodowane i opisane w 1986 r. przez Demanta i Harta [5]. Pomylane s jako narzdzie do badania uwarunkowanych genetycznie cech ilociowych kontrolowanych przez kilka współdziałajcych (addytywnych) genów. Do 4

5 takich cech zalicza si midzy innymi oporno i podatno na nowotwory. Schemat kojarze i charakterystyk tych zwierzt opisano m.in. w publikacji Demanta i Harta [5]. Dla oznaczania zwierzt pochodzcych ze szczepów RCS Demant i Hart wprowadzili nastpujce symbole np.: seria linii pochodzcych z krzyówki myszy BALB/c x STS oznaczona została symbolem CcS składajcym si ze skrótów nazw szczepów rodzicielskich (C=BALB/c, S=STS) rozdzielonych mał liter c. Dla okrelenia poszczególnych linii w danej serii zastosowano kolejne liczby np. CcS-1, CcS-2, CcS- 17. Zwierzta transgeniczne Wydaje si, e sporód wielu modeli wyhodowanych do bada biomedycznych zwierzta transgeniczne spełniaj wieloletnie denie, aby do badania rónych schorze nkajcych człowieka uzyska modele wykazujce taki sam mechanizm procesu chorobowego. Udane próby przenoszenia materiału genetycznego midzy rónymi komórkami zachciły do podjcia bada nad opracowaniem metody pozwalajcej na otrzymanie osobnika, który we wszystkich komórkach posiadałby obcy materiał genetyczny. Metod tak, polegajc na mikrochirurgicznym wprowadzeniu odcinków DNA zawierajcych jeden badany gen do przedjdrza mskiego zapłodnionych jaj myszy, opracowali Palmiter i Brinster w 1982 r. i 1985 r. [11,12]. Ten udany eksperyment otworzył nowe moliwoci. Do chwili obecnej opracowujc i stosujc róne nowe metody wyhodowano ju wiele rónych linii myszy transgenicznych; pozwoliło to na wyjanienie mechanizmów licznych procesów biologicznych, których nie udawało si pozna dotychczas stosowanymi metodami. Pierwsz prób wprowadzenia standardowej nomenklatury dla myszy transgenicznych był system zaproponowany przez Institute of Laboratory Animal Resources, opublikowany w ILAR News w 1992 r. [8]. Proponowany symbol składa si z nastpujcych czci: TgN(xxxxx)#Bri gdzie: Tg wskazuje, e linia myszy jest transgeniczna N transgen został wprowadzony przez niehomologiczn wstawk (xxxxx) oznaczenie wstawki # - kolejny numer danej linii Bri kod laboratorium, w którym otrzymano dan lini myszy Przykład: TgN(Mt1TK)1Bri Oznaczenie to informuje, e linia myszy jest transgeniczna (Tg), wstawka jest niehomologiczna (N), integrowany gen zawiera sekwencje regulatorowe mysiej metallothioneiny (Mt1) oraz gen strukturalny wirusowej kinazy tymidynowej (TK), myszy wyhodowano w laboratorium Brinstera (Bri) i jest to pierwsza linia transgeniczna w tym laboratorium oznaczona nazw standardow. Nazewnictwo stad niekrewniaczych Zasady ujednoliconego nazewnictwa stad niekrewniaczych (outbred stocks) zostały opublikowane po raz pierwszy w 1972 r. przez Festinga i wsp. [6] a pierwszy wykaz zarejestrowanych stad opracował Loosli w 1974 r. [10]. Stado kadego gatunku ssaków laboratoryjnych hodowane co najmniej przez 4 pokolenia w zamknitej populacji z maksymalnym unikaniem kojarze krewniaczych moe zosta zarejestrowane i otrzyma swój symbol. Jest to jednak moliwe tylko wtedy, kiedy stosowany system kojarze gwarantuje utrzymywanie zmiennoci biologicznej stada przez szereg lat na takim samym poziomie. Za stado uzna mona: 5

6 Uprzednio wsobny szczep po czterech pokoleniach hodowli systemem kojarze z unikaniem pokrewiestwa, jeli system ten był zamierzony i ma by kontynuowany Mieszace F1 dwóch rónych szczepów wsobnych Syntetyczne, heterozygotyczne populacje pochodzce z mieszaców F1, wzgldnie segregujce mieszace F2, pod warunkiem, e bd stale odtwarzane z wyjciowych szczepów wsobnych Odpowiednia wielko zamknitej populacji oraz stosowanie okrelonych systemów kojarze stad niekrewniaczych s niezbdnymi elementami charakterystyki stada. Niedopuszczalne jest prowadzenie jakiejkolwiek kierunkowej selekcji. Symbol stada powinien składa si z 2 