(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 5/0775 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/34 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Sposób ekspansji dorosłych komórek macierzystych z krwi, szczególnie krwi obwodowej i odnośne zastosowanie w dziedzinie medycyny (30) Pierwszeństwo: IT RM (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/28 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2014/01 (73) Uprawniony z patentu: THANKSTEM S.R.L., Udine, IT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ALESSANDRA GAMBACURTA, Roma, IT MARCO POLETTINI, Sutri, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis [0001] Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu ekspansji komórek macierzystych z krwi, szczególnie, ale nie jedynie, krwi obwodowej, od dorosłych ssaków i odnośnego zastosowania w dziedzinie medycyny, szczególnie w dziedzinie weterynarii, do leczenia obrażeń, przewlekłych i/lub ostrych zapalnych zmian patologicznych, neurologicznych i neurodegeneracyjnych zmian patologicznych. [0002] Stosowane w niniejszym opisie oraz w literaturze słowo "ekspansja" oznacza proces zwiększania liczby komórek poprzez podział komórkowy lub, w specyficznym przypadku opisanym i zastrzeżonym, poprzez "odróżnicowywanie", to znaczy proces, poprzez który komórki obecne we krwi są przekształcane w komórki macierzyste po odpowiednim potraktowaniu in vitro, jak zostanie pokazane poniżej. [0003] W ostatnich latach zastosowanie komórek macierzystych w leczeniu cieszyło się dużym zainteresowaniem ze względu na sukcesy w leczeniu różnych zmian patologicznych, które uważano wcześniej za nieuleczalne. Jednakże, proces uzyskiwania komórek macierzystych znany do tej pory był pracochłonny i drogi. [0004] Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są źródłem dostępnym nie tylko do badań, ale również do tworzenia leków i przeszczepów (Wagers A. J. et al., 2002; Griffith L. G. et al., 2002). [0005] Istnieją dwie duże kategorie komórek macierzystych, embrionalne i dorosłe: pierwsze pochodzą od embrionów, a dokładniej od 8-dniowych blastocyst, podczas gdy będące ich przeciwieństwem dorosłe komórki macierzyste można uzyskiwać głównie ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub mięśniowej i z krwi obwodowej. [0006] Definicja komórek macierzystych nieustannie ewoluuje i obecnie nie istnieje ogólna zgodność lub standardowy sposób ich izolowania lub identyfikowania. Dla tych wszystkich komórek, embrionalnych (ES) i dorosłych, zarówno hematopoetycznych (HSC), jak i mezenchymalnych (MSC) (Kuwana M. et al., 2003), zidentyfikowano różne markery genetyczne, z których niektóre są wspólne dla wielu typów komórek (Condomines M. et al., 2006; Kang W. J. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976). [0007] W szczególności, Zhao Y. et al, zarówno w artykule "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells", jak i w WO 2004/043990, ujawnia sposób otrzymywania komórek macierzystych pochodzących od monocytów, który obejmuje etapy izolowania monocytów z krwi obwodowej, kontaktowania ich ze składnikiem mitogennym, a następnie hodowania monocytów z krwi obwodowej w warunkach odpowiednich do namnażania się komórek. [0008] Sposób ten, który wymaga po pierwsze etapu izolowania monocytów, a po drugie etapu ekspansji w pożywce hodowlanej, obejmuje bardzo długi czas uzyskania znaczącej liczby komórek macierzystych, rzędu dni i nie ma możliwości uzyskania w nim komórek macierzystych typu totipotencjalnego, to znaczy niewyspecjalizowanych, odpowiednich do bezpośredniego zaszczepiania u pacjenta w bardzo krótkim czasie od pierwszego pobrania. [0009] W licznych pracach naukowych opisano zdolność komórek macierzystych do regenerowania

3 2 różnych typów obrażeń, przy czym regenerują one tkanki, które są uszkodzone mechanicznie lub uszkodzone poprzez różne zmiany patologiczne, eliminując źródło, które powoduje powstałą zmianę patologiczną, a nie po prostu działając na jej efekty. [0010] Obecnie, badania zorientowano bardziej na zastosowanie komórek macierzystych wyizolowanych z tkanki embrionalnej, płodów lub pępowiny, ale wywołuje to różne pytania natury prawnej i etycznej. Przede wszystkim, aktualnie zastosowanie tych komórek niesie różne przeciwwskazania, takie jak: ryzyko infekcji, odrzucenia przy przeszczepieniu oraz, u koni, powstawanie potworniaków. [0011] Dla uniknięcia tych problemów pomyślano zatem o zastosowaniu terapii "in vivo" autologicznymi komórkami macierzystymi, wyizolowanymi korzystnie ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub krwi obwodowej. Sposoby te, stosowane przy wychodzeniu od dorosłych komórek macierzystych, zapewniają etap różnicowania "in vitro" (lub "ex vivo") komórek macierzystych w linii komórkowej pożądanej poprzez specyficzne czynniki indukujące różnicowanie oraz kolejny etap przeszczepiania "in vivo" uzyskanych, zróżnicowanych linii komórkowych. W sposobach tych ograniczenie wynika z faktu, że obserwowane zjawisko odrzucania występuje ze względu na to, że zróżnicowane komórki wprowadzane ponownie do pacjenta nie są rozpoznawane jako komórki własne, ponieważ podczas etapu różnicowania indukowanego in vitro tracą one czynniki rozpoznawania siebie. [0012] U człowieka pobieranie komórek macierzystych z krwi obwodowej pociąga za sobą konieczność oczyszczania ich poprzez proces nazywany "aferezą" lub "leukaferezą". W praktyce, komórki są ekstrahowane z krwi, zbierane, a następnie wszczepiane pacjentom tuż po chemio- lub radioterapii. W aferezie, która trwa od 6 do 8 godzin, krew jest pobierana z żyły z kończyny górnej lub żyły z szyi lub klatki piersiowej i przepuszczana przez urządzenie, które usuwa komórki macierzyste. Oczyszczona w ten sposób krew powraca do pacjenta, podczas gdy komórki są zbierane i zachowywane poprzez chłodzenie w ciekłym azocie (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006). Technika ta jest dla pacjenta nie tylko bolesna, ale również niezwykle stresująca. Ponadto, niemożliwe jest jej stosowanie dla zwierząt małych ani dużych; przede wszystkim, technika ta nie zapewnia prawdziwego rozróżnienia i/lub oczyszczenia krążących komórek macierzystych. [0013] W nauce weterynaryjnej komórki macierzyste stosuje się obecnie z powodzeniem głównie w rekonstrukcji uszkodzonych ścięgien i więzadeł. Główne techniki oczyszczania stanowią: - zastosowanie czynników wzrostu lub pochodnych płytkowych (TGF-B, VEGF), ale ekonomiczne koszty ich ekstrahowania są zaporowe (Hou M. et al., 2006); - izolacja komórek macierzystych pobieranych ze szpiku kostnego. Technika ta pozwala na oczyszczanie, a następnie zastosowanie do leczenia jedynie 15% komórek zawartych w wyekstrahowanym materiale; - izolacja komórek macierzystych pobieranych z tkanki tłuszczowej. Technika ta, która wymaga wcześniejszego, chirurgicznego usunięcia znacznych ilości tkanki od zwierzęcia będącego donorem, nie pozwala na podawanie dożylne; - IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu 1), znany jako tendotrofina (Fiedler J. et al., 2006);

