WPŁYW MATERIAŁÓW UWALNIAJĄCYCH FLUOR NA SKŁAD PŁYTKI NAZĘBNEJ

Transkrypt

1 MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2008, 60: Małgorzata Płuciennik, Danuta Sakowska, Zbigniew Krzemiński, Danuta Piątowska WPŁYW MATERIAŁÓW UWALNIAJĄCYCH FLUOR NA SKŁAD PŁYTKI NAZĘBNEJ Zakład Stomatologii Zachowawczej UM w Łodzi Kierownik: dr n. med. M. Płuciennik Zakład Mikrobiologii Lekarskiej UM w Łodzi Kierownik: prof. dr hab. Z. Krzemiński Oceniano wpływ trzech materiałów uwalniających in vivo fluor na skład bakteryjnej flory płytki nazębnej po 10 tygodniach od chwili wprowadzenia ich do ubytków kl V. Wyróżnia się cztery czynniki powodujące powstawanie próchnicy: obecność w jamie ustnej bakterii próchnicotwórczych, obecność węglowodanów w diecie, podatność tkanek twardych zęba na próchnicę oraz czas działania kwasów na tkanki zęba. Kluczowym pierwiastkiem w zapobieganiu zarówno próchnicy pierwotnej jak i wtórnej jest fluor, pochodzący z diety i wody pitnej. Podejmowane były również próby udowodnienia hamującego wpływu materiałów bezsrebrowych do wypełnień uwalniających fluor na wzrost flory bakteryjnej płytki nazębnej rosnącej na tych wypełnieniach (1, 4, 5, 22, 23), ale autorzy badający te materiały różnili się w ocenie ich wpływu na bakterie płytki nazębnej. Celem pracy była ocena wpływu bezsrebrowych materiałów uwalniających fluor na liczebność bakterii płytki nazębnej. MATERIAŁ I METODY Do badań zakwalifikowano 17 pacjentów z dobrą higieną jamy ustnej, w wieku od 23 do 54 lat, u których wskaźnik próchnicy zębów (PUW) wahał się od 12 do 26. U pacjentów tych wykonano w Zakładzie Stomatologii Zachowawczej UM w Łodzi 51 wypełnień klasy V z następujących materiałów bezsrebrowych: szkłojonomeru konwencjonalnego Ketac Molar firmy Espe, Niemcy - 17 wypełnień; szkłojonomeru modyfikowanego żywicą Fuji II LC firmy GC, Japonia -17 wypełnień; materiału złożonego Charisma firmy Heraeus Kulzer, Niemcy - 17 wypełnień. U każdego z 17 pacjentów wykonano, w kłach lub zębach przedtrzonowych, trzy różne wypełnienia z w/w materiałów. Procedura zakładania wypełnień została przeprowadzona zgodnie z zaleceniami producenta. Po 10 tygodniach z powierzchni wypełnień oraz szkliwa zdrowych zębów kłów lub przedtrzonowców (grupa porównawcza) pobrano do badań bakteriologicznych trzydniową płytkę nazębną. Ogółem zebrano 68 płytek. Pacjenci stosowali niezmienione zabiegi higie-

2 132 M. Płuciennik i inni Nr 2 niczne jamy ustnej od chwili założenia wypełnień do trzeciego dnia przed pobraniem z ich powierzchni płytki nazębnej. Metodyka badania mikrobiologicznego była wcześniej zastosowana w pracy Larmasa i wsp. (10), z tą różnicą, że w stosowanej przez nas metodzie zastąpiliśmy szkło, na które pobierano płytkę, folią aluminiową. Płytkę nazębną zbierano zgłębnikiem z powierzchni wypełnień oraz szkliwa i umieszczano na skrawkach folii aluminiowej, uprzednio zważonej i wyjałowionej. Próbki płytki w ciągu 10 minut przenoszono do Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Uniwersytetu Medycznego w Łodzi. Po zważeniu folii z próbką i uwzględnieniu wagi samej folii uzyskiwano tzw. mokrą masę płytki nazębnej. Płytkę nazębną przenoszono następnie z folii do 7 ml 0,85% w/v roztworu NaCl zredukowanego chlorowodorkiem cysteiny i rozbijano przez 30 sekund w dezintegratorze ultradźwiękowym o mocy 100 W przy amplitudzie fali 