Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego

Transkrypt

1 Perinatologia, Neonatologia i Ginekologia, tom 2, zeszyt 2, , 2009 Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego BARBARA KRÓLAK-OLEJNIK Streszczenie Zakażenie wrodzone noworodków, mimo znacznego postępu i rozwoju metod diagnostycznych, nadal stanowi istotny problem współczesnej perinatologii i neonatologii. Celem pracy jest określenie przydatności klinicznej wybranych chemokin $, uznanych jako mediatory zakażenia w badaniach in vitro i u osób dorosłych, w diagnostyce wrodzonych zakażeń noworodków. Badaniami objęto 211 dzieci urodzonych przedwcześnie i o czasie, zarówno chorych, jak i zdrowych. Chemokiny $ MIP-1" (CCL3), MIP-1$ (CCL4), RANTES (CCL5) oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA, we krwi pępowinowej noworodków. Stężenie MIP-1" (CCL3) było wyższe we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą, w przeciwieństwie do stężenia RANTES (CCL5), które wykazywało najniższe wartości w grupach zarówno noworodków chorych, jak i urodzonych przedwcześnie. Nie wykazano natomiast różnic znamiennych statystycznie w zakresie MIP-1$ (CCL4), w badanych grupach. Przeprowadzone badania pozwoliły potwierdzić obecność badanych chemokin we krwi pępowinowej badanych grup noworodków. Uzyskane wyniki nie pozwalają jednoznacznie określić ich przydatności klicznej, ale stanowią wstępny element dalszych badań układu immunologicznego w tym okresie życia. Słowa kluczowe: chemokiny, noworodek, zakażenie wrodzone Wiele funkcji układu odpornościowego noworodka nie jest w pełni sprawnych, co sprawia, że czynnikiem największego ryzyka wczesnego zakażenia, głównie uogólnionego, wydaje się stopień niedojrzałości, z którą bezpośrednio wiąże się niewydolność anatomiczna i czynnościowa układu immunologicznego. Układ ten jest immunokompetentny, lecz ze względu na stan pewnej naiwności jego elementy nie reagują zróżnicowaniem na antygen. Kształtowanie się mechanizmów obronnych zależy nie tylko od uwarunkowań genetycznych, obecności kompetentnych limfocytów i wzajemnych oddziaływań komórkowych, ale przede wszystkim od kontaktu układu odpornościowego z obcym antygenem. Odporność noworodka zależy również od przebiegu ciąży, czasu jej trwania oraz wydolności łożyska. Większość noworodków z wczesną postacią zakażenia prezentuje pewne słabo wyrażone objawy kliniczne. Mimo że w wielu przypadkach możliwe jest udowodnienie występowania położniczych czynników ryzyka, istnieją duże trudności diagnostyczne tym bardziej, że nie dysponujemy powszechnie akceptowalnym panelem badań laboratoryjnych, który umożliwiłyby ich wczesne i pewne rozpoznanie. Chemokiny są niskocząsteczkowymi białkami wydzielanymi przez leukocyty i inne komórki w stanie spoczynku lub po stymulacji [1]. Przeprowadzone na zwierzętach i u ludzi badania eksperymentalne in vivo wykazały, że stężenie chemokin wzrasta w przypadku zakażenia dróg oddechowych (w krótkim czasie po zakażeniu), powodując napływ komórek zapalnych [2-4]. Uczestniczą one także w wielu zakażeniach bakteryjnych, a zwłaszcza chorobach wywołanych przez patogeny wewnątrzkomórkowe. Nie ma jednoznacznego poglądu na zachowanie się chemokin w zakażeniach uogólnionych [4, 5]. Wydaje się, że