4 3 - UBM (macierz pęcherza moczowego): jest ona wyprowadzana ze świni zawierającej cytokiny (ale nie komórki jądrzaste), które indukują gojenie się rany, ale nie regenerację okolicy z obrażeniami (Zhang Y.S. et al., 2005). [0014] W świetle wszystkich powyższych oczywistym jest, że potrzebne są sposoby ekspansji i oczyszczania dorosłych komórek macierzystych z łatwo dostępnych źródeł, które muszą również pozwalać na uzyskiwanie komórek macierzystych odpowiednich do stosowania jako środek leczniczy w dziedzinie medyczno-weterynaryjnej, które po podaniu ssakowi nie powodują powstania zjawiska odrzucenia i które są łatwe do zachowywania. [0015] Istnieje również oczywista potrzeba uzyskiwania komórek macierzystych typu pluripotencjalnego i totipotencjalnego, to znaczy niewyspecjalizowanych, które można wszczepiać pacjentowi bezpośrednio oraz o znacznie krótszych czasach wytwarzania, niż te zapewniane obecnie. [0016] Twórcy niniejszego wynalazku udoskonalili obecnie sposób ekspansji i oczyszczania in vitro komórek macierzystych z krwi obwodowej tak, aby możliwe było uzyskanie komórek macierzystych, które nie dają efektów ubocznych, takich jak zjawisko odrzucenia, zakażenie, potworniaki, po podaniu dorosłemu ssakowi, są zdolne do bycia różnicowanymi "in vivo" i zachowują się jak komórki macierzyste pluripotencjalne. [0017] Twórcy zaobserwowali, że poddane takiej ekspansji komórki, po wstrzyknięciu miejscowo lub dożylnie, nabywają "in vivo" (a nie "in vitro", jak w sposobach znanych w stanie techniki, poprzez odpowiednie czynniki wzrostu i/lub bodźce chemiczne (Gulati R. et al., 2003; Katz R. L. et al., 2002; Okazaki T. et al., 2005)) wszystkie morfologiczne i chemiczne cechy komórek makrofagów, limfocytów, nabłonkowych, śródbłonkowych, nerwowych i hepatocytów, odpowiednio do potrzeb i zmian patologicznych u leczonych zwierząt. Sposób jest nawet mniej inwazyjny, niż inne sposoby stosowane do tej pory do pobierania komórek macierzystych, bezbolesny (jeśli porówna się go z aferezą), ekonomicznie i technicznie najbardziej odpowiedni do stosowania u wszystkich gatunków zwierząt (małych i dużych). [0018] W końcu, możliwość uzyskiwania tych komórek w łatwy sposób, a następnie możliwość zachowywania ich przez długi czas schłodzonych w ciekłym azocie, czyni komórki uzyskane za pomocą sposobu według wynalazku odpowiednimi do przeszczepów autologicznych, do leczenia wielu zmian patologicznych u człowieka i zwierząt (różnego typu obrażeń, chorób metabolicznych, ostrych i przewlekłych zmian chorobowych neurologicznych i zapalnych). [0019] Niniejszy wynalazek dotyczy zatem specyficznie sposobu ekspansji dorosłych komórek macierzystych z krwi, szczególnie, ale nie tylko, z krwi obwodowej, obejmując następujące etapy. [0020] Pierwszy etap obejmuje dwa podetapy: a) pierwszy podetap ekspansji komórek macierzystych z krwi, w szczególności, ale nie tylko z krwi obwodowej, natychmiast po ich pobraniu, poprzez sposoby traktowania in vitro za pomocą MCSF (czynnika stymulującego wzrost koloni makrofagów) w stężeniu zawartym między 8-15 nm, korzystnie 10 nm; etap ekspansji może mieć różny czas trwania, w zależności od warunków, w których przeprowadza się traktowanie in vitro; twórcy eksperymentalnie zweryfikowali, że czas

