(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12Q 1/56 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2013/18 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Zestaw do pobierania krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji komórek macierzystych (30) Pierwszeństwo: IT UD (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2011/04 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/09 (73) Uprawniony z patentu: THANKSTEM S.R.L., Udine, IT (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 MARCO POLETTINI, Sutri, IT ALESSANDRA GAMBACURTA, Roma, IT (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Rafał Witek WTS RZECZNICY PATENTOWI WITEK, ŚNIEŻKO I PARTNERZY ul. R. Weigla Wrocław Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 Opis DZIEDZINA WYNALAZKU [0001] W niniejszym wynalazku przedstawiono zestaw do pobierania krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji dojrzałych komórek macierzystych. TŁO WYNALAZKU [0002] W ostatnich latach zastosowanie komórek macierzystych cieszyło się szeroką akceptacją związaną z sukcesami odniesionymi w leczeniu chorób, które do tej pory uznawano za nieuleczalne. [0003] Jednakże, znane metody otrzymywania komórek macierzystych są długotrwałe, pracochłonne i kosztowne. [0004] Pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) są źródłem odpowiednim nie tylko dla celów badawczych, ale również dla produkcji leków i do przeszczepów (Wagers A. J. et al., 2002; Griffith L. G. et al., 2002). [0005] Istnieją komórki macierzyste embrionalne i dojrzałe: pierwsze otrzymywane są z 8-dniowych blastocyst, podczas gdy dojrzałe komórki macierzyste mogą być otrzymywane głównie ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub mięśniowej, krwi obwodowej i sznura pępowinowego. [0006] Definicja komórki macierzystej jest stale rozwijana a w chwili obecnej nie istnieje ogólnie przyjęta lub standardowa metoda ich izolacji lub identyfikacji. Dla wszystkich tych komórek, embrionalnych (ES) i dojrzałych, zarówno hematopoetycznych (HSC) jak i mezenchymalnych, (MSC) (Kuwana M. et al., 2003), zidentyfikowano różne markery genetyczne, spośród których pewne są wspólne dla różnych typów komórek (Condomines M. et al., 2006; Kang W. J. et al., 2006; Zhao Y. et al., 2003; Rabinovitch M. et al., 1976). [0007] Obecnie, badania skoncentrowane są na zastosowaniu komórek macierzystych izolowanych z tkanek embrionalnych, płodowych oraz sznura pępowinowego, co jednakże wiąże się z problemami prawnymi i etycznymi. [0008] Ponadto, obecnie zastosowanie tych komórek charakteryzuje się różnymi przeciwwskazaniami takimi jak: ryzyko infekcji, ryzyko odrzucenia przeszczepu, jeśli są przeszczepiane, a także, u niektórych ssaków, takich jak konie, rozwój teratomy. [0009] W celu przezwyciężenia tych problemów, znane jest zastosowanie podczas terapii "in vivo" autologicznych komórek macierzystych, korzystnie izolowanych ze szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej lub krwi obwodowej. Począwszy od dojrzałych komórek macierzystych, następuje etap różnicowania "in vitro" (lub "ex vivo") komórek macierzystych do linii komórkowej, przebiegający za pomocą specyficznych czynników indukujących różnicowanie, a następnie etap przeszczepienia otrzymanej zróżnicowanej linii komórkowej "in vivo". Wadą tych metod jest zjawisko odrzucenia, gdyż zróżnicowane komórki ponownie wprowadzone do organizmu, będącego przedmiotem