odgrywają istotną rolę w przebiegu większości chorób, w których dochodzi do aktywacji i kumulacji leukocytów w tkankach [2, 6-9]. Celem pracy było określenie przydatności klinicznej wybranych chemokin $ MIP-1" (CCL3), MIP-1$ (CCL4), RANTES (CCL5) w rozpoznawaniu wczesnych zakażeń u noworodków urodzonych o czasie i przedwcześnie. Materiał i metodyka Badaniami objęto 211 noworodków urodzonych w Klinice Perinatologii i Ginekologii w Zabrzu w okresie od r. do r. (tab.1.) Do badań włączono noworodki bez wad rozwojowych, pochodzące z ciąż pojedynczych o prawidłowym przebiegu, matek zdrowych. U 16 noworodków, które od urodzenia demonstrowały kliniczne i laboratoryjne objawy zakażenia, ale w posiewach krwi nie wyhodowano drobnoustrojów, rozpoznawano zespół septyczny. Było to 6 noworodków urodzonych o czasie i 10 urodzonych przedwcześnie. U noworodków z retrospektywnie rozpoznaną posocznicą, zespołem septycznym lub zapaleniem płuc występowały najczęściej następujące czynniki ryzyka okołoporodowego: czynność porodowa niereagująca na leki tokolityczne, przedwczesne pęknięcie błon płodowych (tab. 2). Powszechnie uznane za typowe badania laboratoryjne upoważniające do rozpoznania zakażenia niejednoznacznie wskazywały na rozwijającą się infekcję wrodzoną. We krwi pępowinowej tylko dwukrotnie stwierdzono zwiększone stężenie białka C-reaktywnego (15,2 i 19,3 mg/l), Katedra i Oddział Kliniczny Ginekologii, Perinatologii i Neonatologii Wydziału Lekarskiego z Oddziałem Lekarsko-Dentystycznym w Zabrzu, Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach

2 Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego 141 Tabela 1. Charakterystyka badanych grup noworodków (wartości wyrażono jako Me [Q1-Q3]) Noworodki Zdrowe donoszone (grupa I) Chore donoszone (grupa II) Zdrowe wcześniaki (grupa III) Chore wcześniaki (grupa IV) N Płeć żeńska/męska 71 40/ / / /26 Wiek płodowy [tygodnie ukończone] 40,0 39,0-40,0 38,0 38,0-39,5 35,0 34,0-36,0 32,0 29,0-33,0 Masa ciała [g] 3290,0 2930,0-3515,0 2855,0 2470,0-3140,0 2145,0 1880,0-2480,0 1670,0 1250,0-2240,0 Długość [cm] 53,5 52,0-55,0 52,0 48,5-53,0 47,0 46,0-50,0 44,0 41,0-48,0 Apgar [punkty] 10,0 9,0-10,0 9,0 4,5-10,0 8,0 7,0-10,0 7,0 6,0-9,0 Tabela 2. Czynniki ryzyka okołoporodowego dla posocznicy, zespołu septycznego i zapalenia płuc rozpoznawanych retrospektywnie w badanej grupie chorych noworodków N Poród przedwczesny Przedwczesne pęknięcie błon płodowych PROM Zespół septyczny Posocznica Zapalenie płuc ZZO i zapalenie płuc Tabela 3. Charakterystyka opisowa stężeń wyrażonych w pg/ml w postaci statystyk pozycyjnych Me (Q1-Q3) dla noworodków zdrowych i chorych Grupy noworodków Zdrowe donoszone Zdrowe wcześniaki Chore donoszone Chore wcześniaki MIP-1" (CCL3) MIP-1$ (CCL4) RANTES (CCL5) 10,0* (10,0-47,5) 10, 0 (10,0-88,0) 17,9* (10,1-50,3,3) 10,0 (10,0-172,4) 208,9 (97,3-379,8 215,8 (103,0-502,5) 217,7 (152,3-1800,9) 168,6 (98,2-536,3) 61110* ( ) ( ) 72128* ( ) ( ) Znamienność statystyczna 0,07* NZ 0,006* leukocytoza w pierwszej dobie życia była dwucyfrowa, w zakażeniach bakteriami Gram (!) obserwowano tendencję do małopłytkowości ( /l). Natomiast odmłodzenie rozmazu w pierwszym badaniu krwi występowało w 42/67 (62%) rozpoznań zakażeń wczesnych. Wysokie wartości