5 4 trwania traktowania in vitro za pomocą MCSF, zawierający się między 24 a 96 godzinami, korzystnie między 48 a 72 godzinami, prowadził do stabilizacji ekspansji, przy identyfikacji jednoczesnej obecności markerów CD90, CD34 i mieszaniny CD 90/CD 34. Taki warunek uznano za optymalny. Poprzez "natychmiastowo" rozumiemy najkrótszy możliwy czas pomiędzy pobraniem komórek krwi, a rozpoczęciem traktowania in vitro, w żadnym przypadku nie dłuższy niż 10 minut, korzystnie nie dłuższy niż 5 minut. b) po pierwszym podetapie przeprowadza się drugi podetap oczyszczania, korzystnie poprzez frakcjonowanie w gradiencie Ficollu. Etap oczyszczania jest zasadniczo potrzebny do niszczenia czerwonych krwinek i do hodowania makrofagów i monocytów na płytce. [0021] W związku z tym, w przeciwieństwie do stanu techniki, niniejszy wynalazek zapewnia po pierwsze etap ekspansji komórek poprzez kontaktowanie ich z MCSF i ewentualnie z produktem w postaci antykoagulantu, przykładowo odpowiednią probówką testową; ten etap ekspansji przeprowadza się natychmiast po pobraniu komórek z krwi od pacjenta, bez izolowania ich specyficznych części i bez stosowania jakiejkolwiek pożywki hodowlanej. [0022] Po etapie oczyszczania zapewnia się kolejny etap: c) dalszą ekspansję komórek macierzystych z krwi, szczególnie, ale nie tylko z krwi obwodowej, oczyszczonych w etapie b) poprzez traktowanie in vitro za pomocą MCSF w stężeniu zawierającym się między nm, korzystnie 50 nm, korzystniej 45 nm. [0023] Ten etap również może mieć różny czas trwania, między 24 a 96 godzinami, korzystnie między 48 a 72 godzinami. [0024] Zaobserwowano, że przy stosowaniu MCSF w stężeniu większym niż 55 nm (tj. 70 nm) już po 24 godzinach komórki nie utrzymują fenotypu pluripotencjalnych komórek macierzystych (patrz fig. 12). W szczególności, etap a) z wcześniejszej ekspansji w zawiesinie z MCSF natychmiast po pobraniu krwi pozwala na zwiększenie procentu komórek macierzystych w odniesieniu do populacji monocytów i makrofagów (patrz fig. 13). Kolejny etap pozwala na uzyskanie pluripotencjalnych komórek macierzystych, które różnicuje się bezpośrednio in vivo, bez powodowania zjawiska odrzucenia lub infekcji. [0025] Wynalazek dotyczy również zastosowania dorosłych komórek macierzystych, uzyskanych według sposobu ekspansji opisanego powyżej, do otrzymywania środka leczniczego do leczenia obrażeń. Obrażeniami, które można leczyć, są te z grupy, do której należą następujące: obrażenia skórne, obrażenia ścięgien, obrażenia więzadeł, obrażenia kości, obrażenia błon śluzowych u ssaków lub złamania. [0026] Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania dorosłych komórek macierzystych, uzyskanych według sposobu opisanego powyżej, do otrzymywania środka leczniczego do leczenia zmian patologicznych neurologicznych lub neurodegeneracyjnych, wybieranych z grupy obejmującej: chorobę

6 5 Cushinga, drżenie głowy, zespół Wobblera, trudności z oddychaniem, porażenie kończyn; ostre lub przewlekłe zapalne zmiany patologiczne, wybierane spośród ochwatu, zapalenia okostnej, zapalenia żołądka, choroby zwyrodnieniowej stawów, stanów zapalnych powodowanych przez czynniki wirusowe, bakteryjne, pasożytnicze, grzybicze; powiększenia-skręcenia żołądka u ssaków. [0027] Niniejszy wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej, zawierającej, jako substancję czynną, dorosłe komórki macierzyste, uzyskane zgodnie ze sposobem ekspansji opisanym powyżej, razem z farmakologicznie dopuszczalnymi adjuwantami i/lub rozczynnikami. [0028] Według szczególnie korzystnej postaci przykładu wykonania, dorosłe komórki macierzyste, uzyskane według sposobu zdefiniowanego powyżej, zastosowane jako substancja czynna, są obecne w stężeniu zawierającym się między x103 komórek/ml w kompozycji, korzystnie 150x103 komórek/ml, razem z farmakologicznie dopuszczalnymi adjuwantami i/lub rozczynnikami, przy czym wspomniana kompozycja jest formułowana do iniekcji dożylnych. [0029] Według alternatywnej postaci realizacji, dorosłe komórki macierzyste, uzyskane według sposobu ekspansji zdefiniowanego powyżej, zastosowane jako substancja czynna, są obecne w stężeniu zawierającym się między 4-40x10 6 komórek/ml w kompozycji, razem z farmakologicznie dopuszczalnymi adjuwantami i/lub rozczynnikami, przy czym wspomniana kompozycja jest formułowana do aplikacji miejscowej (również powierzchniowej w przypadku ran zewnętrznych). [0030] Kompozycje farmaceutyczne wymienione powyżej mogą również zawierać antybiotyk jako składnik aktywny, w stężeniu zawierającym się między 5-15 nm, korzystnie 10 nm, według szczególnie korzystnej postaci przykładu wykonania wynalazku. Korzystnie wspomniany antybiotyk jest gentamycyną lub amikacyną. [0031] Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji farmaceutycznej, jak zdefiniowano powyżej, (tj. odpowiedniej do aplikacji miejscowej, z lub bez antybiotyku) jako środka leczniczego do leczenia obrażeń wybieranych z grupy składającej się z obrażeń skórnych, obrażeń ścięgien, obrażeń więzadeł, obrażeń kości, obrażeń błon śluzowych u ssaków. [0032] Według innej cechy, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji farmaceutycznej, jak zdefiniowano powyżej (tj. odpowiedniej do aplikacji miejscowej, z lub bez antybiotyku) jako środka leczniczego do leczenia złamań u ssaków. [0033] Niniejszy wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji farmaceutycznej, jak zdefiniowano powyżej (tj. odpowiedniej do podawania dożylnego), jako środka leczniczego do leczenia zmian patologicznych neurologicznych lub neurodegeneracyjnych, wybieranych z grupy obejmującej: chorobę Cushinga, drżenie głowy, zespół Wobblera, trudności z oddychaniem, porażenie kończyn u ssaków. [0034] Według innej postaci przykładu wykonania, wynalazek dotyczy zastosowania kompozycji farmaceutycznej, jak zdefiniowano powyżej (tj. odpowiedniej do podawania dożylnego), jako środka leczniczego do leczenia ostrych lub przewlekłych zapalnych zmian patologicznych, wybieranych spośród ochwatu, zapalenia okostnej, zapalenia żołądka, choroby zwyrodnieniowej stawów, stanów zapalnych