5 µm (Measuring & Scientific Equipment, Ltd Wielka Brytania) (10). Tak uzyskaną zawiesinę płytki nazębnej rozcieńczono seryjnie od 10-1 do 10-5 w jałowym, 0,85% w/v roztworze chlorku sodowego i wysiewano rozprowadzając po 0,1 ml na odpowiednim podłożu. W próbkach płytki nazębnej oznaczono ogólną liczbę bakterii rosnących w warunkach tlenowych i beztlenowych, liczbę bakterii próchnicotwórczych - Streptococcus mutans, bakterii z rodzaju Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Veillonella sp. oraz Neisseria sp. Ogólną liczbę bakterii dających się hodować w warunkach tlenowych oznaczono na podłożu Brain Heart Infusion (Becton-Dickinson, USA) z dodatkiem 5% v/v odwłóknionej krwi baraniej. Na podłoże to posiewano próbki płytki nazębnej z rozcieńczeń 10-4 i Posiewy inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach tlenowych przez 48 godzin (7). Ogólną liczbę bakterii rosnących w warunkach beztlenowych oznaczono na podłożu Scheadlera (Becton-Dickinson) z dodatkiem 5% v/v odwłóknionej krwi baraniej, posiewając próbki płytki z rozcieńczeń 10-4 i Posiewy inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach beztlenowych (GasPak anaer, Becton-Dickinson) przez 48 godzin (24). Paciorkowce próchnicotwórcze z gatunku Streptococcus mutans izolowano na podłożu TSY20B. Na podłoże to posiewano próbki płytki nazębnej z rozcieńczeń 10-1 i 10-2 i inkubowano w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych (GasPak anaer, Becton-Dickinson) przez 48 godzin. Kolonie Streptococcus mutans identyfikowano na podstawie redukcji chlorku trójfenylotetrazoliowego (TTC) w obecności mannitolu (6, 17). Paciorkowce izolowano z podłoża z azydkiem sodu (Azide Blood Agar Base, Becton- Dickinson) z dodatkiem 5% v/v odwłóknionej krwi baraniej. Na podłoże posiewano próbki płytki nazębnej z rozcieńczeń 10-4 do 10-5 i inkubowano w temperaturze 37 C, w warunkach beztlenowych (GasPak anaer, Becton-Dickinson) przez 48 godzin (11). Pałeczki z rodzaju Lactobacillus izolowano z podłoża Rogosy (Rogosa SL Agar, Becton-Dickinson) z posiewu nierozcieńczonej próbki płytki nazębnej. Inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach beztlenowych (GasPak anaer, Becton-Dickinson) przez 48 godzin (15). Bakterie z rodzaju Veillonella izolowano na podłożu Bacto Veillonella Agar (Difco) z posiewu próbki nierozcieńczonej i rozcieńczonej Podłoże inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach beztlenowych (GasPak anaer, Becton-Dickinson) przez 48 godzin (16). Bakterie z rodzaju Neisseria izolowano z podłoża Chocolate Agar (biomerieux, Francja). Na podłoże posiewano próbki płytki nazębnej z rozcieńczenia 10-2, 10-3 i Posiane

3 Nr 2 Wpływ fluoru na florę bakteryjną zębów 133 podłoża inkubowano w temperaturze 37 C w warunkach tlenowych w ciągu 48 godzin (7). Z wyrosłych na podłożu kolonii wykonywano preparat barwiony metodą Grama i test na oksydazę cytochromową (8). Do rodzaju Neisseria zaliczono Gram-ujemne dwoinki dające dodatni test na oksydazę cytochromową. Po okresie inkubacji liczono kolonie na poszczególnych podłożach i po uwzględnieniu stopnia rozcieńczenia próbki ustalono dla poszczególnych drobnoustrojów liczbę jednostek tworzących kolonie (Colony Forming Units - CFU) w przeliczeniu na l g płytki nazębnej. Z uwagi na małą liczebność grupy osób, od których pobierano materiał, sprawdzono, czy