stężeń IL-6 (> 65 pg/ml) stwierdzono we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą, natomiast wysokie wartości IL-8 (> 150,0 pg/ml) tylko u noworodków urodzonych przedwcześnie z potwierdzonym zakażeniem wrodzonym. Ocenę stopnia dojrzałości noworodków przeprowadzono w oparciu o czas trwania ciąży, obliczony według reguły Naegellego i weryfikowany badaniem ultrasonograficznym, przed porodem oraz o urodzeniową masę ciała, odczytując wartość wieku płodowego z siatek centylowych opracowanych dla dzieci ze Śląska [10]. W przypadku niemożności ustalenia daty ostatniej miesiączki u matki wiek płodowy noworodka oceniano na podstawie badania w dniu porodu, posługując się skalą Ballarda [11]. Krew pępowinową pobierano bezpośrednio po porodzie. Po odwirowaniu surowicę zamrażano i do czasu wykonania oznaczeń przechowywano w temperaturze!70ec. Chemokiny oznaczano metodą immunoenzymatyczną ELISA, stosując zestawy Quantikine firmy R&D (Minneapolis, USA). Postępowano zgodnie z instrukcją oznaczania chemokin na podstawie metodyki badań immunoenzymatycznych dla poszczególnych zestawów. Czułość metody (minimalne wykrywane stężenia) wynosiła dla RANTES (CCL5) 8 pg/ml, dla MIP-1' (CCL3) 4 pg/ml, dla MIP-1$ (CCL4) 6 pg/ml. Oznaczenia z jednej próbki wykonywano podwójnie, podając wartość średnią, a współczynniki zmienności nie przekraczały 10%.

3 142 B. Królak-Olejnik Na przeprowadzenie badań uzyskano zgodę Komisji Bioetycznej Śląskiej Akademii Medycznej, NN /01 z dnia r. i NN /II/05 z dnia r. Do gromadzenia danych liczbowych wykorzystano arkusz kalkulacyjny Excel 5, a w celu wykonania analiz statystycznych zastosowano program Statistica 6 dla Windows [12]. W analizie posłużono się testem Shapiro-Wilka i testem zgodności Chi 2. Zbadano również symetrię rozkładów, opierając się na współczynniku skośności. Rozkłady niektórych parametrów wykazały własności asymetrii dodatniej, inne ujemnej. W związku z tym porównań dwóch prób dokonano testem U Manna-Whitneya, a charakterystykę opisową przedstawiono w postaci statystyk pozycyjnych, takich jak mediana, kwartyle (dolny i górny). Przy wysoce istotnej różnicy cechy ciągłej, poprzez zastosowanie regresji logistycznej podjęto próbę oceny wpływu każdej z nich na cechę jakościową typu dychotomicznego, której wartości odpowiadały alternatywnym stanom zdrowia. Wszystkie testy zostały wykonane na poziomie istotności " = 0,05. Wyniki i ich omówienie Oceniono stężenia chemokin $ w grupach noworodków zdrowych i chorych (tab. 3). Porównano wartości stężeń MIP-1" (CCL3) u noworodków zdrowych i chorych, urodzonych zarówno o czasie, jak i przedwcześnie, nie wykazano różnic znamiennych statystycznie. Kolejne analizy dotyczyły porównywania stężenia MIP-1" (CCL3) u noworodków zdrowych z wartościami tego parametru u noworodków z posocznicą, a także chorych bez posocznicy. Na tej podstawie dokonano podziału noworodków chorych, zgodnie z przyjętą w materiale zasadą, na noworodki z posocznicą (tu ujęto także noworodki z zespołem septycznym) i z zakażeniem (zapalenie płuc) oraz niewydolnością oddychania (ZZO i TTN). Nie uzyskano różnic istotnych statystycznie w grupach innych niż z posocznicą p = 0,0064 (ryc. 1). MIP-1 750,0 500,0 250,0 75,0 50,0 25,0 7,5 zdrowe z zakażeniem z posocznicą z ZZO i TTN Noworodki Mediana 25-75% Min.