3 2 zainteresowania, nie są rozpoznawane jako komórki własne, ponieważ podczas etapu indukowanego różnicowania in vitro, tracą własne antygeny. [0010] U człowieka pobranie komórek macierzystych z krwi obwodowej wiąże się z koniecznością ich oczyszczania podczas procesu zwanego aferezą lub leukoaferezą. Komórki są ekstrahowane z krwi, zbierane i wprowadzane do pacjenta natychmiast po chemioterapii lub radioterapii. [0011] Podczas aferezy, która trwa od 6 do 8 godzin, krew pobierana jest z żyły ramiennej lub żyły szyjnej lub piersiowej i przepuszczana przez urządzenie usuwające komórki macierzyste. Krew, tak oczyszczona, zawracana jest do pacjenta, podczas gdy zebrane komórki zachowywane w wyniku zamrożenia w ciekłym azocie (Condomines M. et al., 2006; Kang W.J. et al., 2006). Technika ta, poza tym, że jest bolesna, jest również dla pacjenta wysoce stresująca. Ponadto, technika nie zapewnia pełnego odróżnienia i/lub oczyszczenia cyrkulujących komórek macierzystych. Głównymi znanymi technikami oczyszczania są: zastosowanie czynników wzrostu lub czynników płytkopochodnych (TGF-B, VEGF), jednakże koszt ich ekstrakcji nie jest przystępny (Hou M. et al, 2006); izolacja komórek macierzystych pobranych ze szpiku kostnego, która pozwala na oczyszczenie, a zatem użycie podczas terapii około 15% komórek zawartych w ekstrahowanym materiale; izolacja komórek macierzystych z tkanki tłuszczowej, która wymaga uprzedniego chirurgicznego usunięcia istotnych ilości tkanki od dawcy i nie pozwala na dożylne podanie; IGF-1 (insulinopodobny czynnik wzrostu 1) znany jako Tendotrophin (Fiedler J. et al., 2006); UBM (macierz pęcherza moczowego): jest to materiał zwierzęcy zawierający cytokiny (ale nie komórki jądrzaste), który indukuje zabliźnianie ran, ale nie regenerację obszaru objętego zmianą (Zhang YS et al., 2005). [0012] Inna znana metoda opisana została przez Zhao Y. et al. w artykule "A human peripheral blood monocyte-derived subset acts as pluripotent stem cells" oraz w WO-A-2004/ Jest to metoda przygotowania komórek macierzystych wywodzących się z monocytów, która obejmuje etapy izolacji monocytów z krwi obwodowej, poddanie ich kontaktowi z czynnikiem mitogenicznym, a następnie prowadzenie hodowli monocytów z krwi obwodowej w warunkach odpowiednich dla propagacji komórek. [0013] Metoda ta, która na wstępie wymaga etapu izolacji monocytów, a następnie etapu namnażania z wykorzystaniem techniki hodowli komórkowej, jest bardzo długa, uzyskanie dużej liczby komórek macierzystych trwa około dni i nie pozwala na uzyskanie pluripotencjalnych komórek macierzystych, które są niewyspecjalizowane, odpowiednie dla wszczepienia pacjentowi bezpośrednio oraz po krótkim czasie. [0014] Ponownie, w zakresie przygotowania komórek macierzystych z monocytów, znane są dokumenty WO-A-2005/046570, WO-A- 2007/ oraz WO-A-03/ Jednakże, ponieważ w celu izolacji frakcji wyłącznie komórkowej, którą stanowią monocyty, wymagają prowadzenia wstępnego oczyszczania krwi i następnie namnożenia w celu uzyskania pożądanych komórek

4 3 macierzystych, metody opisane w tych dokumentach są, w celu uzyskania akceptowalnej ilości komórek macierzystych, długotrwałe, ponownie rzędu dni. [0015] W świetle powyższego, istnieje oczywiste zapotrzebowanie na udoskonalenie metody namnażania lub podziału lub oczyszczania dojrzałych komórek macierzystych z łatwo dostępnych źródeł, szczególnie z krwi, korzystnie krwi obwodowej, która pozwalałaby na uzyskanie komórek macierzystych odpowiednich dla leczenia farmakologicznego. [0016] Istnieje również oczywiste zapotrzebowanie na rozpoczęcie produkcji komórek macierzystych z krwi, korzystnie krwi obwodowej, w najkrótszym możliwym czasie, tak by możliwa była szybka interwencja u pacjenta. [0017] Celem niniejszego wynalazku jest zatem uzyskanie zestawu do gromadzenia pobranej krwi, korzystnie krwi obwodowej do produkcji pluripotencjalnych komórek macierzystych, umożliwiającego szybkie rozpoczęcie produkcji komórek pluripotencjalnych. [0018] Wnioskodawca opracował, zbadał i zrealizował niniejszy wynalazek w celu usunięcia wad w stanie techniki oraz w celu uzyskania tych i innych celów i korzyści. STRESZCZENIE WYNALAZKU [0019] Niniejszy wynalazek określono i scharakteryzowano w niezależnym zastrzeżeniu patentowym, natomiast w zastrzeżeniach zależnych opisano cechy charakterystyczne wynalazku lub wariantów