7 6 powodowanych przez czynniki wirusowe, bakteryjne, pasożytnicze, grzybicze. [0035] Wynalazek dotyczy również zastosowania kompozycji farmaceutycznej, jak zdefiniowano powyżej (tj. odpowiedniej do podawania dożylnego), jako środka leczniczego do leczenia zespołu powiększeniaskręcenia żołądka u ssaków. [0036] W korzystnej postaci przykładu wykonania niniejszego wynalazku, zastosowania w dziedzinie medycyny mają korzystne zastosowanie w dziedzinie weterynarii, a leczone ssaki wybiera się spośród koni, psów, kotów lub człowieka. [0037] Niniejszy wynalazek zostanie teraz opisany jako nieograniczający przykład, w korzystnych postaciach jego przykładu wykonania, ze szczególnym odniesieniem do załączonych figur rysunku, przy czym: na Fig. 1 przedstawiono 20 cm obrażenie u klaczy między śródstopiem, a kością pęcinową, z bakteriami Clostridium i uszkodzeniem ścięgna prostowników; na Fig. 2 przedstawiono tę samą klacz co na fig. 1 trzy miesiące po miejscowej aplikacji komórek macierzystych według wynalazku; na Fig. 3 przedstawiono klacz po sześciu miesiącach leczenia; na Fig. 4 przedstawiono badanie ultrasonograficzne konia z obrażeniem 80% ścięgna zginacza powierzchniowego; na Fig. 5 przedstawiono badanie ultrasonograficzne konia około trzy i pół miesiąca po miejscowym leczeniu za pomocą komórek macierzystych według wynalazku; na Fig. 6 przedstawiono badanie ultrasonograficzne konia około trzy i pół miesiąca po miejscowym leczeniu za pomocą komórek macierzystych; na Fig. 7 przedstawiono badanie ultrasonograficzne konia po około czterech miesiącach miejscowego leczenia; należy zauważyć niemal całkowitą regenerację ścięgna i brak tkanki bliznowatej; na Fig. 8 przedstawiono wynik badania ultrasonograficznego klaczy z obrażeniem ścięgna o mniejszej wielkości (średnica mniej niż 1 cm); na Fig. 9 przedstawiono badanie ultrasonograficzne tej samej klaczy co na fig. 7 po miesiącu miejscowego leczenia; na Fig. 10 przedstawiono 17-letniego konia o ogólnym osłabieniu, operowanego na kolkę, przed leczeniem za pomocą komórek macierzystych według wynalazku; na Fig. 11 przedstawiono wygląd 17-letniego konia rok po dożylnym leczeniu za pomocą komórek macierzystych według wynalazku; na Fig. 12 przedstawiono liczbę wyizolowanych komórek hodowanych z krwi obwodowej, traktowanych za pomocą różnych ilości MCSF w etapie c) spośród następujących: 15 nm (linia przerywana z krzyżykami), 25 nm (linia przerywana z trójkątami z wierzchołkami w dół), 35 nm (linia przerywana z trójkątami z wierzchołkami w górę), 50 nm (linia przerywana z wypełnionymi kołami), 60 nm (linia przerywana z pustymi kwadratami), 70 nm (linia przerywana z pustymi

8 7 kołami); wyniki stanowią średnią z komórek zliczonych z trzech próbek z krwi obwodowej; na Fig. 13 przedstawiono liczbę wyizolowanych komórek hodowanych z krwi obwodowej, traktowanych wstępnie za pomocą MCSF (linia przerywana z czarnymi kropkami), nie traktowanych za pomocą MCSF (linia przerywana z krzyżykami); wyniki stanowią średnią z komórek zliczonych z trzech próbek z krwi obwodowej. PRZYKŁAD 1: Ekspansja i oczyszczanie dorosłych komórek macierzystych z krwi obwodowej i ich zastosowania medyczne [0038] Komórki wyizolowane z krwi obwodowej działają "in vivo" jako pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) po ekspansji według wynalazku i są zdolne do wyleczenia, w ciągu kilku miesięcy, obrażeń lub zmian patologicznych nieuleczalnych lub uleczalnych jedynie powoli za pomocą klasycznych metodologii i/lub leków. MATERIAŁY I SPOSOBY Pobieranie próbek [0039] Każda próbka krwi obwodowej składała się z około 5-7 ml, była pobierana od koni i psów z kończyn tylnych i natychmiast umieszczana w probówce testowej, zawierającej, przykładowo, heparynę (150 U) i MCSF (10 nm). [0040] Heparynę można zastępować jednak inną, odpowiednią substancją będącą antykoagulantem. Oczyszczanie [0041] Próbki krwi (5-7 ml) rozcieńczano 1:5 w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem), zawierającym NH 4 Cl (200 mm), dla spowodowania lizy czerwonych ciałek krwi, wirowano przy g, przemywano dwukrotnie za pomocą PBS i wirowano ponownie przy 200 g. Uzyskane komórki jądrzaste inkubowano przez 7-12 godzin w 37 C, korzystnie prz ez godzin i oczyszczano poprzez frakcjonowanie w gradiencie Ficoll, następnie izolowano i przemywano trzy razy za pomocą pożywki RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, Nowy Jork). Po oczyszczeniu komórki, które zawierały około 95% monocytów (jak określano za pomocą analizy cytofluorometrycznej poprzez fotometr przepływowy FACScan-Becton Dickinson), inkubowano przez kolejne 24 godziny w 50 ng/ml MCSF 45 nm, a następnie poddawano ekspansji dla uzyskania liczby komórek niezbędnej do miejscowych terapii lub wirowano przy g i ponownie zawieszano w PBS w stężeniu wynoszącym około 90x10 3 komórek/ml do terapii dożylnych. Hodowle komórkowe [0042] Komórki inkubowano przez 8-12 godzin, korzystnie przez godzin, w 37 C (8% CO 2) na 15 cm płytkach w stężeniu wynoszącym około 2-3 x 105 komórek na płytkę; następnie przemywano pożywką hodowlaną w celu usunięcia komórek nieadherentnych, a następnie inkubowano kolejne 48 godzin z 10 ml pożywki RPMI uzupełnionej 10% FBS, penicyliną (100 jednostek/ml), streptomycyną (100 mg/ml), L-