4 duych liter poprzedzonych kodem hodowcy lub orodka, w którym stado jest utrzymywane. Kod składajcy si z 1 3 liter, z których tylko pierwsza jest dua, oddzielony jest dwukropkiem od symbolu stada. Przykłady: Han:NMRI Ssc:AH Najwaniejszym znakiem rozpoznawczym dla odrónienia symbolu szczepu wsobnego od symbolu stada niekrewniaczego jest kod hodowcy umieszczony przed symbolem stada i oddzielony od niego dwukropkiem. Zasady oznaczania stanu zdrowotnego zwierzt laboratoryjnych Zwierzta laboratoryjne nie tylko te, u których wystpuj łatwo wykrywalne objawy choroby ale równie bezobjawowi nosiciele zakae patogennych nie nadaj si do dowiadcze, szczególnie do dowiadcze biomedycznych. Bezobjawowe zakaenia mikroorganizmami chorobotwórczymi mog znacznie skomplikowa interpretacj wyników bada lub je wrcz zafałszowa. Majc na celu wyeliminowanie takich zagroe opracowano przy współudziale organizacji midzynarodowych (WHO World Health Organization, FAO Food and Agriculture Organization, ILAR - Institute for Laboratory Animal Resources, ICLAS International Council for Laboratory Animal Science) nastpujc kategoryzacj zwierzt laboratoryjnych: 1. Zwierzta gnotobiotyczne: germ free (GF) - wolne od wszystkich wykrywalnych mikroorganizmów i pasoytów monobionty zwierzta GF celowo zasiedlone jednym, dibionty dwoma lub wieloma okrelonymi rodzajami polibionty mikroorganizmów 2. Zwierzta SPF (Specified Pathogen Free) 3. Zwierzta konwencjonalne CV-I kontrolowane, utrzymywane w warunkach czciowej izolacji (semi barrier condition) CV hodowla otwarta Opracowano te wykazy mikroorganizmów, które powinny by wykluczone u zwierzt danej kategorii i gatunku. Odrbnym zagadnieniem w dziedzinie nazewnictwa zwierzt laboratoryjnych jest oznaczanie odpowiednimi symbolami ich stanu zdrowotnego. Wyróniajc si okrelonymi właciwociami rodowiskowymi a nie genetycznymi znajduj si właciwie poza zakresem działania Komitetu Standaryzacji Genetycznej Nomenklatury Myszy. Jednak wobec koniecznoci ustalenia dla nich zasad nazewnictwa grupa pracowników z Jackson Laboratory przedstawiła w 1967 r. pierwsz propozycj, która zasadniczo obowizuje i jest stosowana do dnia dzisiejszego. Uzgodnione z Towarzystwem Gnotobiotycznym zasady s nastpujce: Zalecono stosowanie symbolu GN dla zwierzt gnotobiotycznych, SPF dla zwierzt wolnych od wybranych specyficznych dla danego gatunku zakae, CV dla zwierzt konwencjonalnych. Symbolami SPF lub GN mona okrela tylko te zwierzta, które s pod stał kontrol mikrobiologiczn. Obok symbolu szczepu lub stada dodaje si w nawiasach kwadratowych nastpujce informacje: stan zdrowotny: CV, CV-I, SPF, GN 6

7 rok, w którym zwierzta przeszły do danej jednostki lub zostały przeprowadzone w stan gnotobiotyczny kod osób, które uzyskały dany stan zdrowotny zwierzt lub orodka, w którym zostało to dokonane. Przykład: BALB/c[SPF] WAG[SPF95W] CBA[GN72Lac] myszy szczepu CBA przeprowadzone w stan gnotobiotyczny w 1972 r. w Laboratory Animal Centre. Pimiennictwo: 1. Bailey D.W.: Recombinant inbred strains. Transplantation, 1971, 11, Bryliska J., Czarnomska A.: Zasady nazewnictwa zwierzt laboratoryjnych. Zwierzta Lab., 1979, 16 (1-2), Committee on Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Mice. Cancer Res., 1952, 12, Czarnomska A.: Mianownictwo wsobnych szczepów myszy laboratoryjnych. Zwierzta Lab., 1970, 8 (1-2), Demant P., Hart A.A.M.: Recombinant Congenic strains A new tool for analyzing genetic traits determined by more than one gene. Immunogenetics, 1986, 24, Festing M, Kondo K, Loosli R., Poiley S.M., Spiegel A.: International standardized nomenclature for outbred stocks of laboratory animals. ICLA Bulletin, 1972, 30, Festing M., Staats J.: Standardized Nomenclature for Inbred Strains of Rats. Transplantation,, 1973, 16, ILAR News, 1992, 34, 4, Klein J.: List of congenic lines of mice. Transplantation, 1973, 15, Loosli R.: Outbred stocks of laboratory animals: First European Listing. ICLA Bulletin, 1974, 35, Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., Traumbauer M.E., Rosenfeld M.G., Birnberg N.C., Evans R.M.: Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein- growth hormone fusion genes. Nature, 1982, 300, Palmiter R.D., Brinster R.L.: Transgenic mice. Cell, 1985, 41, Snell G.D.: Histocompatibility genes of the mouse: II. Production and analysis of isogenic resistant lines. J.N.C.I, 1958, 21, Staats J.: Standardized nomenclature for inbred strains of mice Third listing. Cancer Res., 1964, 24, Swank R.T., Bailey D.W.: Recombinant inbred lines: Value in the genetic analysis of biochemical variants. Science, 1973, 181,

8 Kontrola genetyczna zwierzt laboratoryjnych Alina Czarnomska, Marta Gajewska, Marek Woszczyski, Jadwiga Bryliska Podstawowymi wymaganiami, których spełnienie jest niezbdne aby wyniki bada z uyciem zwierzt laboratoryjnych były wiarygodne i powtarzalne s stałe, optymalne dla gatunku warunki rodowiskowe, odpowiedni stan higieniczny zwierzt oraz ich jako i jednorodno genetyczna. Dotychczas wyhodowano wiele szczepów wsobnych, stad niekrewniaczych oraz rónych specjalnych modeli zwierzt charakteryzujcych si unikatowym zestawem cech uwarunkowanych genetycznie stanowicych o ich przydatnoci do okrelonego typu dowiadcze i testów. Wybór właciwych zwierzt jest jednym z podstawowych czynników warunkujcych uzyskanie wartociowych i powtarzalnych wyników bada. Niezalene hodowle szczepów zwierzt w rónych orodkach naukowych doprowadziły do powstania szeregu podszczepów, które mimo stwierdzonych rónic genetycznych zachowały nazwy szczepów wyjciowych uzupełnione symbolem podszczepu [9]. Mimo cisłego przestrzegania zasad hodowli zawsze naley liczy si z moliwoci powstania i utrwalenia si mutacji. Osobnym zagadnieniem jest sprawa kontaminacji genetycznej, której najczstszymi przyczynami s: zła organizacja pracy w zwierztarni, braki w wyszkoleniu personelu, złe nawyki hodowlane, niewłaciwe prowadzenie dokumentacji oraz brak dozoru i kontroli. Wynikiem ewentualnych zmian genetycznych w najlepszym razie moe by zauwaalna przez hodowc zmiana cech fenotypowych takich jak np. kolor sierci. Jednak zmiana wikszoci genetycznie uwarunkowanych cech biologicznych czsto wykrywana jest dopiero w trakcie dowiadczenia, gdy wpływa na jego przebieg i w sposób istotny na jako otrzymanych wyników. W celu wczesnego wykrywania ewentualnych zmian genetycznych w populacji hodowanych zwierzt w wielu orodkach, równie krajowych, w latach osiemdziesitych zaczto wprowadza programy monitorowania genetycznego zwierzt dostosowane do potrzeb, zada i moliwoci orodka [3,4,13,14,15]. W praktyce genetyczne monitorowanie polega na kontroli utrzymania autentycznoci hodowanych szczepów. W zalenoci od stosowanych metod oznaczania oraz funkcji oznaczonych markerów podzielono je na kilka podstawowych grup: markery immunologiczne, biochemiczne, cytogenetyczne, morfologiczne oraz stosowane ostatnio coraz czciej markery DNA (mikrosatelitarne). Monitorowanie genetyczne na podstawie wybranych markerów cech jakociowych. Markery immunologiczne W monitorowaniu genetycznym zwierzt laboratoryjnych najczciej stosowane s antygeny zgodnoci tkankowej, kodowane przez geny głównego kompleksu zgodnoci tkankowej MHC oraz antygeny rónicowania limfocytów np.: Thy1. Wykorzystanie genów głównego kompleksu zgodnoci tkankowej do kontroli jakoci i jednorodnoci szczepów znalazło szerokie zastosowanie z uwagi na: wysoki stopie polimorfizmu rola, jak odgrywaj w badaniach immunologicznych konieczno monitorowania szczepów szczególnie cennych z racji genotypu MHC (szczepy kongenicznie oporne) skuteczno i łatwo wykrywania kontaminacji. Do oznaczania genów MHC stosuje si metody transplantacyje, metody serologiczne i metody komórkowe. 8