głównej idei wynalazczej. [0020] Metoda hodowli i oczyszczania komórek macierzystych in vitro z krwi, korzystnie krwi obwodowej, została opracowana przez niniejszych twórców i opisana w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym. Ujawnienie w WO 2008/ (stanowiący stan techniki zgodnie z Artykułem 54(3) EPC), na rzecz niniejszego Zgłaszającego, który włączony całkowicie tytułem referencji, pozwala na uzyskanie dojrzałych pluripotencjalnych komórek macierzystych i obejmuje pierwszy etap złożony z dwóch podetapów: a) pierwszy podetap hodowli komórek macierzystych z krwi obwodowej, po pobraniu krwi, z wykorzystaniem techniki in vitro, opartej o traktowanie za pomocą MCSF (Czynnik Stymulujący Kolonie Makrofagów) w stężeniu zawartym pomiędzy 8-15 nm, korzystnie 10 nm; b) drugi podetap oczyszczania, korzystnie prowadzonego na drodze frakcjonowania w gradiencie fikolu. [0021] Próbka krwi umieszczana jest w probówce zawierającej heparynę oraz MCSF. [0022] Pierwszy podetap wzrostu może mieć zmienny czas trwania, zgodnie z warunkami w jakich prowadzone jest traktowanie in vitro; twórcy ustalili doświadczalnie, że czas trwania traktowania in vitro za pomocą MCSF zawarty pomiędzy 24 a 96 godzin, korzystnie pomiędzy 48 a 72 godziny, prowadzi do stabilizacji wzrostu z możliwą identyfikacją markerów komórek macierzystych CD 90, CD 90/34, CD34 orazcd117. Warunki takie uznawane są za optymalne. [0023] Oczyszczanie podetapu drugiego zasadniczo zamierzone jest w celu zniszczenia erytrocytów.

5 4 [0024] Drugi etap, w którym wykorzystuje się półprodukty otrzymane podczas etapu b) dotyczy; c) hodowli komórek macierzystych krwi obwodowej oczyszczonych podczas etapu b) za pomocą traktowania in vitro MCSF, w stężeniu zawartym pomiędzy nm, korzystnie 50 nm, korzystniej 45 nm. [0025] Dzięki takim stężeniom MCSF, komórki utrzymują fenotyp dojrzałych pluripotencjalnych komórek macierzystych. [0026] Czas trwania drugiego etapu może mieścić się w granicach pomiędzy 24 a 96 godzin, korzystnie 48 a 72 godziny. [0027] Zaobserwowano, że w przeciwnym przypadku, gdy MCSF stosowany jest w stężeniu wyższym niż 55 nm (na przykład 70 nm), komórki już po 24 godzinach nie utrzymują fenotypu pluripotencjalnych komórek macierzystych. [0028] W szczególności, etap a) podziału i wcześniejszego wzrostu w zawiesinie z MCSF, po pobraniu krwi, pozwala na wzrost zawartości procentowej komórek macierzystych. Kolejny etap b) pozwala na uzyskanie dojrzałych pluripotencjalnych komórek macierzystych, które po podaniu pacjentowi ulegają różnicowaniu bezpośrednio in vivo, nie powodując zjawiska odrzucenia lub infekcji. [0029] Efektywność tej produkcji potwierdzana jest na podstawie obecności markerów komórek macierzystych CD90, CD90/34, CD34 oraz CD 117 oraz na podstawie faktu, że komórki macierzyste nie tracą antygenów własnych po podziale lub namnażaniu. Takie komórki macierzyste, po podaniu pacjentowi, nie powodują efektów ubocznych, takich jak zjawiska odrzucenia, infekcji, rozwoju teratomy i są zdolne do różnicowania "in vivo" oraz zachowania typowego dla pluripotencjalnych komórek macierzystych. [0030] Twórcy zauważyli, zatem, że komórki hodowane na drodze podziału lub namnażania, gdy podane za pomocą iniekcji miejscowej lub dożylnej, nabywają "in vivo" (a nie "in vitro", jak w przypadku metod znanych w dziedzinie wykorzystujących odpowiednie czynniki wzrostu i/lub stymulatory chemiczne (Gulati R. et al., 2003; Katz R. L. et al., 2002; Okazaki T. et al., 2005)) wszystkie cechy morfologiczne i chemiczne typowe dla komórek makrofagowych, limfocytarnych, epitelialnych, endotelialnych, neuronowych i hepatocytów, zgodnie z potrzebami i stanami chorobowymi traktowanych żywych organizmów. Metoda jest mniej inwazyjna niż pozostałe stosowane dotychczas metody pobierania komórek macierzystych, bezbolesna (w przeciwieństwie do aferezy) i ekonomiczna. [0031] Wreszcie, łatwa możliwość otrzymania takich komórek i możliwość przechowywania ich przez długi okres czasu, na przykład na drodze zamrożenia w ciekłym azocie, czyni komórki, uzyskane za pomocą metody według wynalazku, odpowiednimi dla przeszczepów autologicznych i dla leczenia wielu schorzeń (zmian różnego typu, chorób metabolicznych, ostrych i przewlekłych chorób neurologicznych i zapalnych). [0032] Zgodnie z jedną cechą niniejszego wynalazku zestaw do pobierania krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji pluripotencjalnych komórek macierzystych, według metody opisanej

