Porównywanie rozwoju szczepów dzikich i mutantów E.coli na płytkach z inhibitorem gyrazy - enzymu odpowiedzialnego za superskr

Transkrypt

1 Porównywanie rozwoju szczepów dzikich i mutantów E.coli na płytkach z inhibitorem gyrazy - enzymu odpowiedzialnego za superskręty negatywne w chromosomie bakteryjnym. Autor: Krzysztof Sroka kl. III b I Akademickie Liceum Ogólnokształcące w Gdyni Opiekun: mgr inż. Leszek Ciesielski

2 Streszczenie Pracę tą mogłem zrealizować dzięki uprzejmości pani dr Moniki Glinkowskiej oraz jej Zespołowi z Katedry Biologii Molekularnej Uniwersytetu Gdańskiego. Proces replikacji DNA u Escherichia coli (pałeczka okrężnicy) jest ściśle regulowany w zależności od warunków wzrostu bakterii. Komórki bakteryjne w sprzyjających okolicznościach (bogate podłoże, optymalna temperatura) dzielą się szybciej, zaś w niekorzystnych warunkach spowalniają wzrost i tempo podziałów. Przed każdym podziałem chromosomalny DNA bakterii, będący nośnikiem informacji genetycznej, musi zostać precyzyjnie powielony, aby mógł zostać przekazany do potomnych komórek. Za rozpoczęcie procesu powielania materiału genetycznego u E.coli i wielu innych bakterii odpowiedzialne jest białko dnaa. Zidentyfikowano mutacje dnaa46 w genie kodującym białko dnaa, mające wyraźne odbicie w fenotypie bakterii. Uszkodzone białko zachowuje wystarczającą funkcjonalność, aby zapewnić rozwój i podział bakterii tylko w określonych, sprzyjających warunkach (30 C). U bakterii niosących mutację dnaa46 stwierdza się między innymi zahamowanie wzrostu w temperaturze powyżej 39 C oraz wysoką wrażliwość na antybiotyk - nowobiocynę. Podczas badań nad mechanizmami kontroli replikacji DNA, zaobserwowano ciekawe zjawisko polegające na tym, iż bakterie posiadające mutacje w genie dnaa (dnaa46) oraz w jednym z genów szlaku metabolizmu węglowego są odporne na podwyższoną temperaturę. A zatem zmiana w genach należących do centralnego metabolizmu węgla znosi temperaturowrażliwy fenotyp mutantów dnaa. W związku z tym wysunięto hipotezę, iż procesy związane z centralnym metabolizmem węgla w komórce mają bezpośredni wpływ na proces replikacji DNA. W mojej pracy podjąłem próbę zweryfikowania powyższej hipotezy, badając czy podwójne mutanty dnaa46 z delecjami genów metabolizmu węgla w komórce: pta i ack.a wykażą identyczną odporność na nowobiocynę jak szczep dziki. Nowobiocyna hamuje aktywność enzymu niezbędnego w przebiegu replikacji DNA gyrazy DNA, która jest jednym z białek odpowiedzialnych za utrzymanie właściwej struktury chromosomalnego DNA bakterii. Porównywałem rozwój różnych szczepów E.coli na płytkach z pożywką stałą zawierającą nowobiocynę w różnych stężeniach. Podczas doświadczeń wcierałem w płytki próby pochodzące z seryjnych rozcieńczeń hodowli bakteryjnych szczepu dzikiego, mutanta dnaa46, mutanta z wydeletowanym genem jednego ze szlaków metabolizmu węglowego: acka, pta oraz dwóch podwójnych mutantów dnaa46 pta i dnaa46 acka. Wszystkie przeprowadzone przeze mnie próby potwierdziły hipotezę o związku procesu replikacji z cyklem metabolicznym węgla w komórce E.coli. Podwójne mutanty posiadały odporność równą szczepu dzikiemu oraz samym mutantom cyklu węglowego. Wskazuje to na supresję efektu uszkodzonego genu dnaa46 przez delecje genów pta i acka. Choć sam fakt wpływu obecności mutacji w metabolizmie bakterii na replikacje jej materiału genetycznego jest niezaprzeczalny, to niestety nie wiemy, na czym bezpośrednio polega ta relacja. Czy to brak białek acka i pta wywołał supresję uszkodzonego genu dnaa46, czy też nagromadzenie pośrednich metabolitów wpłynęło na reakcję bakterii, która pozwoliła jej przeżyć i namnażać się. Niemniej, moja praca była częścią rzeczywistego projektu badawczego, który wkrótce być może, da nam odpowiedź na te pytania. Wstęp Poznanie praw rządzących procesem replikacji jest niezwykle ważne dla pełnego zrozumienia fenomenu życia. Jest to bowiem podstawowy proces pozwalający na powielenie informacji genetycznej w celu jej przekazania potomnym komórkom lub organizmom. Ten energochłonny proces jest ściśle regulowany, gdyż jego zaburzenia mogą prowadzić do