9 W metodzie transplantacyjnej najczciej wykorzystywane s przeszczepy skóry. Test ten pozwala na identyfikacj rónic genetycznych w obrbie kompleksu genów zgodnoci tkankowej oraz na kontrol jednorodnoci genetycznej szczepu. Problemy dotyczce metodyki i interpretacji wyników zostały opisane ju w 1951 r. przez Billinghama i Medawara [1]. Metoda jest czuła i skuteczna, ujemn jej stron jest konieczno ponad 100 dniowej obserwacji badanych zwierzt. W około 10 15% przypadków odrzucenie przeszczepu spowodowane jest przyczynami technicznymi lub zakaeniem bakteryjnym. Niekorzystn stron metody transplantacyjnej jest jednak przede wszystkim to, e musi by wykonana in vivo, a zatem powinna by stosowana jedynie w wyjtkowych przypadkach. Test hemaglutynacji i reakcja cytotoksyczna zalena od komplementu s podstawowymi metodami serologicznymi, w których zastosowanie odpowiednich przeciwciał pozwala na identyfikacj antygenów zgodnoci tkankowej charakteryzujcych poszczególne haplotypy MHC [5]. Test cytotoksyczny moe słuy zarówno do identyfikacji antygenów MHC jak i do okrelania antygenów rónicowania limfocytów: Ly, Lyb, TL, Thy1. Sporód licznych wariantów tego testu najczciej stosuje si zaproponowany przez Pincusa i Gordona [11] test mikrocytotoksyczny na płytkach Terasaki przy uyciu limfocytów z wzłów chłonnych jako komórek docelowych i wieej surowicy królika jako ródła komplementu. Markery biochemiczne Markerem biochemicznym jest uwarunkowana genetycznie cecha fenotypowa, któr mona okreli za pomoc technik biochemicznych. W praktyce markerami biochemicznymi s izoenzymy i białka nieenzymatyczne kodowane przez polimorficzne, strukturalne geny. Mnogo oznaczanych markerów biochemicznych i wystpowanie kodujcych je genów na rónych chromosomach przesdzaj o ich istotnym znaczeniu dla potrzeb kontroli genetycznej. Kady szczep wsobny ma ustalony genetyczny profil markerów biochemicznych, który pozwala odróni go od innych szczepów i podszczepów. Szczegółowy opis metod stosowanych do oznaczania markerów biochemicznych zawarty został w podrczniku Zwierzta Laboratoryjne Metody Hodowli i Dowiadcze [16]. Wród najczciej stosowanych markerów biochemicznych wymieni mona: dehydrogenaz jabłczanow Mod1(mysz), β łacuch hemoglobiny Hbb (mysz), białko pcherzyków nasiennych Sup1 (szczur), esteraz 1 Es-1 (szczur). Markery cytogenetyczne Rozwój cytogenetyki umoliwił wprowadzenie monitorowania genetycznego zwierzt na podstawie analizy ich kariotypu. Zaobserwowano, e zabarwione w odpowiedni sposób chromosomy wykazuj specyficzny dla siebie i charakterystyczny dla gatunku układ poprzecznych prków wzdłu ramion chromosomów umoliwiajcy identyfikacj par chromosomów i ułoenie kariotypu komórki. Analizujc kariotypy zwierzt ze szczepów wsobnych wykazano szereg morfologicznych cech chromosomów dotyczcych m.inn. kształtu, intensywnoci zabarwienia i wielkoci prków C widocznych po zabarwieniu heterochromatyny okolicy centromeru. Stwierdzono wyrane rónice w morfologii prków C pomidzy poszczególnymi parami chromosomów kariotypu danego gatunku. Cech charakterystyczn dla wszystkich myszy jest brak prka C w chromosomie Y. U myszy istniej równie rónice rozkładu heterochromatyny centromerycznej charakterystyczne dla poszczególnych szczepów. Obserwacje te pozwalaj na rozrónianie myszy z niektórych szczepów wsobnych za pomc badania prków C. 9

