ODKRYCIE POLIMERAZY RNA IV

Transkrypt

1 ODKRYCIE POLIMERAZY RNA IV Ewa Róg-ZieliR Zielińska

2 POLIMERAZY RNA U eukariota występuj pują trzy podstawowe rodzaje polimeraz RNA zależnych od DNA Wszystkie te polimerazy są złożone one z około o białek, w tym niektóre ich podjednostki wykazują homologię strukturalną i sekwencyjną z polimerazami RNA bakterii - szczególnie bakteryjnych podjednostek β,β`, `,α i ω.

3 POLIMERAZY RNA: POLIMERAZA RNA I POLIMERAZA RNA II TRANKRYBUJE: Geny kodujące rybosomalne RNA (rdna( rdna) zlokalizowane w obrębie bie NOR większo kszość genów, w tym geny kodujące białka POLIMERAZA RNA III geny kodujące krótkie (<400 nt) ) strukturalne RNA, takie jak trna i 5S rrna

4 Analiza genomu Arabidopsis thaliana wykazała, a, że e istnieje czwarta klasa polimeraz jest ona różna r od polimeraz RNA chloroplastów, mitochondriów w czy też polimeraz RNA zależnych od RNA. Geny kodujące największe elementy nowo odkrytej polimerazy IV oznaczone zostały jako NRPD1a i NRPD1b,, oznaczone zostały one u A.thaliana oraz u ryżu Drugą pod względem wielkości podjednostkę nazwano NRPD2a Istnieją dwa kompleksy polimerazy IV : - pol IVa NRPD1a + NRPD2a - pol IVb NRPD1b + NRPD2a Sugeruje się, że polimeraza IV ma znaczenie podczas formacji heterochromatyny.

5 Ruchome elementy genetyczne Transpozony zdolne do zmiany miejsca położenia w genomie (transpozycji). Są to odcinki DNA o długod ugości setek do tysięcy par zasad Mogą wywoływa ywać duże e zmiany w strukturze genomu inwersje, delecje,, duplikacje W komórce transpozony jednego typu mogą występowa pować w liczbie kilku do kilkunastu kopii

6 WYCISZANIE EPIGENETYCZNE Mechanizmami prowadzącymi do wyciszenia genów w bez zmiany ich sekwencji mogą być np. metylacje DNA oraz modyfikacje histonów, między innymi de- i acetylacja oraz metylacja Mówi się, że metylacja DNA może chronić roślin linę i nadawać jej odporność przeciwko genetycznym elementom ruchomym Wyciszanie towarzyszące metylacji chroni roślin linę przed transpozycją, która doprowadzić by mogła a do zaburzenia struktury genomu, powstawania mutacji i zaburzeń metabolizmu

7 Wyciszanie epigenetyczne Inaktywacja transkrypcji poprzez heterochromatynizację lub metylację DNA takich elementów w jest sposobem ogranicznenia ich negatywnego wpływu na gospodarza Wyciszanie genów w jest naturalną odpowiedzią komórki roślinnej na atak patogena,transpozycję bądź niepożą żądaną rearanżacj ację DNA.

8 Bardzo częst stą modyfikacją DNA jest metylacja cytozyny, katalizowana przez metylotransferazy

9

10

11 Szczegółowe badania sugerują, że omawiana polimeraza IV może e brać udział w zjawisku określanym jako kierowana przez RNA metylacja DNA RdDM (ang. RNA-directed DNA methylation) W mechanizmie tym bierze udział oprócz polimerazy IV kilka innych elementów w : sirna Polimeraza RNA zależna od RNA Kompleks tnący DCL-3 Białka z rodziny Argonaute Specyficzne metylotransferazy

12 Elementy szlaku RdDM sirna ang. small interfering RNA krótkie, tkie, około o nukleotydowe odcinki dwuniciowe DNA mają na 3` końcu 2 wolne nukleotydy i ufosforylowany koniec 5` Powstają z dłuższych d odcinków w RNA dzięki aktywności kompleksu Dicer Biorą udział w zjawisku interferncji RNA (RNAi) Wyciszanie genów mediowane przez RNAi może zachodzić posttranskrypcyjnie przez degradację odpowiedniego RNA lub hamownie translacji. Może e też zachodzić na poziomie transkrypcji przez metylację DNA lub histonów.

13 Elementy szlaku RdDM Argonaute są białkami zawierającymi domenę PAZ i PIWI, sąs zaangażowane w szlaki interferencji RNA. białka te przyłą łączają sirna i używaju ywają ich jako przewodników w do odnalezienia homologicznych (komplementarnych) sekwencji podczas wyciszania genetycznego. Domena PAZ białka Argonaute wiąże 2 końcowe nukleotydy sirna, zaś koniec 5` sirna jest stabilizowany przez dwuwartościowy kation w domenie PIWI. U A.thaliana w fenomen RdDM zaangażowane jest białko Ago4

14 Elementy szlaku RdDM DCL-3 3 (ang. Dicer-like like-3) - jest to podklasa rodziny RNAz III, katalizuje rozcięcie cie dsrna na sirna DRM2 metylotransferaza cytozyny, przeprowadza metylację DNA de novo