3 wprowadzenia mutacji do materiału genetycznego, skutkujących zaburzeniami procesów komórkowych, a nawet śmiercią komórki lub zainicjowaniem procesu nowotworzenia u organizmów wyższych. Nasuwa się pytanie, w jaki sposób komórka dowiaduje się, kiedy należy się dzielić, a kiedy zbierać energię i skupić się na przeżyciu? Mechanizmy takie funkcjonują przecież już u najbardziej pierwotnych form życia - prokariontów, które ze względu na często zmieniający się stan środowiska, rozwinęły mechanizmy pozwalające dopasować replikację DNA do warunków wzrostu. Zagadnieniom tym poświęcono wiele lat badań w licznych laboratoriach, a mimo to wciąż niewiele o nich wiemy. Odkrycie tej tajemnicy pozwoliłoby nam prawdopodobnie na skuteczniejszą walkę z rakiem i patogenami, a także być może rozwiązałoby problem przeszczepów. Ostatnie doniesienia z literatury fachowej wskazują na istnienie bezpośredniej zależności między procesami metabolitycznymi a replikacją. W swojej pracy badałem związek między metabolizmem węgla w komórce a procesem replikacji DNA chromosomalnego E.coli. Escherichia coli jest bakterią Gram ujemną powszechnie występującą w jelicie grubym zwierząt stałocieplnych (w tym człowieka). W większości przypadków nie wywołuje chorób, choć niektóre szczepy są zdolne do produkcji groźnych toksyn wywołujących m.in. skazę krwotoczną lub kolonizację dróg moczowych, powodując ich stan zapalny. Ponadto jej genotyp i metabolizm jest dobrze poznany, co w połączeniu z krótkim cyklem rozwojowym i niskimi wymaganiami życiowymi, czyni z niej organizm modelowy wykorzystywany przez laboratoria na całym świecie. Materiałem badawczym były różne szczepy E.coli, które poddawałem warunkom uniemożliwiającym wzrost komórek zawierających mutację w genie dnaa (dnaa46), kodującym białko związane z replikacją. Metoda i materiał Badania prowadziłem na 6 różnych szczepach bakterii E.coli : szczepie dzikim (WT ang. Wild Type), szczepie z mutacją w genie dnaa - dnaa46 i genem oporności na tetracyklinę (marker genetyczny zastosowany podczas konstrukcji szczepów, umożliwiający ich łatwą selekcję na podłożu z antybiotykiem), szczepie ze znokautowanym genem acka ( acka) i genem oporności na kanamycynę, szczepie ze znokautowanym genem pta ( pta) i genem oporności na kanamycynę, szczepie zawierającym podwójne mutacje: dnaa46, oraz acka oraz genami oporności na tetracyklinę i kanamycynę, szczepie zawierającym podwójne mutacje: dnaa46 oraz pta oraz genami oporności na tetracyklinę oraz kanamycynę. Białko dnaa46 rozplata heliksę DNA inicjując proces replikacji DNA. Jest ono także ważnym czynnikiem regulującym ekspresje genów w komórce bakterii. Niejako przygotowuje komórkę do podziału. Badany mutant w genie dnaa objawia się fenotypowo między innymi przez zahamowanie rozwoju w temperaturze powyżej 39 C oraz nadwrażliwością na nowobiocynę. Geny acka oraz pta kodują enzymy biorące udział w metabolizmie węgla bakterii. Stosowane podłoża mikrobiologiczne: LA ang. Luria Agar (0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% trypton, 1% NaCl w wodzie bidestylowanej z dodatkiem 1,5% agarozy). LA z dodatkiem roztworu wodnego nowobiocyny o stężeniu wyjściowym 50 mg/ml.