-Maks. Ryc. 1. Porównanie wartości stężeń MIP-1" (CCL3) we krwi pępowinowej noworodków zdrowych i chorych Szukając powiązania prawdopodobieństwa choroby z wielkością MIP-1" (CCL3), poddano analizie regresji logistycznej wartości tej chemokiny we krwi pępowinowej noworodków chorych i zdrowych. Uzyskany model był istotny statystycznie, jednak z powodu niskiej zdolności klasyfikacyjnej (10,0%) dla noworodków chorych nie umieszczono go w pracy. Także wartości przeciętne stężeń chemokiny MIP-1$ (CCL4) we krwi pępowinowej noworodków chorych, bez względu na rodzaj schorzenia, nie wykazały różnic znamiennych statystycznie w porównaniu z noworodkami zdrowymi. Wykazano natomiast, że wartość przeciętna stężeń RANTES (CCL5) u noworodków zdrowych była znamiennie wyższa niż u nowrodków chorych. Na podstawie wyników uzyskanych dla zdrowych noworodków, wykazano że wiek płodowy ma statystycznie istotny wpływ na przeciętną wartość stężenia RANTES (CCL5) [13-15]. Mediana stężeń tej chemokiny noworodków urodzonych o czasie jest wyższa niż noworodków urodzonych przedwcześnie. W grupie zdrowych było aż 60% (64/107) noworodków urodzonych o czasie, natomiast w grupie chorych tylko 18% (12/67). Sytuacja ta mogła spowodować, że uzyskano wyższą wartość przeciętną dla grupy noworodków zdrowych. Aby ocenić wpływ choroby na przeciętną wartość stężenia RANTES (CCL5) niezależnie od wieku płodowego, dokonano rozłącznych porównań chorych i zdrowych w podgrupach, czyli urodzonych o czasie i przedwcześnie. Potwierdza to, że różnice znamienne statystycznie przeciętnych wartości stężeń RANTES (CCL5) grup chorych i zdrowych wynikały z różnic wieku płodowego noworodków, nie były zależne od występowania choroby. Odstąpiono zatem od analizy stężenia RANTES (CCL5) we krwi pępowinowej noworodków w zależności od rodzaju choroby. W przeprowadzonych badaniach spośród chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków chorych wartości stężeń RANTES (CCL5) były znamiennie niższe [ ( ) pg/ml] niż u noworodków zdrowych [ ( ) pg/ml]. Również Ng PC i wsp. wykazali znamienne obniżenie stężenia RANTES (CCL5) u dzieci z najcięższą postacią posocznicy powikłanej zespołem wykrzepiania wewnątrznaczyniowego [8]. Badali oni panel cytokin i chemokin w początkowym okresie wystąpienia objawów posocznicy u noworodków z masą ciała poniżej 1500 g wykazując ich wzrost, z wyjątkiem stężenia RAN- TES. Wartości RANTES (CCL5) poniżej 3110 ng/l wraz z IL-10 powyżej 208 ng/l i IL-6 powyżej 168 ng/l pozwoliły autorom przewidzieć rozpoznanie zespołu wykrzepiania wewnątrznaczyniowego w przebiegu posocznicy przed wystąpieniem objawów klinicznych (czułość 100%, specyficzność 97%) [8]. Podobne dane przedstawili Fotopoulos i wsp., badając zachowanie się chemokin we krwi obwodowej noworodków z niedotlenieniem okołoporodowym oraz okołoporodowym i nabytym zakażeniem [5]. Stężenie