6 5 powyżej, obejmuje pierwszy pojemnik, który może zawierać pobraną krew, taki jak probówka, zawierająca antykoagulant i substancję MCSF. Zazwyczaj pierwszy pojemnik wykonany jest ze szkła. [0033] Dzięki niniejszemu zestawowi możliwe jest pobranie krwi, korzystnie krwi obwodowej, w celu szybkiego rozpoczęcia wzrostu i produkcji komórek macierzystych, za pomocą metody opisanej powyżej, a zatem w celu przyspieszenia produkcji. [0034] Główną zaletą niniejszego wynalazku jest zatem fakt, że poprzez operowanie bezpośrednio pełną krwią, uzyskuje on wystarczającą ilość pluripotencjalnych komórek macierzystych w bardzo ograniczonym czasie, nawet w ciągu jedynie 48 godzin, w porównaniu do metod zgodnych ze stanem wiedzy w dziedzinie. Zatem, zestaw do pobierania krwi, według niniejszego wynalazku, zaproponowano jako szybkie i efektywne rozwiązanie dla uzyskiwania pluripotencjalnych komórek macierzystych bezpośrednio z krwi, korzystnie krwi obwodowej. [0035] Zazwyczaj stężenie MCSF w probówce zestawu, według niniejszego wynalazku, mieści się w granicach od około 2 do 20 nm, korzystnie od około 8 do 10 nm. [0036] Zazwyczaj jako antykoagulantu stosuje się heparynę lub EDTA. [0037] Obecność antykoagulantu jest istotna w celu zapobieżenia rozpoczęcia koagulacji krwi, podczas gdy MCSF odpowiada za procedurę wzrostu i namnożenia komórek macierzystych. [0038] Zestaw obejmuje jeden lub więcej pojemników, poza pierwszym pojemnikiem takim jak probówka. Te ostatnie korzystnie wytworzone są tak, by zawierać przynajmniej jedną ścianę wewnętrzną z materiału, na przykład materiału plastikowego takiego jak polipropylen (PP), traktowanego promieniowaniem podczerwonym lub gamma, co zapobiega adhezji komórek macierzystych do ściany, a więc ich agregacji, która uznawana jest zjawisko niekorzystne. [0039] Zazwyczaj, w przypadku tego ostatniego, jest to drugi pojemnik, który ma zawierać komórki macierzyste, otrzymane dla zastosowania dożylnego i trzeci pojemnik, o innej wielkości, dla zastosowania miejscowego. [0040] Komórki macierzyste, które są produkowane w rzeczonych pojemnikach, mogą być wykorzystane natychmiast lub mogą być przechowywane w ciekłym azocie, tak że mogą być kolejno użyte, w przypadku gdy nastąpi taka konieczność. [0041] Według innego wariantu rzeczony pojemnik, zarówno wykorzystywany podczas pobierania krwi, zawierający antykoagulant oraz MCSF, jak również te wykorzystywane podczas przechowywania, mogą być identyfikowane poprzez numer serii wspólny, sekwencyjny lub generowany zgodnie z wcześniej określonym kryterium, w celu ułatwienia identyfikacji w laboratorium, w którym komórki macierzyste są produkowane, w chwili dostawy. [0042] W celu jednoznacznej identyfikacji możliwym jest zastosowanie kodów kreskowych i/lub nalepek RFID do odczytu, odczytu/zapisu, umieszczonych na pojemnikach wraz z odpowiednimi optycznymi lub elektromagnetycznymi czytnikami. [0043] Pierwszy podetap wzrostu według metody opisanej powyżej jest korzystnie rozpoczynany natychmiast po pobraniu próbki krwi tak, że krew nie koaguluje w międzyczasie. [0044] Poprzez słowa "natychmiast po" rozumiemy najkrótszy możliwy czas pomiędzy pobraniem krwi a jej koagulacją, umożliwienie uniknięcia koagulacji krwi i rozpoczęcia namnażania komórek macierzystych w najkrótszym możliwym czasie po pobraniu krwi.