9 8 glutaminą (2 mm) i MCSF (czynnik stymulujący wzrost kolonii makrofagów - 50 ng/ml). Niektóre z tych komórek izolowanych z komórkami macierzystymi, kiedy są inkubowane z MCFS, wykazują wydłużoną morfologię, co może przypominać fibroblasty (Zhao Y. et al., 2003). Wszystkie zastosowane produkty, o ile nie wskazano inaczej, uzyskiwano z Sigma- Aldrich. Zawiesinę komórek uzyskiwano poprzez pipetowanie po inkubacji przez 5-8 minut z 2% lidokainą (Sigma) w PBS, jak już opisano (Rabinovitch M. et al., 1976). Po oderwaniu, komórki przemywano dwukrotnie za pomocą PBS i wirowano przez 5 przy 2000 g, dodawano gentamycynę (10 nm) i rozcieńczano do końcowego stężenia wynoszącego 5-7x106, korzystnie 6x106 komórek/ml (z wyjątkiem sytuacji, w których wskazano wyższe stężenie). [0043] We wstępnych eksperymentach część komórek była testowana pod kątem markera CD34, jednego z głównych markerów hematopoetycznych komórek macierzystych, za pomocą technik opisanych już przez Randall et al., Barwienie immunologiczne [0044] Do cytologicznego fenotypowania komórki przemywano w PBS, a następnie utrwalano na szkiełkach w formaldehydzie 4% w PBS przez 20 min. w 20 C. [0045] Dla zidentyfikowania białek wewnątrzkomórkowych, komórki pereabilizowano za pomocą 0,5% Triton X-100 przez 5 min. w 20 C, a następnie inkubowano przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi przeciwciałami, rozcieńczonymi w PBS, zawierającym 1% BSA (dla zblokowania niespecyficznych miejsc antygenowych). Po trzech kolejnych płukaniach, szkiełka inkubowano następnie przez 45 min. z przeciwciałem drugorzędowym, skoniugowanym z najbardziej odpowiednim fluorochromem: FITC lub izotiocyjanianem tetrametylorodaminy B (TRITC) lub Cy5. [0046] Wszystkie przeciwciała drugorzędowe zostały opracowane z wykorzystaniem osła jako gospodarza, przez Jackson ImmunoResearch. Immunocytochemie przeprowadzano w temperaturze wynoszącej 4 C i w wilgotności nasyconej atmosfery. Po trzech przemywaniach szkiełka przytwierdzano z zastosowaniem "gelwatolu-pbs". Następnie, uzyskiwano obrazy fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, stosując jako standard wewnętrzny immunofluorescencję skierowano przeciwko dehydrogenazie 3-fosforanu gliceraldehydu (poliklonalne przeciwciało owcy, wytwarzane przez Cortex Biochem, San Leandro, CA). Jako kontrole negatywne i dla skalibrowania poziomów fluorescencji tła zastosowano inkubację szkiełek z niespecyficznymi przeciwciałami tego samego izotypu jak wykorzystane próbki. [0047] Uzyskane obrazy pokazują komórki obserwowane przez mikroskop z kontrastem fazowym, nałożone na obraz fluorescencyjny lipidów zabarwionych Czerwienią Nilową i na obraz jąder, wybarwionych za pomocą DAPI (4,6-diamidyno-2-fenyloindol). Słupek referencyjny mierzy 40 µm. Intensywność fluorescencji względnej badano poprzez obrazowanie mikroskopowe stosunku ilościowego między komórkami traktowanymi za pomocą MCSF i makrofagami. [0048] Sposób opisany powyżej zastosowano do identyfikowania wszystkich badanych markerów (CD 90, CD 34, CD90/CD34).