rozkłady ocenianych w badaniu parametrów mają rozkład normalny czy logarytmiczno-normalny. Zastosowano w tym celu test Shapiro-Wilka (18, 19). Okazało się, że badane parametry nie mają rozkładów normalnych ani logarytmiczno-normalnych, co więcej, w większości ich rozkłady są asymetryczne. Do porównania parametrów położenia użyto jednoczynnikowej nieparametrycznej analizy wariancji, tj. test Kruskala-Wallisa (9). Do opisu danych wykorzystano wartości średnie, odchylenia standardowe, mediany oraz wartości minimalne i maksymalne. Dla wszystkich stosowanych testów statystycznych przyjęto poziom istotności α = 0,05. WYNIKI Jak wynika z tabeli I prawdopodobieństwo odpowiadające, obliczone na podstawie próby, wartości statystyki będącej podstawą testu Kruskala Wallisa jest większe od 0,05 (tj. od przyjętego poziomu istotności). Nie można zatem stwierdzić, że parametry położenia dla Streptococcus mutans, Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Veillonella sp., Neisseria sp., bakterii dających się hodować w warunkach tlenowych i beztlenowych oraz udziału procentowego Streptococcus mutans w Streptococcus sp. różnią się w zależności od preparatu w sposób istotny statystycznie. Z przeprowadzonych badań wynika, że w trzydniowych płytkach nazębnych zebranych z materiałów do wypełnień takich jak: Ketac Molar, Fuji II LC, Charisma po 10 tygodniach od wprowadzenia ich do ubytków nie stwierdza się różnic znamiennych statystycznie w liczebności Streptococcus mutans, Lactobacillus sp., Streptococcus sp., Veillonella sp., Neisseria sp., ogólnie bakterii tlenowych, beztlenowych oraz w stosunku liczby Streptococcus mutans do Streptococcus sp. w porównaniu do grupy porównawczej. Nie stwierdza się ponadto różnic znamiennych statystycznie w/w parametrów pomiędzy badanymi materiałami. DYSKUSJA Badania nad wpływem fluoru na florę płytki nazębnej są prowadzone z użyciem materiałów uwalniających fluor (1, 2, 4, 5, 21, 22, 23). Hamowanie wzrostu bakterii przez materiały niezawierające srebro, zależne jest od czasu, w jakim zostały przebadane po założeniu ich do ubytków. Zdaniem Benellego i wsp. (1) materiały bezsrebrowe wykazywały działanie hamujące na wzrost bakterii płytki nazębnej tylko do 8 tygodni od założenia ich do ubytków. W badaniach po roku i trzech latach, nie zaobserwowano działania hamującego wzrost

4 134 M. Płuciennik i inni Nr 2 bakterii (5, 22, 23). W dostęppnym piśmiennictwie nie znaleźliśmy informacji o wpływie materiałów bezsrebrowych na bakterie płytki nazębnej w okresie od 8 tygodni do 1 roku. Stąd przyjęty przez nas okres 10 tygodni, po którym badaliśmy zebraną z powierzchni materiałów i szkliwa płytkę nazębną. Chcieliśmy w ten sposób wyjaśnić jak wybrane przez nas materiały działają na florę płytki nazębnej po okresie dłuższym o 2 tygodnie od przyjętego w badaniach innych autorów. Materiały wybrane do naszych badań to: szkłojonomer konwencjonalny Ketac Molar, szkłojonomer modyfikowany żywicą Fuji II LC oraz materiał złożony wzbogacony o fluor - Charisma. Według producentów wszystkie te materiały zawierają fluor. Celem naszych badań było uzyskanie wglądu w działanie na florę bakteryjną płytki nazębnej materiałów dotąd nie badanych w tym kierunku. Do badań wybraliśmy ubytki klasy V, ponieważ z powierzchni wypełnień tej klasy łatwo można zebrać płytkę nazębną. Wypełnienia w naszym badaniu