7 6 [0045] Innymi słowy "natychmiast po" odnosi się do faktu, że wzrost komórek macierzystych rozpoczyna się natychmiast po pobraniu krwi od pacjenta, biorąc pod uwagę, że dla niniejszego wynalazku istotne jest, że rzeczony proces namnażania rozpoczynany jest zanim krew skoaguluje. [0046] W rzeczywistości, krew dopiero co pobrana od pacjenta umieszczana jest w probówce z antykoagulantem oraz MCSF. Antykoagulant hamuje rozpoczęcie koagulacji, podczas gdy jednoczesna obecność MCSF pozwala na szybkie rozpoczęcie procesu namnażania i gwarantuje skrócenie czasów dla rozpoczęcia leczenia pacjenta. [0047] Definicja ta obejmuje również przypadek, gdy próbka krwi, korzystnie krwi obwodowej, pobierana jest od pacjenta, antykoagulant jest dodawany w celu hamowania agregacji krwi, która poddawana jest procesowi przechowywania, który nie wpływa na jej zdolność do produkcji komórek macierzystych. [0048] Kiedy jest to konieczne, krew pobierana jest z miejsca przechowywania i poddawana jest procesowi namnażania komórek macierzystych, jak opisano powyżej, to znaczy dodaniu MCSF, w wyniku czego bardzo szybko uzyskuje się konieczną ilość komórek macierzystych. [0049] Procedura pobrania próbki i przechowywania krwi, korzystnie krwi obwodowej, wchodzi zatem w zakres niniejszego wynalazku, rzeczona procedura umożliwia uzyskanie komórek macierzystych w odpowiednich bankach krwi i ich późniejsze wykorzystanie, gdy zachodzi taka konieczność, do produkcji pluripotencjalnych komórek macierzystych w wyniku dodania MCSF. [0050] Zazwyczaj po pobraniu krwi z miejsca przechowywania, umieszczana jest ona w probówce, która już zawiera MCSF w stężeniu od 2 do 20 nm, korzystnie od 8 do 10 nm. [0051] Umożliwia to pominięcie skomplikowanej i kosztownej procedury przechowywania komórek macierzystych, jaką stanowi, na przykład, zastosowanie ciekłego azotu, jak wspomniano powyżej, a zamiast tego zastosowanie wyłącznie konwencjonalnych technik przechowywania krwi. SZCZEGÓŁOWY OPIS KORZYSTNEJ POSTACI REALIZACJI WYNALAZKU [0052] W odniesieniu do załączonej fig. 1, zestaw 10 do pobierania krwi obwodowej, według niniejszego wynalazku, do produkcji pluripotencjalnych komórek macierzystych obejmuje pierwszą probówkę 12, wykonaną ze szkła, zawierającą substancję MCSF 14 i w tym przypadku heparynę 16. [0053] Stężenie MCSF w probówce 11 mieści się w zakresie od 8 do 10 nm. [0054] Zestaw obejmuje dodatkowe dwie probówki 18 i 20, wykonane z materiału plastikowego, takiego jak polipropylen (PP), traktowanego promieniowaniem podczerwonym lub gamma. [0055] Druga probówka 18 jest przeznaczona do przechowywania komórek otrzymanych dla dożylnego zastosowania a trzecia probówka 20 dla zastosowania miejscowego. [0056] Istotne jest, że probówki 12, 18 oraz 20 zapewniają jałowość ich zawartości. [0057] Wszystkie probówki 12, 18 oraz 20 są dostarczane wraz z odpowiednimi korkami 22, 24, umożliwiającymi ich zamknięcie. [0058] Korki 22, 24 mogą być wciskane, zakręcane lub inne. [0059] Korek 22 pojemnika 12 może być na przykład typu wciskanego. [0060] Korek 24 każdej spośród probówek 18 oraz 20 może być na przykład typu zakręcanego.