10 Równie markery chromosomowe powstałe w wyniku translokacji mog słuy do identyfikacji szczepu. Ich brak lub heterozygotyczno mog wiadczy o kontaminacji np. myszy szczepu AKR Rb(6;15) posiadajce marker powstały w wyniku fuzji centromerycznej chromosomów 6 i 15 łatwo odróni badaniem cytogenetycznym od myszy ze szczepu AKR wyjciowego bez tego markera. Jednake wykorzystanie markerów cytogenetycznych do monitorowania genetycznego zwierzt z racji czasochłonnoci, trudnoci technicznych i wysokich wymaga dotyczcych kwalifikacji personelu moliwe jest tylko w specjalistycznych laboratoriach do typowania szczególnych przypadków. Markery morfologiczne geny umaszczenia. Do tej grupy markerów naley wiele cech uwarunkowanych ekspresj jednego genu dotyczcych umaszczenia, charakteru okrywy włosowej, nieprawidłowoci w budowie szkieletu, które w wikszoci przypadków mog by rozpoznawane i testowane bez uycia specjalistycznego wyposaenia. Najczciej w praktyce stosuje si kontrol genów umaszczenia. Kontrol tak u myszy albinotycznych przeprowadza si stosujc krzyówki ze zwierztami ze szczepów barwnych o znanym recesywnym genotypie. W przypadku myszy najczciej uywany jest szczep DBA/2 o genotypie aabbccdd (a nie agouti, b obecnie Tyrp1 b brzowy, C obecnie Tyr nie albinotyczny, d obecnie Myo5a d rozcieczony). Na podstawie oceny umaszczenia mieszaców F1 wnioskuje si o genotypie zwierzcia z badanego szczepu. Ponadto na podstawie umaszczenia myszy w pokoleniu F1 mona wnioskowa o czystoci genetycznej szczepów uytych do krzyowania. Wszystkie zwierzta pierwszego pokolenia mieszaców powinny by jednakowo umaszczone. Wystpienie segregacji wiadczy o kontaminacji szczepu. Markery mikrosatelitarne w kontroli genetycznej zwierzt szczepowych. Postepowanie, podobnie jak w przypadku innych markerów, polega przede wszystkim na stworzeniu profili genetycznych dla poszczególnych, podlegajcych kontroli szczepów wsobnych. Markery mikrosatelitarne precyzyjnie zmapowane i równomiernie rozproszone w genomie s stosunkowo proste do analizowania. W badaniach stosuje si najczciej technik nieizotopowego PCR i ocen długoci amplifikowanych alleli na elu agarozowym o wysokiej rozdzielczoci. Przy wyborze markerów naley bra pod uwag nastpujce kryteria: połoenie na rónych chromosomach odpowiedni poziom polimorfizmu obecno unikalnych alleli charakteryzujcych poszczególne szczepy łatwo rozdziału otrzymywanych fragmentów na elu agarozowym o wysokiej rozdzielczoci prawidłowo przebiegajc reakcj PCR Przy zastosowaniu metody analizy markerów mikrosatelitarnych mona przy niewielkim nakładzie kosztów i w raczej krótkim czasie przeprowadza okresow kontrol genetyczn hodowanych zwierzt przez porównywanie uzyskiwanych wyników z uprzednio opracowanymi profilami. Metoda ta, w Polsce nowa, stosowana jest ju w wielu orodkach wiatowych zarówno w celu kontroli genetycznej zwierzt, jak te do badania ich genomu i do dowiadcze z wykorzystaniem analizy sprze [7]. Monitorowanie genetyczne na podstawie analizy cech ilociowych. W monitorowaniu genetycznym prowadzonym na podstawie analizy cech ilociowych najczciej wykorzystuje si wskaniki reprodukcyjne i morfometryczne. Prawidłowo prowadzona dokumentacja hodowlana zawiera zwykle informacje dotyczce: 10

11 czasu od skojarzenia do wydania pierwszego miotu odstpów czasowych midzy kolejnymi miotami liczby urodzonych młodych liczby odchowanych młodych Powysze dane mog słuy do wyliczania wskaników reprodukcyjnych np. indeks hodowlany (C), rednia liczebno miotu w danej populacji w rónych okresach od urodzenia [2,8]. Szczepy wsobne charakteryzuj si zwykle nisk wydajnoci hodowlan w przeciwiestwie do stad niekrewniaczych i mieszaców F1. Istotny nieoczekiwany wzrost wartoci współczynników reprodukcyjnych moe by sygnałem alarmowym sugerujcym przeprowadzenie szczegółowej kontroli genetycznej, gdy moe wiadczy o kontaminacji szczepu. Sporód wielu grup wskaników morfometrycznych w rutynowym monitorowaniu szczepów wsobnych najczciej stosuje si okrelanie wskaników osteometrycznych: pomiary uchwy [6], czaszki [10], koci udowej. Do niedawna powszechnie rekomendowany był test mandibularny zaproponowany przez Festinga i Lovella [6]. Wszystkie badania genetyczne prowadzone na podstawie analizy cech ilociowych musz by zawsze uzupełniane i potwierdzone innymi metodami. Dlatego te obecnie wraz z rozwojem biologii molekularnej umoliwiajcej monitorowanie genetyczne zwierzt na