Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii. Określanie liczby chromosomów w komórkach

Transkrypt

1 Wydział Chemiczny Politechniki Gdańskiej Katedra Technologii Leków i Biochemii Biologia komórki Określanie liczby chromosomów w komórkach WSTĘP Obserwacje chromosomów prowadzone są w celu: a) określenia ich ilości w komórce tzw. ploidalności; b) po odpowiednim wybarwieniu można stwierdzić zmiany w morfologii chromosomów (np. uszkodzenia typu utraty części chromosomu, wymiany między chromatydami siostrzanymi itp.). Chromosomy mogą być też barwione po częściowym nadtrawieniu enzymami proteolitycznymi np. trypsyną co pozwala na wyróżnienie tzw. pasm G-ciemnych i G-jasnych (ang. G-dark and G-light bands). Badania wskazują na występowanie subtelnych różnic strukturalnych i funkcjonalnych między tymi obszarami chromosomów np. w pasmach ciemnych G lokalizowane są sekwencje bogate w pary AT a także sekwencje minisatelitarne. Pasma jasne G zawierają u człowieka sekwencje Alu bogate w pary GC, mogące przyjmować konformację Z-DNA. Jak wykazano pasma jasnych G zawierają wcześnie replikowane geny takie jak geny np. typu housekeeping, pasma ciemnych G - geny późno replikowane. Obserwacje morfologiczne chromosomów prowadzi się również w komórkach traktowanych substancjami biologcznie czynnymi. Na przykład wiele leków przeciwnowotworowych wywołuje blokowanie progresji cyklu komórkowego w późnych fazach, głównie między końcem fazy S i wejściem do mitozy, ze względu na uszkodzenia DNA. Za pomocą innych związków, takich jak np. inhibitory kinaz białkowych - staurosporyna i kofeina, inhibitor fosfataz - kwas okadaikowy, czy nadekspresję białek regulujących przebieg cyklu komórkowego takich jak fosfataza cdc25, komórki zablokowane w np. fazie G2, można zmusić do wejścia w fazę podziału przez wywołanie tzw. przedwczesnej kondensacji chromatyny. Badania efektu przedwczesnej kondensacji chromatyny służą celom poznawczym (poznanie regulacji przejścia między G2 a M) ale mają też znaczenie farmakologiczne, ponieważ przedwczesna kondensacja chromatyny i zmuszenie komórek do wejścia w mitozę przy uszkodzonym genomie powoduje zwiększenie efektu działania leków.

2 Chromosomy są widoczne jako twory morfologiczne tylko w czasie mitozy i mejozy (patrz Rys. 1). Częstość występowania mitoz w populacji komórek rosnących niesynchronicznie jest niewielka (ok. 1-2% populacji), głównie ze względu na krótki czas trwania mitozy i podczas obserwacji chromosomów w komórkach często stosuje się częściową blokadę komórek w metafazie za pomocą związków blokujących tworzenie się wrzeciona mitotycznego np. Rys. 1. Chromosom ludzki wyizolowany w stadium metafazy alkaloidów Vinca. W ten sposób frakcja komórek z wyraźnie wyróżnionymi chromosomami jest większa. Na typową procedurę przygotowania tzw. wymazów chromosomalnych (ang. chromosome spreads) składają się: spęcznienie komórek w roztworze hypotonicznym (zwykle 0.075M roztwór chlorku potasu lub rozcieńczenie zawiesiny komórek wodą destylowaną), utrwalenie chromatyny np. roztworem Carnoy'a i przygotowanie rozmazu na szkiełku mikroskopowym. Wizualizacja chromosomów polega na ich wybarwieniu barwnikami fluorescencyjnymi (DAPI, Hoechst 33258) lub za pomocą barwnika Giemsa. LITERATURA Tam S.W. and Schlegel, R. Quantification of premature and normal mitosis. W: Cell Cycle - Materials and Methods (M. Pagano, ed.), Springer, Berlin-Heidelberg-New York, 1995, pp