założyliśmy tylko do kłów i przedtrzonowców w szczęce albo w żuchwie, aby ujednolicić warunki formowania się płytki na wypełnieniach i szkliwie kontrolnym, zależne od odległości od ślinianek. Wyniki naszego badania są zobiektywizowane, pomimo nieidentycznych a tylko zbliżonych wielkości badanych wypełnień poprzez przeliczenie liczb bakterii na 1 g mokrej masy płytki. Pacjenci w naszym eksperymencie przez 10 tygodni (oprócz ostatnich trzech dni formowania się płytki nazębnej) stosowali zwykłą dla siebie higienę jamy ustnej. Takie same warunki spełniali pacjenci w badaniu Forssa i wsp. (4), gdzie zęby z umieszczonymi na ich zewnętrznej powierzchni badanymi materiałami były normalnie szczotkowane przez pacjentów. W naszym badaniu rozszerzyliśmy zainteresowanie bakteriami płytki nazębnej poza gatunek Streptococcus mutans, rodzaj Streptococcus i rodzaj Lactobacillus. Obserwowaliśmy również wzrost rodzaju Veillonella i Neisseria. Bakterie z rodzaju Veillonella zasiedlające płytkę nazębną, same nie rozkładają cukrów z powodu braku glukokinazy i fruktokinazy. Wykorzystują natomiast do swoich przemian metabolicznych mleczany produkując ostatecznie kwas propionowy i octowy (14). Kwasy te w mniejszym stopniu zakwaszają środowisko niż kwas mlekowy produkowany przez Streptococcus mutans i Lactobacillus sp. Istnieją dwa poglądy na wpływ bakterii z rodzaju Veillonella na próchnicę. Pierwszy z nich głosi, że bakterie te podwyższają ph płytki, mogąc w ten sposób spowalniać demineralizację twardych tkanek zęba. Dowody znaleziono prowadząc badania na zwierzętach gnotobiotycznych. U szczurów zakażonych Streptococus mutans razem z gatunkami Veillonella stwierdzono mniejsze uszkodzenie szkliwa, niż u zwierząt zakażonych tylko paciorkowcami (12). Również badaniami in vivo w środowisku ludzkiej jamy ustnej potwierdzono ten pogląd (13). Drugi z poglądów głosi, że nie ma pewności co do właściwości opóźniających demineralizację twardych tkanek zęba, przypisywanych gatunkowi Veillonella. Pojawiły się wątpliwości dotyczące oddziaływań między paciorkowcami i Veillonella sp. Możliwe jest, że ich zależność jest w rzeczywistości protokooperacją. Oznacza to, że stałe zużywanie gromadzącego się produktu przemiany materii polepsza warunki wzrostu bakterii, co prowadzi do większego wydzielania kwasu mlekowego i namnażania się wytwarzających go bakterii. Najnowsze badania wykazały zwiększenie liczby paciorkowców i gatunków Veillonella w warunkach obniżonego ph po zwiększonej podaży glukozy (3). Szczepy Neisseria również są zdolne do rozkładu kwasu mlekowego. Biorąc pod uwagę obydwa

5 Nr 2 Wpływ fluoru na florę bakteryjną zębów 135 Tabela I. Liczba komórek bakteryjnych w płytce nazębnej na dziesięciotygodniowych materiałach i szkliwie Preparat Streptococcus mutans płytki) 10 6 Streptococcus sp. płytki) 10 8 Parametry statystyczne Lactobacillus sp. płytki) 10 3 Veillonella sp. płytki) 10 6 Neisseria sp. płytki) 10 8 Bakterie beztlenowe płytki) 10 8 Bakterie tlenowe płytki) 10 8 Procentowy udział Streptococcus mutans w ogólnej liczbie Streptococcus sp. Ketac- Molar średnia ± odch. stand. mediana min maks 7,35 ± 17,61 0,22 0,00 70,00 113,4 ± 208,9 30,0 0,00 857,1 7,17 ± 17,61 0,00 0,00 71,00 1,41 ± 3,70 0,12 0,00 15,00 1,16 ± 1,86 0,07 0,00 5,83 601,2 ± 865,8 166,7 0, ,3 276,4 ± 376,7 107,8 0, ,0 5,38 ± 14,23 0,20 0,00 50,00 