poziomie DNA stosowanie cech ilociowych jest coraz bardziej ograniczane. Kontrola genetyczna stad niekrewniaczych. Najtrudniejszym zadaniem w hodowli stad niekrewniaczych jest utrzymanie zmiennoci genetycznej zwierzt na moliwie stałym poziomie przez wiele pokole. Systemy kojarze i liczebno stad musz by tak dobrane aby współczynnik wsobnoci (inbredu) był niszy ni 1% na pokolenie. W populacjach mniejszych ni 100 par niezbdne jest stosowanie wybranych metod kojarze rotacyjnych lub tak zwanej metody maksymalnego unikania kojarze krewniaczych. W celu zachowania stałego spektrum genetycznego populacji niekrewniaczych w 1981 r. Rapp i wsp. [12] z Centralnego Instytutu Hodowli Zwierzt w Hanowerze wprowadzili metod tak zwanej liniowej optymalizacji w doborze zwierzt do kojarze. Przy zastosowaniu tej metody niezbdna jest jednak charakterystyka wielu wybranych cech ilociowych i jakociowych hodowanych zwierzt, ustalenie normy populacji i charakterystycznej frekwencji klas wartoci. Metoda liniowej optymalizacji jest bardzo pracochłonna i kosztowna. W hodowlach, gdzie nie jest moliwe wprowadzenie metody liniowej optymalizacji, mona uzyska ograniczenie i utrzymanie na moliwie jednakowym poziomie zmiennoci stada prowadzc znan z genetyki populacyjnej selekcj stabilizujc. Przy jej zastosowaniu do dalszej hodowli wybieramy tylko te osobniki, u których wartoci badanych cech maj najnisze odchylenie od normy populacji. Jak ju na wstpie powiedziano w hodowli stad niekrewniaczych niezbdne jest ustalenie normy populacji oraz stosowanie jednego ze znanych systemów kojarze rotacyjnych lub metody hodowli z tak zwanym maksymalnym unikaniem inbredu (kojarze krewniaczych). 11

12 Pimiennictwo: 1. Billingham R.E., Madawar P.B.: The technique of free skin grafting in mammals. J.Exper.Biol., 1951, 28, Bryliska J.: Zastosowanie wskaników reprodukcyjnych i morfometrycznych do kontroli zmiennoci genetycznej myszy i szczurów ze stad niekrewniaczych. Zwierzta Lab., 1985, 22(1-2), Czarnomska A., Kunierczyk P., Strzdała L., Sitarz M., Woszczyski M., Krysiak E., Zborowska E., Leszczyska Czech J., Zioło E., Pajtasz E., Rak J., Kwaniewska E., Mraz Dulemba M., Radzikowski Cz.: Genetic monitoring of inbred strains and congenic lines of mice maintained at six scientific centres in Poland. Zwierzta Lab., 1987, 24(1-2), Czarnomska A., Sitarz M., Zborowska E.: Kontrola genetyczna myszy laboratoryjnych. II.Analiza wybranych markerów morfologicznych i immunologicznych u myszy z 23 szczepów wsobnych. Zwierzta Lab., 1983, 20(1-2), Demant P.: Histocompatibility genes and their use in genetic control of laboratory mice. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7 th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart New York: Gustav Fischer Verlag, Festing M.F.W., Lovell D.P.: Routine genetic monitoring of commercial and other mouse colonies in UK using mandible shape; five years of experience. In: A.Spiegiel, S.Erichsen, H.A. Solleveld (eds.), Animal quality and models in biomedical research. 7 th ICLAS Symposium, Utrecht 1979, Stuttgart New York: Gustav Fischer Verlag, Gajewska M., Łukasiewicz D., Rutkowski R., Wirth Dziciołowska E: Markery mikrosatelitarne w rutynowym monitorowaniu genetycznym myszy szczepów wsobnych. Doniesienie zjazdowe Zwierzta laboratoryjne w nowym tysicleciu, 2002, streszczenia str Hedrich J.H.: Principles in genetic monitoring. In H.J.Hedrich (ed.), Genetic monitoring of inbred strains of rats. Stuttgart - New York: Gustav Fischer Verlag,, 1990, Hsu C-K.: Genetic monitoring. In J.G.Fox, B.J.Cohen, F.M.Loew (eds.), Laboratory animal medicine. New York: Academic Press Inc., 1984, Pietrowicz D., Lindner P., Wojda K.: Analysis of the usefulness of certain craniometric features in genetic identification of laboratory rats. Z.Versuchstierkd., 1982, 24, Pincus J.H., Gordon R.C.: A microassay for the