10 9 WYNIKI Stosowanie miejscowe [0049] Komórki aplikowano bezpośrednio w przypadku ran zewnętrznych. W przypadku obrażeń ścięgien, więzadeł i złamań, przeciwnie, komórki wszczepiano bezpośrednio do miejsca obrażenia, w końcowym stężeniu, z wyjątkiem sytuacji, gdzie wskazano inaczej, wynoszącym 5-10x10 6 komórek/ml zgodnie z ciężkością obrażenia; w przypadkach, w których komórki nie mogły zostać wprowadzone precyzyjnie do obrażeń, stosowano następujący sposób: Dla obrażeń więzadeł bocznych, iniekcję przeprowadzano między drugim a trzecim paliczkiem, dla obrażeń kości łódkowatej, iniekcję przeprowadzano w kanale nadgarstka, Dla obrażeń stawów krzyżowo-biodrowych w przypadkach Wobblera, iniekcję przeprowadzano między kręgiem piątym a szóstym szyjnym lub między szóstym a siódmym. Obrażenia skórne [0050] Przypadek klaczy z raną między śródstopiem, a kością pęcinową, o średnicy 20 cm z powikłaniami wywołanymi przez clostridia, które doprowadziły do zniszczenia tkanek leżących poniżej, włączając ścięgno prostowników (fig. 1). Pierwszą aplikację przeprowadzono rok po wypadku i po dwóch operacjach chirurgicznych dla usunięcia keloidów i została ona powtórzona jeszcze trzy razy w odstępie 15 dni, z zastosowaniem od 10 do 400x10 6 komórek zawieszonych ponownie w roztworze fizjologicznym w obecności gentamycyny. Po 100 dniach rana była całkowicie zagojona (fig. 2), a po 6 miesiącach w 70% strefy blizny ponownie pojawiły się włosy 70% (fig. 3). Ścięgna [0051] Leczono trzy konie z 80% obrażeniami ścięgna zginacza powierzchniowego, które już po trzech miesiącach leczenia za pomocą około 300x106 komórek nie wykazywały stref hipoechogenicznych w badaniu ultrasonograficznym, a przeciwnie, wykazywały, że grubość ścięgna (która wzrosła po skaleczeniu i procesach zapalnych) była w widoczny sposób zmniejszona o 80%, jak można zobaczyć na wynikach badań ultrasonograficznych na fig [0052] Inne konie z mniejszymi obrażeniami ścięgna (1 cm średnicy) 1 miesiąc po leczeniu nie wykazywały już obrażenia (fig. 8 i 9). Więzadła [0053] Wśród leczonych obrażeń mieliśmy wprowadzenie więzadła zawieszającego pod staw skokowy z wynikającą z tego kulawizną: w mniej niż trzy miesiące po miejscowym zaszczepieniu konie ponownie rozpoczęły pracę, bez kulawizny, a po roku nie było nawrotu choroby. [0054] Inne leczone konie, które miały obrażenia między rozgałęzieniami, a częścią centralną więzadła zawieszającego, z przodu i z tyłu, zostały wyleczone z restitutio ad integrum. Złamania [0055] Wśród leczonych złamań mieliśmy przypadek psa ze złamaną kością udową, przy czym po

11 10 operacji chirurgicznej po 4 miesiącach wciąż nie utworzyła się kostnina. Po miejscowej aplikacji 1x106 komórek, miał miejsce całkowity powrót do zdrowia w ciągu 30 dni. Błony śluzowe [0056] W odniesieniu do gojenia się obrażeń błon śluzowych, leczono różne przewlekłe wrzody. Najbardziej sensacyjnym przypadkiem był ten ujeżdżanego konia z kilkoma wrzodami w pysku, który miał już dwie chirurgiczne operacje plastyczne. Po leczeniu koń przestał krwawić już trzy dni po miejscowej aplikacji 4x10 5 komórek. Po 15 dniach obrażenia zostały całkowicie zagojone. [0057] Podsumowując, zastosowanie miejscowe wyizolowanych komórek, wzbogaconych według naszego sposobu, na ścięgna, więzadła, stawy i złamania, wykazała w ponad 80% przypadków całkowite wyleczenie w ciągu kilku tygodni lub co najwyżej czterech miesięcy. Pozostałe 20% przypadków i tak wykazało znaczące poprawy. Sposoby powszechnie dziś stosowane w nauce weterynaryjnej w tych przypadkach dają pozytywne rezultaty w nie więcej niż 60% przypadków, po leczeniu trwającym około 6-15 miesięcy i poprawy jedynie w 5% przypadków. Podanie dożylne [0058] Komórki podawano dożylnie (1 dawka = 150x10 3 komórek) w następujących zmianach patologicznych: choroba Cushinga: jest to zmiana patologiczna wynikająca z hipertrofii części pośredniej przysadki mózgowej ze zmniejszonym wytwarzaniem dopaminy przez podwzgórze, bardzo podobnie do choroby Parkinsona u ludzi. [0059] Leczono chorego źrebaka, który poza klasycznymi objawami choroby, miał również zmniejszoną odporność immunologiczną z hemolizą. Po trzech leczeniach w odstępie 5 dni za pomocą 150x10 3 komórek na leczenie, nie zaobserwowano poprawy. Po 4 cyklach powtórzonych w odstępie 40 dni, objawy zniknęły całkowicie. Dla czterech innych koni leczonych w taki sam sposób uzyskano takie same wyniki. Drżenie głowy: neurologiczna zmiana patologiczna centralnego układu nerwowego z wtórnymi komplikacjami nerwu trójdzielnego, która prowadzi do ciągłego drżenia głowy i problemów ze światłowstrętem. Leczony koń miał te objawy przez sześć miesięcy. Leczenie objęło cykl 150x10 3 komórek w odstępie jednego tygodnia przez 5 tygodni. Już w trzecim tygodniu objawy zniknęły. Dwa inne konie leczone według takiego samego protokołu, wykazały takie same wyniki. Trzy przypadki Wobblera: jest to wrodzony ucisk neurologiczny części szyjnej [rdzenia kręgowego]. Przypadki leczone poprzez podawanie trzech dawek (dożylno i miejscowo) w odstępie tygodnia, wykazały całkowitą remisję objawów po leczeniu. [0060] Podawanie dożylne komórek macierzystych poddanych ekspansji i oczyszczaniu według opisanego sposobu pokazało, jak te komórki są zdolne "in vivo" do leczenia zmian patologicznych zajmujących tkankę nerwową, dając pierwsze rezultaty już po tygodniu leczenia. Rekonstrukcja naczyń. U konia dotkniętego przez ochwat (uszkodzenie unaczynienia obwodowego w