4 Bakterie wysiewałem na szalki Petriego zawierające standardową stałą pożywkę. Nowobiocyna jest inhibitorem gyrazy odpowiedzialnej za powstawanie superskrętów negatywnych w strukturze DNA prokariontów. Odpowiedni poziom superskręcenia DNA jest niezbędny do życia i podziału komórek bakteryjnych. Schemat doświadczenia przedstawiam dokładnie poniżej. Przed każdym eksperymentem zaszczepiałem pojedynczą kolonię odpowiednich szczepów E.coli do świeżej pożywki LB (ang. Luria Broth - 0,5% ekstrakt drożdżowy, 1% trypton, 1% NaCl w wodzie bidestylowanej) i hodowałem z wytrząsaniem w temperaturze 30 C. Nazajutrz hodowle nocne bakterii były odmładzane w płynnych pożywkach z odpowiednimi antybiotykami (np. mutant dnaa46 odmładzany był w pożywce z tetracykliną), natomiast szczep dziki jako jedyny nie posiadający genu odporności na antybiotyki odmładzany był w czystej pożywce (bez antybiotyku). Odmłodzone hodowle były inkubowane w wytrząsarce wodnej z napowietrzaniem (180 obrotów/minutę) w temperaturze 30 C, dzięki temu bakterie mogły się rozwijać w warunkach tlenowych. Wprawdzie bakterie E.coli są fakultatywnie beztlenowe, więc mogą rozwijać się w warunkach beztlenowych, ale metoda badania zakładała wykorzystanie bakterii o fenotypie bakterii tlenowych. Po upływie około 1,5 godziny od momentu odmłodzenia hodowli, za pomocą spektrofotometru (fot.1) oszacowywałem stopień namnożenia bakterii w hodowlach. W tym celu wykonywałem pomiar gęstości optycznej hodowli przy długości fali λ=600 nm (OD 600, od ang. Optical Density), pozwalający ocenić stopień zmętnienia pożywki bakteryjnej, a tym samym wnioskować o ilości komórek bakteryjnych obecnych w jednostce objętości pożywki. Hodowle po osiągnięciu wartości 0,2 OD 600 do 0,3 OD 600 były wykorzystywane do doświadczeń lub inkubowane w lodzie, aby zahamować ich dalszy rozwój. Z uzyskanych hodowli, za pomocą metody seryjnych rozcieńczeń (Jackie Reynolds, Mark Farinha, 2005), uzyskiwałem zawiesinę bakterii zawierającą ilość komórek w określonej objętości pożywki, pozwalającą na późniejsze zliczenie kolonii na płytce (rozcieńczenia 10 5 oraz 10 6 ). Następnie za pomocą pipety automatycznej przenosiłem 100 µl z wybranego rozcieńczenia na szalkę Petriego. Głaszczką odkażoną w etanolu i opaloną nad palnikiem, wcierałem w podłoże agarowe zawiesinę bakterii. Wszystkie powyższe czynności wykonywałem w odległości ok. 25 cm od palnika, aby zapewnić względną aseptyczność powietrza. Po dokładnym wtarciu płynu w podłoże płytki, wkładałem ją na 24 godziny do cieplarki nastawionej na temperaturę 30 C. Po tym czasie kolonie na płytkach były przeze mnie zliczane, a wynik poddawany analizie. Wyniki Moje pierwsze doświadczenie przedstawia zależność pomiędzy stężeniem nowobiocyny w podłożu a wzrostem badanych szczepów, co pozwoliło na ocenę, w jakim stężeniu nowobiocyny objawia się fenotyp nadwrażliwości na ten antybiotyk bakterii z uszkodzonym fragmentem dnaa46 (wykres 1). Z poniższych danych wynika, iż stężenie 80 µg/ml jest już poza zakresem tolerancji dla szczepu zmutowanego, podczas gdy pozostałe szczepy rosną w dalszym ciągu.