Fuji II LC średnia ± odch. stand. mediana min maks 6,08 ± 8,95 2,00 0,00 29,00 412,9 ± 953,7 64,7 1, ,0 1,60 ± 4,31 0,00 0,00 17,00 1,21 ± 1,95 0,12 0,00 6,67 16,76 ± 46,73 0,44 0,00 183,33 643,4 ± 1151,8 190,0 11, ,0 570,5 ± 1139,1 152,4 8, ,0 3,60 ± 8,35 0,33 0,00 31,43 Charisma średnia ± odch. stand. mediana min maks 17,39 ± 65,14 0,36 0,00 270,00 75,5 ± 107,0 30,0 0,42 377,8 3,12 ± 8,13 0,00 0,00 33,00 0,27 ± 0,41 0,07 0,00 1,33 1,73 ± 3,69 0,22 0,00 15,00 299,7 ± 366,3 100,0 1, ,5 171,7 ± 222,7 76,9 0,42 833,3 3,21 ± 6,74 0,30 0,00 26,67 Szkliwo średnia ± odch. stand. mediana min maks 11,89 ± 24,61 3,45 0,00 100,00 86,1 ± 191,3 25,0 1,20 733,3 0,22 ± 0,85 0,00 0,00 3,50 0,69 ± 1,04 0,21 0,00 4,00 3,47 ± 12,01 0,25 0,00 50,00 344,5 ± 782,3 70,2 0, ,7 360,0 ± 684,3 46,8 0, ,0 9,25 ± 15,47 3,10 0,00 50,00 Prawdopodobieństwo w teście Kruskala - Wallisa 0,2693* 0,2894* 0,1549* 0,6872* 0,5687* 0,3661* 0,4220* 0,3098*

6 136 M. Płuciennik i inni Nr 2 poglądy, wpływ badanych przez nas materiałów na wzrost Veillonella i Neisseria mógłby modulować powstawanie próchnicy. W naszym doświadczeniu nie zaobserwowaliśmy wpływu badanych materiałów na liczbę obydwu rodzajów bakterii w badanych płytkach nazębnych. W obecnej pracy płytkę nazębną naddziąsłową przebadano również pod kątem ogólnej liczby beztlenowców. Spośród bakterii bezwzględnie beztlenowych wytwarzających kwasy, a odnajdywanych w płytce nazębnej należy wymienić rodzaj Prevotella, Fusobacterium oraz Treponema. Choć patogeny te są związane w największej mierze z chorobami przyzębia, to jednak poprzez zdolności wytwarzania kwasów przyczyniają się również do podtrzymywania procesu demineralizacji. Badając liczebność bakterii dających się hodować w warunkach beztlenowych i tlenowych chcieliśmy sprawdzić ogólnie zmiany liczebności bakterii w badanych płytkach, ale nie zaobserwowaliśmy wpływu badanych materiałów na liczbę bakterii wykrywanych w płytce nazębnej (Tabela I). W naszym badaniu po 10 tygodniach nie było różnic statystycznie znamiennych między liczbą Streptococcus mutans, całkowitą liczbą Streptococcus sp., Lactobacillus sp., Neisseria sp., Veillonella sp., liczbą bakterii tlenowych i beztlenowych oraz stosunku Streptococcus mutans do Streptococcus sp. na badanych powierzchniach szkłojonomeni konwencjonalnego (Ketac Molar), hybrydowego (Fuji II LC) oraz materiału złożonego zawierającego fluor (Charisma). Analogiczne badania przeprowadzone przez Forssa i wsp.(4), w których badana była płytka po 6 tygodniach od wprowadzenia ich do ubytków wykazały, że całkowita liczba Streptococcus mutans w próbkach płytek zebranych z materiału szkłojonomerowego (Ketac Fil) była znacząco niższa niż w próbkach zebranych z materiału złożonego nieuwalniającego fluoru (Silar). Benelli i wsp.(1) podali, że o ile po 8 tygodniach mniej Streptococcus mutans wzrastało na szkłojonomerze (Chelon Fil), niż na materiale złożonym nieuwalniającym fluoru (Silux Plus), to w liczebnościach Lactobacillus sp. nie było różnic znamiennych statystycznie. Wyniki dwóch opisywanych wyżej badań zasługują na uwagę, ponieważ autorzy zadbali o wysoce wystandaryzowany model badawczy, tworząc dla materiałów o tych samych wymiarach specjalne nakładki zakładane na łuki zębowe (4) oraz specjalne cylindry z materiałów dla gromadzenia się płytki nazębnej, które były przytwierdzone do przedsionkowej powierzchni zębów (1). W pozostałych badaniach nad wzrostem bakterii płytki nazębnej na bezsrebrowych materiałach do wypełnień uwalniających fluor (prowadzonych na rocznych i trzyletnich wypełnieniach) nie zauważono ich hamującego wpływu na florę bakteryjną płytki (5, 22, 23). WNIOSEK Wyniki naszych badań wskazują, że okres utraty hamującego działania na florę płytki nazębnej materiałów uwalniających fluor przypada na trzeci miesiąc przebywania materiału w jamie ustnej..