3 Tabela 1. Przykłady anomalii chromosomalnych u człowieka anomalia charakterystyka genetyczna objawy kliniczne Zespół Turnera (dysgeneza gonadalna) XO niski wzrost, szczątkowe jajniki i słabo rozwinięte sutki, dziecięcy narząd rodny Zespół Klinefeltera XXY gynekomastia, małe jądra Trisomia X XXX dwa ciałka Barra, prawie normalny fenotyp żeński ze słabo wykształconymi drugorzędowymi cechami płciowymi Zespół Downa trisomia chr. 21 fałd mongolski (epicantus), wysunięty język, hypotonia, upośledzenie umysłowe Trisomia chr. 18 trisomia chr. 18 liczne wady wrodzone, upośledzenie umysłowe Trisomia D trisomia chr. 15 niedorozwój umysłowy, liczne anomalie (np. nadliczbowe palce), rozszczep podniebienia, wady ośrodkowego układu nerwowego i oczu Translokacyjny zespół translokacje 15/21, Downa 21/22 lub 21/21 Zespół Filadelfia delecja jednego ramienia chr. 21 Zespół orofaciodigitalny translokacja części chr. 6 do 1 Zespół Cri du Chat ("koci krzyk") delecja krótkiego ramienia chr. 5 objawy kliniczne podobne do trisomii 21 przewlekła białaczka granulocytarna wada górnej wargi, podniebienia i jamy ustnej, grube palce o krótkich paznokciach niedorozwój umysłowy, nieprawidłowości budowy twarzy

4 Tabela 2. Liczba chromosomów u wybranych gatunków organizmów. ogórek 14 groch 14 jęczmień 14 arbuz 22 fasola 22 kapusta 18 rzodkiewka 18 tytoń 48 śliwa 48 obleniec 2 muszka owocowa 8 ropucha 22 chomik 22 żaba 26 mysz 40 szczur 42 jeż 48 koń 66 kaczka krzyżówka 80 krab 200 rezus 42 człowiek 46 szympans 48 orangutan 48

5 CZĘŚĆ PRAKTYCZNA Roztwory: 0.075M roztwór chlorku potasu utrwalacz Carnoy'a: świeżo sporządzona mieszanina 1:3 obj. (v/v) lodowatego kwasu octowego i metanolu barwnik Giemsa, rozcieńczony 1:20 w wodzie destylowanej roztwór soli fizjologicznej PBS Sprzęt: probówki wirówkowe pipety automatyczne 200 µl i 1000 µl pipety automatyczne 5 ml szkiełka mikroskopowe mikroskop świetlny Przygotować zawiesinę komórek (ok. 1 mln. komórek na próbkę), do osadu komórek dodać 5 ml PBS, odwirować przez 5 min. przy ok obr./min. i rozpipetować osad komórek w pozostałości nadsączu do uzyskania jednolitej zawiesiny. Dodać 4 ml 0.075M chlorku potasu i pozostawić na 10 min. w temperaturze pokojowej. Odwirować jak wyżej, nadsącz odrzucić. Zawiesić komórki w pozostałości nadsączu. Dodawać po kropli 4 ml utrwalacza Carnoy'a powoli mieszając zawiesinę na wytrząsarce, odstawić na 15 min. w temperaturze pokojowej. Zwirować komórki, przepłukać osad dwukrotnie 4 ml utrwalacza, za każdym razem mieszając zawiesinę komórek z nowymi porcjami utrwalacza i pozostawiając komórki w utrwalaczu na ok. 15 min. Po ostatnim wirowaniu zawiesić komórki w pozostałości utrwalacza (ok µl). Nakropić zawiesinę komórek (1-2 krople na szkiełko) na szkiełko mikroskopowe z wysokości ok cm za pomocą pipety automatycznej. Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, zalać preparat roztworem barwnika Giemsa (rozcieńczonego 1:20 wodą destylowaną) na 5-7 min., przepłukać wodą destylowaną, zanurzyć do 90% etanolu na kilka sekund. Wysuszyć na powietrzu i obserwować pod powiększeniem x. Przygotować dodatkowo jeden preparat chromosomalny na każdą grupę i nie barwić. Opisać preparat (z numerem grupy i datą ćwiczenia) i oddać prowadzącemu ćwiczenie. Określić liczbę chromosomów w badanych komórkach. Zaobserwować różnicę w kształcie i wielkości chromosomów. SPRAWOZDANIE Podać wyznaczoną średnią ilość chromosomów w otrzymanych do badania komórkach (zliczonych z minimum trzech różnych metafaz). Na podstawie załączonego zdjęcia preparatu wykonanego przy pomocy prowadzącego, opisać wygląd wyizolowanych chromosomów i określić z jakich komórek (mysich czy ludzkich) pochodzą te chromosomy? Odpowiedź uzasadnić.