15 Proponuje się, że polimeraza IV jest wymagana do produkcji sirna,, które kierują metylacją de novo elementów powtarzalnych, które sąs podmiotem fakultatywnej heterochromatynizacji. Prowadzi to do wytworzenia wyższej struktury hierarchicznej materiału genetycznego. u mutantów pol IV obserwuje się utratę metylacji cytozyny między innymi w obrębie bie regionu okołocentromerycznego ocentromerycznego, gdzie zlokalizowane sąs geny 5S rrna i retroelementu AtSN1. Metylacja regionu konstytutywnie heterochromatynowego nie jest zaburzona

16 Szlak RdDM NRPD1a syntetyzuje jednoniciowe RNA na matrycy DNA transpozonów,, wysoce powtarzalnych loci lub wirusów, w, które sąs podmiotem RdDM. za pomocą polimerazy RNA zależnej od RNA (RDR2) dosyntetyzowana jest komplementarna nić Kompleks DCL3 tnie tak powstałe dsrna na 24-nukleotydowe sirna. Te sirna są załadowywane adowywane w kompleks z Ago4/NRPD1b, który aktywuje odpowiednią metylotransferazę (DRM2), która następnie metyluje DNA w miejscach, do których pokierowana została a przez kompleks Ago4/NRPD1b/NRPD2a/siRNA

17

18 DOWODY na szlak RdDM Ago4 w nieobecności ci sirna produkowanych przez NRPD1a, RDR2 i DCL3 staje się białkiem wysoce niestabilnym. Ago4 i NRPD1b kolokalizują się w ciałku jądrowym przyległym ym do jąderka, j nie barwiącym się DAPI, ich wspóln lną lokalizację wykazano stosując c mikroskopię fluorescencyjną Wykorzystując c metodę filtracji żelowej lizatów komórkowych pokazano, że e Ago4 wchodzi w stabilny kompleks z NRPD1b, za pomocą dużej, wielokrotnie powtórzonej domeny C-terminalnej. C Immunoprecypitowane Ago4 zawiera 45s i 5s sirna.

19 DOWODY Geny 5S rrna są tandemowo ułożone u one w okołocentromerowych ocentromerowych regionach chromosomów w 3, 4 i 5. U mutantów nrpd2 geny te sąs jednak zdekondensowane i wykazują mniejszą styczność z centromerami Delecja genów w kodujących komponenty szlaku RNAi u aktywnie dzielących się drożdży y doprowadziła a do utraty wyciszenia transgenu wprowadzonego do regionu heterochromatyny centromerowej

20 LOKALIZACJA PROCESU Badania z wykorzystaniem markerów specyficznych dla ciałka Cajala wykazały, y, że e tam prawdopodobnie lokalizuje się duża a część procesu RdDM Ciało Cajala jest dobrze poznanym kompartmentem jądrowym, który bierze udział w powstawaniu i dojrzewaniu kilku typów w kompleksów rybonukleoproteinowych. modyfikowane sąs tam posttranskrypcyjnie (metylacja i pseudourydylacja) snrnp, biorące potem udział w splicingu. W Ciałkach Cajala zachodzi też biogeneza snornp oraz obróbka bka końca 3` mrna histonów

21

22 Modyfikacje chromatyny w tych docelowych miejscach mogą służyć późniejszym zasileniom całej maszynerii RNAi żeby podtrzymać dalsze rundy wyciszania za pomocą sirna - metylacja stymuluje polimerazę IV do produkcji RNA kompetentnego do dalszej produkcji sirna (pol l IV jest wyspecjalizowana w transkrybowaniu zmetylowanego DNA) Sugeruje się że sirna-kierowana metylacja DNA indukuje produkcję transkryptów RNA i odpowiednich sirna w pozytywnym sprzęż ężeniu zwrotnym.

23 Wykazano także, że e rozmiar elementu ma znaczny wpływ na nasilenie zależnej od DRM2 i Ago4 metylacji.. Większo kszość elementów w ruchomych skupia się w regionach okołocentromerowych ocentromerowych,, co prowadzi do powstania dużych, wyciszonych bloków heterochromatynowych, zaś elementy, które się włączyły y dalej są izolowane. Te elementy mogą być trudniejsze do wyciszenia niż te skupione. Dzięki mechanizmowi RdDM możliwe jest trafienie w te małe, trudne do złapania z dla innej maszynerii elementy, które przemieszczając c się mogłyby zaburzyć organizację genomu.

24 PODSUMOWANIE Zlokalizowana na terenie jądra j polimeraza RNA IV jest wymagana do produkcji sirna,, które kierują RNA- zależną metylacją DNA i wyciszaniem genomowych sekwencji powtarzalnych, włączając c w to elementy ruchome i powtórzenia okołocentromerowe ocentromerowe, stanowiąc c przez to jeden z mechanizmów obrony rośliny przez zaburzeniami genomu

25 Literatura Li C.F i wsp.: An Argonaute4-containing nuclear processing center colocalized with Cajal Bodies in Arabidopsis thaliana ; Cell,, Vol Ondera Y i wsp.: Plant nuclear RNA polymerase IV mediates sirna and DNA methylation-dependent heterochromatin formation ; Cell, Vol.102 ( ) 2005 Tran R.K.:.: Chromatin and sirna pathways cooperate to maintain DNA methylation of small transposable elements in Arabidosis ; Genome Biology,, Vol Vazquez F.: Arabidopsis endogenous small RNA highways and byways ; Trends in plant science, Vol.11, Nr 9 ( )) 2006 Zamore P.D.: Ribo-genome: the big world of small RNAs ; Science,, Vol.309 ( )) 2005