7 Nr 2 Wpływ fluoru na florę bakteryjną zębów 137 M. Płuciennik, D. Sakowska, Z. Krzemiński, D. Piątowska INFLUENCE OF THE FLUORIDE RELEASING DENTAL MATERIALS ON THE BACTERIAL FLORA OF DENTAL PLAQUE SUMMARY The assessment of influence of silver-free, fluor releasing dental materials on dental plaque bacteria quantity. 17 patients were included into the study. 51 restorations were placed following manufacturers recommendations. Following materials were used: conventional glassionomer Ketac-Molar ESPE, resin modified glassionomer Fuji II LC GC and fluor containing composite Charisma Heraeus Kulzer Class V restorations were placed in following teeth of upper and lower jaw: canines, first bicuspids, second bicuspids. Sound enamel was a control. After 10 weeks the 72 hours old dental plaque was collected from surface of restorations and control using sterile probe. Total amount of 68 dental plaques were investigated. Each plaque was placed on scaled and sterile aluminum foil. The moist weight of dental plaque was scaled. Dental plaque was moved into 7 ml 0,85% NaCl solution reduced by cystein chlorine hydrogen and disintegrated by ultrasounds (power:100 Watt, wave amplitude: 5µm). The suspension of dental plaque was serially diluted from 10 4 to 10 5 in sterile 0,85% NaCl solution, and seeded with amount of 0,1 ml on appropriate base. In dental plaque trials the amount of cariogenic bacteria was calculated - Streptococcus mutans, Streptococcus, Lactobacillus, Veillonella and Neisseria, and also total amount of aerobic and anaerobic bacteria was measured. Microbiologic studies were performed in Institute of Microbiology, Medical University, Łódź. Statistical analysis of collected data was accomplished. In 72 hours old dental plaques collected from the surfaces of Ketac -Molar, Fuji II LC, Charisma after 10 weeks since being placed into the class V cavity, results show no statistically significant differences in the amount of Streptococcus mutans, Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Veillonella spp., Neisseria spp, in total amount of aerobic and anaerobic bacteria and in the quantity proportion of Streptococcus mutans versus Streptococcus spp. in comparison with control trail. Results show no statistically significant differences in the amount of listed above bacteria and in the proportion of Streptococcus mutans versus Streptococcus spp. in 72 hours old dental plaques collected from surfaces of investigated restorative materials PIŚMIENNICTWO 1. Benelli E.M., Serra M.C., Rodriques Jr. A.L., Cury J.A. In situ anticariogenic potential of glass ionomer cement. Caries Res 1993; 27: Berg JH, Farell JE., Brown LR.: Class II glass ionomer silver cement restorations and their effect on interproximal growth of mutans Streptococci. Pediatr Dent 1990; 12: Bradshaw DJ, Marsh PD. Analysis of ph-driven disruption of