4 Ocena chemokin $ we krwi pępowinowej noworodków z grup ryzyka zakażenia wewnątrzmacicznego 143 RANTES (CCL5) było znamiennie niższe u noworodków z perinatalnym zakażeniem w porównaniu z grupą kontrolną noworodków zdrowych. Wartości RANTES (CCL5) dla noworodków zdrowych w 1. dobie życia wynosiły ( ) pg/ml, a dla noworodków z zakażeniem ( ) pg/ml. Według Fotopoulos i wsp. redukcja stężenia RANTES (CCL5) obserwowana u noworodków w stosunku do dorosłych jest efektem występowania mniejszej liczby komórek T CD45RO+/ CD8+ odpowiedzialnych za ich sekrecję [5]. Ponadto zakażenie może nasilać supresję stężenia RANTES (CCL5) w surowicy. Autorzy wykazali wzrost stężenia tej chemokiny dopiero w czwartej dobie zakażenia w porównaniu z grupą kontrolną. Z przeprowadzonych badań wynika, odmiennie niż przedstawił w pracy Fotopoulos i wsp., że stężenie MIP-1" (CCL3) wzrastało we wczesnej posocznicy [5]. Wzrost stężenia badanej chemokiny autorzy obserwowali w zakażeniu nabytym. Wartości MIP-1" (CCL3) wynosiły dla zdrowych noworodków 53,1 (48,7-64,6), a dla noworodków z zakażeniem 48,8 (36,3-50,0) pg/ml [5]. W naszych badaniach wartości tej chemokiny wynosiły 10,0 (10,0-47,5) pg/ml dla zdrowych noworodków oraz 14,0 (10,0-118,3) dla chorych i stwierdzono jedynie tendencję w kierunku istotnej różnicy. Dopiero wyodrębnienie grupy dzieci z posocznicą i porównanie wartości ich stężeń MIP-1" (CCL3) ze stężeniami zdrowych noworodków i chorych bez posocznicy pozwoliło uzyskać różnice znamienne statystycznie. Najwyższe wartości stężeń MIP-1" (CCL3) wykazano we krwi pępowinowej noworodków z posocznicą [125,8 (10,3-301,0) pg/ml]. Wyniki własne nie potwierdzają zatem danych uzyskanych przez Fotopoulos i wsp. dotyczących tej chemokiny. Uzyskane wyniki są natomiast zgodne z ustaleniami Knapp i wsp., którzy badali stężenie MIP-1" (CCL3) we krwi pacjentów z posocznicą wywołaną przez bakterie Gram (+) [16]. Stężenie tej chemokiny było znamiennie wyższe u chorych niż u zdrowych osób, odpowiednio 50 pg/ml i 25 pg/ml. Na podkreślenie zasługuje rola MIP-1" (CCL3) i MIP-1$ (CCL4), jaką odgrywają one w rozwoju odpowiedzi zapalnej w przebiegu zakażenia poprzez regulację napływu komórek jednojądrzastych, modulację produkcji cytokin i wpływ na ciepłotę ciała [4]. Istotne jest wykazanie obecności innych mediatorów zakażenia, trudnych jeszcze do określenia jako pro- lub przeciwzapalne, we krwi pępowinowej wszystkich badanych noworodków. Wyjaśnienie mechanizmów immunologicznych, zarówno u noworodków zdrowych, jak i chorych, pozwoli w przyszłości na wprowadzenie skuteczniejszych metod diagnostycznych i leczniczych, być może umożliwi ocenę stosowanej terapii, pozwoli wyselekcjonować noworodki szczególnie zagrożone, a może nawet ułatwi profilaktykę zakażeń. Piśmiennictwo [1] Rollins B.J. (1997) Chemokines. Blood 90: [2] Gerard C., Rollins B.J. (2001). Chemokines and disease. Nature Immunol. 2: [3] Jasiewicz-Worsztynowicz B.M. Karnas-Kalemba W.Z. (2004). Różne aspekty działania chemokiny RANTES i możliwości jej wykorzystania w diagnostyce i terapii. Wiad. Lek. LVII: [4] O Grady N.P., Tropea M., Preas II H.L. et al. (1999). Detection of Macrophage Inflammatory Protein (MIP)- " and -1$ during experimental endotoxemia and human sepsis. J. Infect. Dis. 179: [5] Fotopoulos S., Mouchtouri A., Xanthou G. et al. (2005). Inflammatory expression in the peripheral blood of neonates with perinatal asphyxia and perinatal or nosocomial infections. Acta Paediatr. 94: [6] Baggiolini M.