detection of murine H-2 antigens. Transplantation, 1972, 12, Rapp K.G., Burow K., Kluge R.: Monitoring of outbred populations. Zwierzta Lab., 1981, 18, 2, Sitarz M., Woszczyski M., Czarnomska A.: Charakterystyka wsobnych szczepów myszy pod wzgldem markerów biochemicznych Mod-1, Gpd-1, Idh-1, Pgm-1, Gpi- 1s. Zwierzta Lab., 1990, 27, 1, Woszczyski M, Krysiak E., Czarnomska A.: Opracowanie i wdroenie programu rutynowego monitorowania genetycznego szczepów wsobnych myszy na podstawie wybranych grup markerów rónicujcych. Zwierzta Lab., 1990, 27, 2, Woszczyski M., Sitarz M., Czarnomska A.: Wstpne wyniki kontroli genetycznej szczurów AUG/W, L-E/W, M520/W, SPRD/W, WAG/W, BN/W. Zwierzta Lab., 1990, 27, 2, Zwierzta Laboratoryjne Metody Hodowli i Dowiadcze. J.Bryliska, J.Kwiatkowska (red.) Rozdział 6: Kontrola genetyczna. Universitas, 1996,

13 Monitorowanie zdrowia zwierzt laboratoryjnych Marek Woszczyski, Elbieta Krysiak Jednym z warunków zmniejszenia liczby zwierzt potrzebnych do właciwego wykonania dowiadczenia jest uywanie zwierzt o znanym standardzie zdrowotnym. Ma to istotny wpływ na jako i powtarzalno otrzymywanych wyników. Dlatego te ju w latach pidziesitych pod patronatem organizacji midzynarodowych (WHO, FAO, ILAR, ICLAS) wprowadzono podział zwierzt na róne kategorie zdrowotne i opracowano wykazy mikroorganizmów, które powinny by wyeliminowane u zwierzt danej kategorii i gatunku. Równie w Polsce podjto próby standaryzacji zdrowotnej zwierzt uywanych do dowiadcze. Jedn z nich było wydane w 1977 r. przez Krajow Spółdzielni Hodowli Drobnego Inwentarza zobowizanie prywatnych hodowców do okresowego badania hodowanych zwierzt w kierunku wykrycia bakterii z grup Salmonella, Shigella, Pasteurella pneumotropica, Mycobacterium tuberculosis oraz grzybów i wierzbowców. Z inicjatywy Sekcji ds. Zwierzt Laboratoryjnych SITR - NOT we współpracy z Instytutem Zootechniki w Balicach wydano Karty Informacyjne do Załoe Technologicznych Produkcji Zwierzcej: Zwierzta Laboratoryjne". Oprócz zalece dotyczcych niezbdnego sprztu, wyposaenia technicznego i obsługi zwierztarni znajduje si tam rozdział mówicy o kategoriach zdrowotnych zwierzt i ustalona na podstawie midzynarodowych przepisów lista mikroorganizmów, które powinny by wyeliminowane w ich hodowli. Obecnie podział ten został nieco zmodyfikowany (patrz rozdział" Nazewnictwo..."); uwzgldniono np. nie trzy, ale dwie kategorie zwierzt konwencjonalnych: Zwierzta konwencjonalne, kontrolowane pod wzgldem zdrowotnym, utrzymywane w warunkach czciowej bariery sanitarnej Zwierzta konwencjonalne hodowane w warunkach otwartych. Podział na kategorie zdrowotne bywa róny w rónych krajach i zaley np. od specyfiki regionu i dostpnych metod diagnostycznych. Równie wykazy mikroorganizmów, które powinny by wykluczone w hodowli danej kategorii zwierzt ulegaj zmianom w zalenoci od rozwoju nowych technik diagnostycznych i poznawania nowych, uprzednio nieznanych, gatunków bakterii czy wirusów. Ze wzgldu na wyhodowanie rónych szczepów myszy z niedoborami immunologicznymi zakres kontroli rozszerza si o gatunki mikroorganizmów nie znajdujcych si w wykazach opracowanych dla zwierzt immunokompetentnych. Aktualne zalecenia dotyczce zakresu kontroli mikrobiologicznej zwierzt laboratoryjnych s publikowane regularnie przez organizacje takie jak ICLAS (International Council for Laboratory Animal Science) czy SOLAS (Society for Laboratory Animal Science). Wikszo zakae obecnych u zwierzt laboratoryjnych hodowanych w odpowiednich dla danego gatunku warunkach rodowiska przebiega bez wyranych objawów klinicznych, jednak ma znaczcy wpływ na przebieg i wyniki dowiadcze a w konsekwencji prowadzi do koniecznoci powtarzania bada. Powoduje to czasem znaczne zwikszenie liczby uytych zwierzt. Na przykład zakaenie wirusem MHV (wirus zapalenia wtroby) moe wywoływa m.in. zahamowanie wydzielania immunoglobulin, zwikszenie aktywnoci fagocytów, zwikszenie wraliwoci na inne mysie patogeny (Eperythrozoon coccoides, K wirus, Schistosoma mansoni), zmian aktywnoci enzymów wtrobowych, zwolnienie procesu regeneracji wtroby po czciowej hepatektomii, moe te powodowa anemi, leukopeni i trombocytopeni. Subkliniczna infekcja MHV moe przekształci si w cik posta choroby połczon