8 7 [0061] Rozmiary drugiej probówki 18 wynoszą: wysokość 115 mm, średnica 17 mm, grubość 0.3 mm, pojemność 12 ml, podczas gdy rozmiary trzeciej probówki 20 wynoszą: wysokość 110 mm, średnica 30 mm, grubość 0.3 mm, pojemność 40 ml. [0062] Po namnożeniu techniką wykorzystującą MCSF, według niniejszego wynalazku, komórki izolowane z krwi obwodowej działają "in vivo" jako pluripotencjalne komórki macierzyste (PCS) i zdolne są pokonać w ciągu kilku miesięcy nieuleczalne zmiany lub stany chorobowe, lub zmiany uleczalne jedynie w długim czasie, gdy stosuje się klasyczne metody i/lub leki. MATERIAŁY I METODY Pobór próbek krwi: [0063] Każda próbka krwi obwodowej o objętości około ml pobrana została z kończyny dolnej koni i psów i natychmiast przeniesiona do probówki, zawierającej odpowiednią ilość heparyny i MCSF (10 nm). [0064] W dowolnym przypadku stosowany może być inny antykoagulant, taki jak EDTA. [0065] Na tym etapie prowadzony jest pierwszy podetap traktowania in vitro, podczas którego, dzięki MCSF, uzyskuje się podział i wstępny wzrost komórek macierzystych. Oczyszczanie: [0066] W celu wywołania lizy erytrocytów, próbki krwi rozcieńczono 1:5 w PBS (Buforowany Fizjologiczny Roztwór Soli) zawierającym NH 4 Cl (200 mm), odwirowano przy 10,000g, płukano dwukrotnie za pomocą PBS i ponownie odwirowano przy 200g. Otrzymane jądrzaste komórki inkubowano przez 7-12 godzin w 37 C, korzystnie prz ez godzin i oczyszczono na drodze frakcjonowania w gradiencie Fikolu, następnie izolowano i płukano trzykrotnie w podłożu RPMI 1640 (Life Technologies, Grand Island, NY). [0067] Po oczyszczeniu komórki inkubowane są przez kolejne godziny, w obecności 50 ng/ml 45 nm MCSF, w celu uzyskania komórek wśród których około 95% stanowią komórki o fenotypie CD90 (jak określono za pomocą analizy cytofluorometrycznej z wykorzystaniem fotometru przepływowego FACScan - Becton Dickinson) a następnie namnażane w celu uzyskania liczby komórek koniecznej dla traktowania miejscowego lub zwirowane przy 10,000g i zawieszane w PBS w gęstości około komórek/ml dla traktowania dożylnego. Barwienie immunologiczne: [0068] W celu fenotypowania cytologicznego, komórki płukano w PBS, a następnie utrwalano na szkiełku w 4% roztworze formaldehydu w PBS, przez 20 minut w 20 C. [0069] W celu identyfikacji białek wewnątrzkomórkowych, komórki permeabilizowano za pomocą 0.5% Tritonu X-100 przez 5 minut w 20 C, a następnie inkubowano przez 1 godzinę z pierwszorzędowymi

9 8 przeciwciałami, rozcieńczonymi w PBS zawierającym 1% BSA (w celu zablokowania niespecyficznych miejsc antygenowych). Po trzech kolejnych płukaniach, szkiełka inkubowano przez 45 minut z drugorzędowym przeciwciałem skoniugowanym z najodpowiedniejszym fluorochromem: FITC lub izotiocyjanianem tetrametylorodaminy B (TRITC) lub Cy5. [0070] Wszystkie przeciwciała drugorzędowe opracowane zostały z wykorzystaniem osła jako organizmu gospodarza przez Jackson ImmunoResearch. [0071] Reakcje immunocytochemiczne prowadzone były w temperaturze 4 C, w atmosferze nasyconej wilgocią. Po trzech płukaniach, szkiełka zamknięto za pomocą "gelvatolu_pbs". [0072] Obrazy fluorescencyjne wykonano za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z zastosowaniem wewnętrznego standardu bezpośredniej immunofluorescencji przeciwko dehydrogenazie aldehydu 3- fosfoglicerynowego (owcze przeciwciało poliklonalne wyprodukowane przez Cortex