(2001) Chemokines in pathology and medicine. J. Inter. Med. 249: 1-14 [7] Locati M., Bonecchi R., Corsi M.M. (2005). Chemokines and their receptors. Roles in specific clinical conditions and measurement in the clinical laboratory. Am. J. Clin. Pathol. 123 (suppl.1): S1-S14. [8] Ng P.C., Li K., Leung T.F. et al. (2006). Early prediction of sepsis-induced disseminated intravascular coagulation with interleukin-10, interleukin-6, and RANTES in preterm infants. Clin. Chem. 52: [9] Sullivan S.E., Staba S.L., Gersting J.A. et al. (2002). Circulating concentrations of chemokines in cord blood, neonates and adults. Pediatr. Res. 51: [10] Baumert M., Osuch-Jaczewska R., Paprotny M., Machalski T. (1993).Wskaźniki biologiczne rozwoju noworodków śląskich urodzonych między 30 a 42 tygodniem ciąży. Wiad. Lek. 46: [11] Gomella T.L. Red. Neonatologia, Śląska Akademia Medyczna, Katowice [12] Stanisz A. (2000). Przystępny kurs statystyki z wykorzystaniem programu Statistica pl na przykładach z medycyny. t. II, StatSoft Polska Sp. z o.o, [13] Królak-Olejnik B., Olejnik I., Beck B. (2006). Umbilical serum concentrations of chemokines (RANTES, MGSA/GRO-") in preterm and term neonates. Pediatr. Int. 48(6): [14] Królak-Olejnik B., Olejnik I., Kaźmierczak W. (2005). CC-chemokines concentrations in the umbilical cord blood preterm and term neonates. J. Ped. Neonatal. 2(1), N [15] Królak-Olejnik B. (2007) Stężenie wybranych chemokin a GRO a (CXCL1), ENA-78 (CXCL5) oraz wybranych chemokin b - MIP-1a (CCL3), MIP-1b (CCL4), RANTES (CCL5) we krwi pępowinowej noworodków urodzonych o czasie i przedwcześnie w zależności od sposobu rozwiązania ciąży i patologii okołoporodowej. Rozprawa habilitacyjna. Śląska Akademia Medyczna w Katowicach. [16] Knapp S., Thalhammer F., Locker G.J. et al. (1998) Prognostic value of MIP-1alpha, TGF-beta2, selam-1, and svcam-1 in patients with Gram-positive sepsis. Clin. Immunol. Immunopathol. 87: J Katedra i Oddział Kliniczny Ginekologii, Perinatologii i Neonatologii Wydziału Lekarskiego w Zabrzu Zabrze, Wolności 232/6 olejnik@olejnik.x.pl

5 144 B. Królak-Olejnik Chemokines $ in the umbilical cord blood in the newborns from risk groups of intrauterine infection Newborns intrauterine infection is very serious problem of current perinatology and neonatology. Aim of the study is to determine the clinical usefulness of chosen chemokines $ in the umbilical cord blood of newborns, recognised as mediators of infection in the study both in vitro and in adults, in the diagnosis of intrauterine infection in newborns. In the study level of MIP-1" (CCL3), MIP-1$ (CCL4), RANTES (CCL5) in the umbilical cord blood of 211 newborns was measured. Serum cord blood MIP-1" (CCL3) was higher in newborns with bacterial sepsis, however RANTES (CCL5) was lower in the cord blood of newborn both preterm and infected. Level of MIP-1$ (CCL4) was almost the same in the study groups of newborns. Research which was carried out allowed for the confirmation of the presence of study chemokines in the cord blood of study group of newborns. But the results achieved do not allow determining categorically their clinical usefulness. However they constitute important element of further study into the immunological system in the period of life. Key words: chemokines, newborn, intrauterine infection