5 Wykres nr Wrażliwość badanych szczepów na nowobiocynę w zależności od jej stężenia Liczba kolonii bakteryjnych µg\ml 40 µg\ml 60 µg\ml 80 µg\ml Stężenie nowobiocyny Wt dna A46 pta ack.a dna A46 pta dna A 46 ack.a W następnych doświadczeniach łącznie wykonałem: 5 prób korzystając z rozcięczenia 10 6 w przypadku szczepu dzikiego, acka i pta, 4 próby w przypadku rozcięczenia 10 6 dla szczepu mutanta dnaa46, dnaa46 acka i dnaa46 pta, 3 próby dla rozcięczenia 10 5 wszystkich szczepów. Średnią ilość kolonii uzyskanych dla danego szczepu na płytkach nie zawierających antybiotyku przyjąłem jako 100%. W stosunku do niej porównywałem średnią ilości kolonii danego szczepu uzyskaną z płytek zawierających nowobiocynę. Uzyskane wyniki podsumowałem w wykresie nr 2. Wykres nr 2 Wrażliwość badanych szczepów na nowobiocynę w odniesieniu do rozwoju bez antybiotyku Procet wt dnaa46 Δpta ΔackA dnaa46 Δpta dnaa46 ΔackA Szczep bakterii Mutacje w genach kodujących białka zaangażowane w centralny metabolizm węgla znoszą nadwrażliwość szczepów zawierających mutacje dnaa46 na nowobiocynę. Zaprezentowane wartości stanowią średnią z trzech niezależnych eksperymentów. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (świadczące o rozrzucie wyników, o zakresie w jakim wartości uzyskane z poszczególnych eksperymentów odbiegają od średniej).

6 Dyskusja Replikacja jest złożonym procesem wymagającym zaangażowania wielu specjalistycznych białek, nukleotydów i ogromnych nakładów energetycznych. Dlatego przed podjęciem wysiłku zmobilizowania aparatu replikacyjnego komórka musi mieć pewność, iż uda jej się, w panujących warunkach, ukończyć proces powielania materiału genetycznego. Zatem proces replikacji jest ściśle regulowany, aby zapewnić wytworzenie wiernych kopii materiału genetycznego. Od niedawna badana jest bezpośrednia relacja pomiędzy metabolizmem a procesem replikacji. Dawniej uważano, iż relacja ta istnieje, ale tylko pośrednio. Wzrost produktów energetycznych metabolizmu miał pobudzać i zasilać energochłonny proces transkrypcji i replikacji DNA w komórce. Uzyskane przez naukowców wyniki wskazują jednak na bezpośredni wpływ metabolizmu węgla na aparat replikacyjny, co potwierdzają również moje badania. Zarówno w doświadczeniu wstępnym (patrz tab.1) jak i w kolejnych doświadczeniach (patrz wykres 1) mutant dnaa46 nie przeżywał w stężeniu 80 µg novobiocyny na 1 ml pożywki stałej. Mutanty podwójne czyli dnaa46 pta i dnaa46 ack.a, pomimo produkowania wadliwego białka dnaa wykazywały odporność na nowobiocynę. Różnice w rozwoju między szczepem dzikim a mutantami pta i ack.a są niewielkie i mieszczą się w granicach błędu statystycznego. Powyższe spostrzeżenia są zgodne z wcześniej poczynionymi obserwacjami nad supresją temperaturowrażliwego fenotypu mutanta dnaa przez delecję tych samych genów należących do centralnego metabolizmu węgla (Barańska i wsp.,2013). Jest mało prawdopodobne, aby delecje dwóch różnych genów zaangażowanych w metabolizm węgla w komórce mogły niezależnie zwiększyć zakres tolerancji bakterii na wysoką temperaturę i stężenie antybiotyku - nowobiocyny. Wskazuje to jednoznacznie na to, iż delecja genów metabolizmu węgla w komórce supremuje źródło badanych fenotypów czyli obecność uszkodzonego fragmentu DNA kodującego białko dnaa46. W jaki jednak sposób zachodzi ten proces, niestety jeszcze nie wiemy. Dyskusja o tym, jak dokładnie wygląda wpływ metabolizmu na replikacje trwa. Istnieje jednak kilka hipotez które próbują wyjaśnić otrzymane wyniki. Pierwsza hipoteza zakłada bezpośredni związek białek cyklu obiegu węgla w komórce z procesem replikacji. Być może same enzymy szlaków metabolicznych wpływają na aktywność białek replikacyjnych oddziałując z nimi fizycznie w komórce bakteryjnej. Ich brak wywołałby odpowiednią zmianę w procesie replikacji (np. spowolniając ją), tym samym supresując wadliwe białko dnaa46. Inną możliwością jest wpływ nadmiernego nagromadzenia się pośrednich metabolitów spowodowany brakiem jednego z enzymów. Niewykorzystane