Biochem, San Leandro, CA). [0073] Jako negatywnych kontroli, stosowanych w celu dostosowania poziomu tła fluorescencji, wykorzystano szkiełka inkubowane z niespecyficznymi przeciwciałami o tym samym izotypie jak próbki będące przedmiotem zainteresowania. [0074] Metoda właśnie opisana stosowana była w celu identyfikacji wszystkich markerów (CD90, CD90/34, CD34 oraz CD 117) oraz markerów przedstawionych w poniższej tabeli. Tabela: charakterystyka komórek traktowanych MCSF (PSC) oraz makrofagów izolowanych z krwi obwodowej Intensywność względnej fluorescencji Antygen powierzchniowy PSC Makrofagi MAC-1 76±18 84±15 CD14 126±29 157±19 CD34 77±16 15±5 CD45 143±26 165±38 Produkcja cytokin IL-1 82±27 83±12 IL-6 43±22 67±14 IL-10 7±8 58±7 TNF- 25±16 67±16 Wskaźniki funkcjonalności Fagocytoza 187±23 15±26 Stymulacja Limfocyty, Abs540 0,72±0,07 0,17±0,02 Cytotoksyczność % 9±4 72±6 [0075] Oczywistym jest, że w zestawie do gromadzenia krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji komórek macierzystych jak dotychczas opisano, mogą być poczynione modyfikacje i/lub dodane elementy, co nie będzie skutkować wystąpieniem poza zakres i dziedzinę niniejszego wynalazku.

10 9 [0076] Oczywistym jest również, że pomimo iż niniejszy wynalazek opisano w odniesieniu do przykładów, specjalista w dziedzinie jest z pewnością w stanie uzyskać wiele równoważnych postaci zestawu do gromadzenia pobranej krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji komórek macierzystych, wykazujących właściwości przedstawione w zastrzeżeniach patentowych, a zatem wszystkich wchodzących w zakres ochrony tutaj zdefiniowanej.

11 10 Zastrzeżenia patentowe 1. Zestaw do gromadzenia krwi, korzystnie krwi obwodowej, do produkcji pluripotencjalnych komórek macierzystych, obejmujący przynajmniej pierwszy pojemnik (12), który może zawierać pobraną krew, który zawiera antykoagulant i substancję MCSF (Czynnik Stymulujący Kolonie Makrofagów) oraz przynajmniej drugi pojemnik (18, 20) z przynajmniej wewnętrzną ścianą materiału zapobiegającą adhezji komórek macierzystych. 2. Zestaw według zastrz. 1, znamienny tym, że rzeczony materiał jest materiałem plastikowym, takim jak polipropylen (PP), traktowanym promieniowaniem podczerwonym i/lub gamma. 3. Zestaw według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje element zamykający (24) dla każdego pojemnika (18,20). 4. Zestaw według zastrz. 1, 2 albo 3, znamienny tym, że stężenie MCSF w pierwszym pojemniku (12) zawiera się pomiędzy około 2 nm a około 20 nm. 5. Zestaw według zastrz. 4, znamienny tym, że stężenie MCSF w pierwszym pojemniku (12) zawiera się pomiędzy około 8 nm a około 10 nm. 6. Zestaw według dowolnego spośród powyższych zastrz., znamienny tym, że antykoagulantem jest heparyna lub EDTA. 7. Zestaw według dowolnego spośród powyższych zastrz., znamienny tym, że obejmuje element zamykający (22) dla pierwszego pojemnika (12).

12 11

13 LITERATURA CYTOWANA W OPISIE 12 Lista cytowanych odniesień literaturowych została przedstawiona wyłącznie dla informacji czytelnika. Nie stanowi ona części dokumentu Patentu Europejskiego. Pomimo, że podczas zestawiania listy odniesień literaturowych dołożono wszelkich starań, nie można wykluczyć błędów i pominięć, a EPO nie ponosi w tym względzie żadnej odpowiedzialności. Dokumenty patentowe cytowane w opisie: WO A [0012] WO A [0014] WO A [0014] WO A [0014] WO A [0020]