oral microbial communities in vitro. Caries Res 1998; 32: Forss H, Jokinen J, Spets-Happonen S i inni Fluoride and mutans streptococci in plaque grown on glass ionomer and composite. Caries Res., 1991,25, Forss H., Nase L., Seppä L. Fluoride concentration, mutans streptococci and lactobacilli in plaque from old glass ionomer fillings. Caries Res 1995; 29: Gold OG, Jordan HV, Van Houte J. Identification of Streptococcus mutans colonies by mannitoldependent tetrazolium reduction. Arch Oral Biol 1974; 19: Hunt D.E., Sandham H.J., Glimore R.W. Evolution of plating media for the determination of viable microorganisms in dental plaque. Appl Microbiol 1969; 17: Kędzia W. Diagnostyka mikrobiologiczna w medycynie. Warszawa 1990; PZWL:

8 138 M. Płuciennik i inni Nr 2 9. Kruskal W.J., Wallis W.A. Use of ranks in one-criterion analysis of variance. J Amer Statist Assoc 1952; 47: Larmas E.L., Makinen K.K., Scheinin A. Turku sugar studies. VIII. Principal microbiological findings. Acta Odont Scand 1975; 70: Mallmann W.L., Seligman E.B. A comparative study of media for the detection of Streptococcus in water and sewage. Am J. Publ Hlth 1950; 40: Mikx FHM, van der Hoeven JS, Konig KG, Plasschaert AJ, Guggenheim B. Establishment of defined microbial ecosystems in germ free rats. I. Effect of interaction of Streptococcus mutans or Streptococcus sanguis with Veillonella alcalescens on plaque formation and caries activity. Caries res 1972; 6: Minah GE, Lovekin GB, Finney JP. Surcose induced ecological response of experimental dental plaques from caries free and caries susceptible human volunteers. Infect Immun 1981; 12: Rogosa M. The genus Veillonella. I. General cultural ecological and biochemical consideration. J Bacteriol 1964; 87: Rogosa M, Fitzgerald M.E., MacKintosh, Beaman A.J. Improved medium for selective isolation of Veillonella. J Bacteriol 1958; 76: Rogosa M., Mitchell J.A., Wiesman R.A. A selective medium for the isolation and numeration of iral lactobacilli. J Dent Res 1951; 30: Schaeken M.J., van der Hoeven J.S., Franken H.C. Comparative recovery of Streptococcus mutans on five isolation media, including a new simple selective medium. J Dent Res 1986; 65: Shapiro S.S., Wilk M.B., Chen H.J. A comparative study of various tests for normality. J Amer Statist Assoc 1968; 63: Shapiro S.S., Wilk M.B. An analysis of variance test for normality (complete samples). Biometrika, 1965; 52: Svanberg M., Krasse, B. Ornerfeldt, H.-O. Mutans streptococci in interproximal plaque from amalgam and glass ionomer restorations. Caries Res 1990; 24: Svanberg M., Mjor L.,Orstavik D. Mutans streptococci in plaque from margins of amalgam, composite and glass ionomer restorations. J Dent Res 1990; 69: Van Dijken J.W.V., Kalfas S., Litra V, Oliveby A. Fluoride and mutans streptococci levels in plaque on aged restorations of resin-modified glass ionomer cement, compomer and resin composite. Caries Res 1997; 31: Van Dijken J.W.V., Persson S., Sjöstrom S.: Presence of Streptococcus mutans and lactobacilli in saliva and enamel, glass ionomer cement and composite resin surfaces. Scand J Dent Res 1991; 99: Wilkins T.D., Chalgren S. Medium for use in antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria. Eur J Clin Microbiol 1987; 6: Otrzymano: 15 I 2008 r. Adres Autora: Łódź, Zakład Stomatologii Zachowawczej UM w Łodzi