14 z wysok miertelnoci po zabiegu tymektomii, podaniu kortyzonu, cyklofosfamidu, chemioterapeutyków, nawietlaniu radioaktywnym i po zastosowaniu halotanowej narkozy. Zakaenie Mycoplasma pulmonis moe te wywoła kliniczn posta choroby połczon ze znaczn miertelnoci szczególnie w długotrwałych eksperymentach, Powoduje to zafałszowanie wyników wielu bada dotyczcych układu oddechowego. Mycoplasma pulmonis moe wywoła zwikszenie aktywnoci komórek NK oraz zmniejszenie humoralnej odpowiedzi na SRBC u szczurów. Zarówno Mycoplasma pulmonis jak i wirus zapalenia wtroby mog by czynnikiem kontaminujacym guzy przeszczepialne i hodowle tkankowe. Infekcje układu płciowego mog by przyczyn zmniejszenia parametrów reprodukcyjnych hodowanych zwierzt. Przy opracowywaniu programu kontroli zdrowia (jej czstoci i spektrum kontrolowanych mikroorganizmów) naley bra pod uwag nastpujce czynniki: Kategori zdrowotn i warunki hodowli zwierzt Rodzaj dowiadcze, do których bd słuyły zwierzta Stopie zagroenia przeniesienia infekcji z innych populacji gryzoni Przewidywana rola danych patogenów w okrelonym dowiadczeniu Wzgldy ekonomiczne Zaplecze techniczne - moliwoci zastosowania okrelonych technik diagnostycznych Monitorowanie zdrowia powinno obejmowa kontrol mykologiczna, parazytologiczn, bakteriologiczn i wirusologiczn oraz badanie anatomopatologiczne. W kontroli wirusologicznej obecnie stosuje si najczciej metody serologiczne takie jak test ELISA, test immunofluorescencji (IFA) i test zahamowania hemaglutynacji (HI) oraz metody biochemiczne i molekularne przy identyfikacji wirusa LDV (Lactic Dehydrogenase Elevating Virus). W kontroli bakteriologicznej najczciej stosuje si posiewy z wybranych narzdów na podłoa namnaajce a nastpnie identyfikacj drobnoustrojów przy pomocy odpowiednich zestawów np. API SYSTEM. W niektórych przypadkach stosuje si równie metod PCR (np. do identyfikacji Helicobacter sp., Mycoplasma sp.), test ELISA (Mycoplasma sp., Clostridium piliformis) oraz w pewnych przypadkach np. przy wystpieniu charakterystycznych zmian w wtrobie w chorobie Tyzzera, wywoływanej przez Clostridium piliformis, badanie histopatologiczne. W kontroli parazytologicznej najczciej stosuje si metody mikroskopowe a w niektórych przypadkach test ELISA i PCR. Zwierzta sprzedawane przez orodki hodowlane powinny mie zawsze certyfikat zdrowia uwzgldniajcy zakres i czsto prowadzonej kontroli. Na przykład certyfikat z Jackson Laboratory zawiera: Wykaz badanych mikroorganizmów z podziałem na wirusy, bakterie i mykoplazmy, pasoyty zewntrzne i wewntrzne Rodzaj próby np. surowica, posiew z jelita, posiew z nosogardzieli Metod np. ELISA, PCR, posiew na odpowiednie podłoe Czstotliwo bada wykonywanych w kierunku identyfikacji konkretnych mikroorganizmów Wyniki ostatnich 4 bada (okres jednego roku) liczba wyników pozytywnych w stosunku do liczby zbadanych zwierzt Numer (symbol) kontrolowanego pomieszczenia lub zespołu pomieszcze 14

15 Zalecane pimiennictwo: 1. Infectious diseases of mice and rats. National Academy Press, Washington, D.C., Recommendations for the health monitoring of rodent and rabbit colonies in breeding and experimental units. Laboratory Animals, 2002, 36, List of pathogens for specification in SPF laboratory animals. SOLASA, Veterinary public health reports. Guidelines for breeding and care of laboratory animals. ISS/WHO/FAO-CC/IZSTe/94.23, Karty Informacyjne do Załoe Technologicznych Produkcji Zwierzcej: Zwierzta Laboratoryjne. Instytut Zootechniki, Kraków,