12 11 stopie, skutkujące niezwykle bolesną kulawizną, uniemożliwiającą poruszanie się) ból niemal zniknął godziny po podaniu dawki zaszczepionej do naczyń palcowych. Takie same wyniki uzyskano dla dwóch innych przypadków koni dotkniętych przez tą samą zmianę patologiczną. [0061] Innymi ogólnymi przypadkami, w których podawano komórki, były: - Przypadek konia ze złamaniem kości łódkowatej, który zaczął ponownie brać udział w wyścigach po jednoczesnym podawaniu komórek macierzystych do naczyń obwodowych, kaletki kości łódkowatej i powierzchni stawowej między ścięgnem zginacza głębokiego i kością łódkowatą; - Przypadek konia cierpiącego z powodu zapalenia okostnej, u którego kulawizna poprawiła się po podaniu dwóch dawek dożylnych; - Przypadek siedemnastoletniego konia, operowanego ze względu na kolkę, a następnie wypuszczonego na trawę, ponieważ nie był już dłużej zdolny do brania udziału w wyścigach, ze względu na utrzymujący się stan ogólnego osłabienia. Po 4 cyklach 3 dawek co 5 dni, koń zaczął ponownie brać udział w wyścigach, uczestnicząc w zawodach i uzyskując wyniki, jakich nigdy nie miał (fig. 10 i 11); - Przypadek dwudziestoletniego konia z podejrzeniem niedokrwienia mózgu, z wynikającą z tego utratą koordynacji w trzech kończynach, który po leczeniu farmakologicznym, opartym na pochodnych kortyzonu, wciąż poruszał się niepewnym i chwiejnym krokiem. Po podaniu dwóch dawek w odstępie tygodnia, zwierzę ponownie rozpoczęło swoją normalną aktywność, już bez wykazywania jakichkolwiek objawów; - Przypadek dwudziestotrzyletniej klaczy, z ciążą w wieku 21 lat, która po zakończeniu okresu laktacji była leczona za pomocą dwóch dawek komórek w sposób dożylny. Po leczeniu klacz ponownie w pełni rozpoczęła swój udział w wyścigach (w wieku 20 lat konia uważa się za zbyt starego do ścigania się); - Przypadek konia ze złamaniem miednicy, który po dwóch dawkach komórek ponownie zaczął brać udział w międzynarodowych wyścigach; - Przypadek piętnastoletniego konia z trudnościami z oddychaniem i bardzo nerwowym charakterem, który po leczeniu za pomocą dwóch dawek ponownie zaczął się ścigać na poziomie międzynarodowym bez najmniejszych trudności z oddychaniem; - Przypadek dwóch koni z ekstremalną kulawizną, stanowiącą wynik naciągania przez ponad dwa lata więzadła bocznego między pierwszy a drugim paliczkiem. Patologię tą uważa się za nieodwracalną w 75% przypadków. Po leczeniu za pomocą trzech dawek przez trzy miesiące oba leczone zwierzęta powróciły do normalnego ścigania się; - Przypadek trzynastoletniego konia operowanego ze względu na kolkę w wieku 7 lat i wykastrowanego w wieku 12 lat. Po drugiej operacji zwierzę miało niezakaźne powikłania bakteryjne, pomimo leczenia za pomocą antybiotyków i środków przeciwzapalnych. Zwierzę cierpiało ponadto z powodu przewlekłego zapalenia żołądka, potwierdzonego przez gastroskopię. Po podaniu 4 dawek w odstępie jednego tygodnia, koniowi ponownie zrobiono gastroskopię, która

13 12 wykazała całkowitą regenerację błony śluzowej żołądka. Taki sam rezultat uzyskano na 10 innych koniach do jazdy; - Przypadek konia ze szmerem skurczowym i licznymi szmerami nietypowymi dla osłuchiwania serca, z pozytywnym wynikiem testu krwi na aktywną postać wirusa opryszczki 1, który spowodował problemy neurologiczne i utratę równowagi; w tym przypadku podawano trzy dawki dożylne trzy razy w odstępie 5 dni, a następnie podano czwartą dawkę na poziomie kręgosłupa. Już po dwóch miesiącach koń ponownie zaczął się poruszać, niemal zupełnie odzyskując równowagę; - Przypadek dziewiętnastoletniego konia niemal całkowicie nie biorącego udziału w zawodach ze względu na ogólne fizyczne wyniszczenie, który po podaniu 200x103 komórek, dwa razy w odstępie tygodnia i z powtórzeniem leczenia, po trzech miesiącach powrócił do bycia jednym z najlepszych w swojej kategorii (w zawodach skoków, skacząc na wysokość wynoszącą 1,35-1,40 m). [0062] Ten sam typ leczenia zaaplikowano bardzo starym psom i dało ono takie same rezultaty. U psów leczono następujące zmiany patologiczne: - dwa przypadki psów ze skrętem żołądka: pierwszym był sześcioletni dog niemiecki poddany operacji chirurgicznej, ale z nawrotem choroby po tygodniu i w związku z tym ponownie poddany kolejnej operacji; po pierwszym podaniu 150x10 3 komórek pies zaczął ponownie jeść, a po dwóch dawkach w odstępie jednego tygodnia, pies powrócił do swojej normalnej aktywności; drugim przypadkiem była dziesięcioletnia samica doga niemieckiego, cierpiąca z powodu choroby zwyrodnieniowej stawów, u której zdiagnozowano cukrzycę, mająca histerektomię-owariektomię; cztery miesiące po operacji miała skręt żołądka z kolejną operacją chirurgiczną, która jednak nie przyniosła wielkiej poprawy. Na tym etapie podano dwie dawki w odstępie jednego tygodnia i cztery inne cykle w następnych czterech miesiącach. Dzisiaj, osiem miesięcy po ostatnim cyklu, pies ma nie tylko prawidłowy poziom cukru we krwi, ale również zdolność do chodzenia została poprawiona o 80%; - Przypadek kundla, 13-letniego samca z paraliżem kończyn tylnych i nietrzymaniem moczu/kału; do tego czasu był on leczony jedynie za pomocą kortyzonu, bez zauważalnych rezultatów. Piętnaście dni po zawieszeniu kortyzonu pobrano komórki, a psa poddano cyklowi dwóch dawek w odstępie tygodnia. Sześć dni po ostatnim leczeniu pies nie tylko ponownie zaczął używać swoich łap, ale również prawidłowo oddawał mocz i wypróżniał się. [0063] Wyniki uzyskane za pomocą sposobu według wynalazku czynią tę procedurę wyjątkowo uniwersalną ze względu na fakt, że w tym momencie nie istnieje żadna technika "in vivo" ekspansji komórek pluripotencjalnych. Ponadto, brak jakiejkolwiek postaci odrzucenia lub infekcji po podaniu w historii wszystkich przypadków przedstawionych powyżej, czyni tę technikę odpowiednią do procedur przeszczepów autologicznych.