metabolity byłyby sygnałem do włączenia reakcji umożliwiającej przeżycie bakterii pomimo defektu białka dnaa46 lub wyłączenia reakcji szkodliwej dla bakterii w zaistniałej sytuacji. Podobnie ma się sprawa przy odwrotnym założeniu, iż sygnałem dla komórki jest brak produktów z wyłączonego fragmentu szlaku metabolicznego. Być może w taki sposób delecja genów acka i pta wywołała reakcje stresową komórki, przez co ta zmieniła swoją strategię regulacji replikacji materiału genetycznego. W moich badaniach stwierdziłem, iż mutacje w genach centralnego metabolizmu węgla prowadzą do zniesienia nadwrażliwości szczepu produkującego defektywne białko replikacyjne na antybiotyk hamujący enzym odpowiedzialny za utrzymanie odpowiedniej struktury DNA. Może to świadczyć o bezpośrednim wpływie białek zaangażowanych w centralny metabolizm węgla na strukturę DNA. Odkrycie czynników regulujących replikacje od strony metabolizmu komórki może niebywale przyczynić się do rozwoju medycyny i farmakologii. Choć sam sposób organizacji informacji genetycznej u prokarionta i eukarionta jest różny, to wiele mechanizmów

7 genetycznych ma swoje funkcjonalne odzwierciedlenie u obu grup. Z tego powodu przed testami nad organizmami wyżej zorganizowanymi (w tym także nami ludźmi) należy dokładnie poznać mechanizmy występujące u bakterii. Poza perspektywami opracowania zupełnie nowych antybiotyków, wiedza ta może w przyszłości zaowocować znalezieniem nowych metod leczenia raka, gdyż komórki nowotworowe odznaczają się utratą prawidłowej kontroli procesu replikacji DNA. Pierwsze przesłanki o współzależności metabolizmu komórki a zmianami nowotworowymi zapostulował laureat nagrody Nobla z 1931r. Otto Wagburg. W swoich badaniach udowodnił on między innymi, iż komórki nowotworowe zużywają znacznie mniej tlenu niż pozostałe zdrowe komórki. Obecnie wiemy, że spowodowane jest to zmianą strategii uzyskiwania energii przez komórkę nowotworową z oddychania mitochondrialnego na o wiele mniej efektywną beztlenową glikolizę. Istnieją więc duże nadzieje związane z prowadzonymi badaniami na temat oddziaływania metabolizmu na replikacje, gdyż prawdopodobnie pozwoliłoby to nie tylko na skuteczną walkę z nieustannie replikującymi się komórkami rakowymi, ale także na skuteczniejszą prewencję chorób nowotworowych. Bezsprzecznie dieta ma wpływ na metabolizm. Nasuwa się więc jasna konkluzja, że nasze nawyki żywieniowe mają o wiele większy wpływ na kancerogenezę niż dotychczas sądziliśmy. Potencjalne możliwości jakie daje nam studium nad procesem regulacji replikacji są fascynujące. Moja praca jest częścią większego trwającego obecnie projektu prowadzonego przez naukowców z Katedry Biologii Molekularnej na Uniwersytecie Gdańskim. W tym miejscu pragnąłbym szczególnie podziękować Pani dr Monice Glinkowskiej oraz jej Zespołowi, którzy zapewnili mi warunki do przeprowadzenia badań oraz wsparli swą wiedzą i doświadczeniem praktycznym. Piśmiennictwo: 1. Alicja.Wegrzyn,Grzegorz.Wegrzyn, (2001) Inheritance of the replication complex: a unique or common phenomenon in the control of DNA replication? Arch Microbiol., 175: Anne-Francoise Monnier, Armelle Cabin i in.(2008) From metabolic hyperstructures to DNA replication complexes and back again, Modelling Complex Biological Systems in the Context of Genomics, str Sylwia Barańska, Monika Glinkowska, Anna Herman-Antosiewicz, Monika Maciąg- Dorszyńska, Dariusz Nowicki, Agnieszka Szalewska-Pałasz, Alicja Węgrzyn i Grzegorz Węgrzyn (2013) Replicating DNA by cell factories: roles of central carbon metabolism and transcription in the control of DNA replication in microbes, and implications for understanding this process in human cells, Microbial Cell Factories, 12: Jackie Reynolds, Mark Farinha (2005), Counting Bacteria. 5. Eldra P. Solomon, Linda R. Berg, Diana W. Martin (2005), Biologia. 6. Wikipedia, the free encyclopedia, (13 wrzesień 2013), Warburg effect. 7. zdrowosfera.pl (2 wrzesień 2013), Dr Otto Warburg i jego badania nad tlenem