14 Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób ekspansji dorosłych komórek macierzystych z krwi, szczególnie, ale nie tylko, z krwi obwodowej, obejmujący następujące etapy: a) pierwszy etap ekspansji komórek macierzystych z krwi, natychmiast po ich pobraniu od pacjenta, poprzez traktowanie in vitro za pomocą MCSF w stężeniu zawartym między 8-15 nm oraz b) drugi etap oczyszczania komórek macierzystych poddanych ekspansji. c) ekspansję komórek macierzystych z krwi oczyszczonych w etapie b) poprzez traktowanie in vitro za pomocą MCSF w stężeniu zawartym między nm przez godzin. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czas trwania wspomnianego etapu in vitro a) z MCSF wynosi między 24 a 96 godzin. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czas trwania wspomnianego etapu in vitro a) z MCSF wynosi między 48 a 72 godziny. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane traktowanie z etapu in vitro a) zaczyna się nie później niż 10 minut po pobraniu próbki, korzystnie nie później niż 5 minut. 5. Sposób według dowolnego z powyższych zastrz., znamienny tym, że wspomniane stężenie MCSF w etapie a) wynosi korzystnie 10 nm. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomniane stężenie MCSF w etapie c) wynosi korzystnie 50 nm, korzystniej 45 nm. 7. Sposób według dowolnego z powyższych zastrz., znamienny tym, że traktowanie in- vitro za pomocą MCSF w etapie a) i/lub etapie c) trwa godzin, korzystnie godzin. 8. Sposób według dowolnego z powyższych zastrz., znamienny tym, że etap oczyszczania b) zachodzi poprzez frakcjonowanie w gradiencie odczynnika Ficoll. 9. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca dorosłe komórki macierzyste, uzyskane zgodnie ze sposobem zdefiniowanym w dowolnym z zastrz. od 1 do 8, w stężeniu zawartym między x10 3 komórek/ml, korzystnie x10 3 komórek/ml, jako substancję czynną, wraz z farmakologicznie dopuszczalnymi adjuwantami i/lub rozczynnikami, przy czym wspomnianą kompozycję formułuje się do podawania dożylnego, do stosowania w leczeniu obrażeń wybranych z grupy składającej się z obrażeń skórnych, obrażeń ścięgien, więzadeł, kości, błon śluzowych u

15 14 ssaków lub złamań, lub zmian patologicznych neurologicznych lub neurodegeneracyjnych, wybranych z grupy składającej się z choroby Cushinga, drżenia głowy, zespołu Wobblera, trudności z oddychaniem, porażenia kończyn u ssaków, ostrych lub przewlekłych zapalnych zmian patologicznych, wybieranych spośród ochwatu, zapalenia okostnej, zapalenia żołądka, choroby zwyrodnieniowej stawów, stanów zapalnych powodowanych przez czynniki wirusowe, bakteryjne, pasożytnicze, grzybicze u ssaków, zespołu powiększenia-skręcenia żołądka u ssaków. 10. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca dorosłe komórki macierzyste, uzyskane zgodnie ze sposobem zdefiniowanym w dowolnym z zastrz. od 1 do 8, w stężeniu zawartym między 4-40x106 komórek/ml, korzystnie 7x106 komórek/ml, jako substancję czynną, wraz z farmakologicznie dopuszczalnymi adjuwantami i/lub rozczynnikami, przy czym wspomnianą kompozycję formułuje się do podawania miejscowego, do stosowania w leczeniu obrażeń wybranych z grupy składającej się z obrażeń skórnych, obrażeń ścięgien, więzadeł, kości, błon śluzowych u ssaków lub złamań, lub zmian patologicznych neurologicznych lub neurodegeneracyjnych, wybranych z grupy składającej się z choroby Cushinga, drżenia głowy, zespołu Wobblera, trudności z oddychaniem, porażenia kończyn u ssaków, ostrych lub przewlekłych zapalnych zmian patologicznych, wybieranych spośród ochwatu, zapalenia okostnej, zapalenia żołądka, choroby zwyrodnieniowej stawów, stanów zapalnych powodowanych przez czynniki wirusowe, bakteryjne, pasożytnicze, grzybicze u ssaków, zespołu powiększeniaskręcenia żołądka u ssaków. 11. Kompozycja do stosowania według zastrz. 10, znamienna tym, że zawiera również antybiotyk jako substancję czynną w stężeniu zawartym między 5-15 nm, korzystnie 10 nm. 12. Kompozycja do stosowania według zastrz. 11, znamienna tym, że antybiotykiem jest gentamycyna. 13. Kompozycja do stosowania według zastrz. 9, znamienna tym, że zawiera dorosłe komórki macierzyste uzyskane w stężeniu równym 150x103 komórek/ml i jest podawana raz w tygodniu, dożylnie. 14. Kompozycja do stosowania według dowolnego z zastrz. od 9 do 13, znamienna tym, że wspomniane ssaki wybiera się spośród człowieka, koni, kotów lub psów.

16 15

17 16

18 17

19 18

20 19

21 20

22 21

23 22

24 23

25 24

26 25

27 26

28 27 ODNOŚNIKI CYTOWANE W OPISIE Poniższa lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma na celu wyłącznie pomoc dla czytającego. Nie stanowi ona części dokumentu patentu europejskiego. Pomimo że dołożono największych starań przy jej tworzeniu, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń i EUP nie ponosi żadnej odpowiedzialności w tym względzie. Dokumenty patentowe cytowane w opisie WO A [0007]