Świat małych RNA. Monika Zakrzewska-Płaczek

Transkrypt

1 Świat małych RNA Monika Zakrzewska-Płaczek

2 Małe RNA (small RNAs, srnas) srna nt wyciszanie ekspresji genów: (gene silencing, RNA silencing) post-transkrypcyjne wyciszanie genów (post-transcriptional gene silencing, PTGS) degradacja mrna, inhibicja translacji AAAAA transkrypcyjne wyciszanie genów (transcriptional gene silencing, TGS) epigenetyczne modyfikacje chromatyny RNA Pol modyfikacja histonów, metylacja DNA 2

3 PTGS: post-transkrypcyjne wyciszanie genów Klasy małych RNA: mirna (microrna) rośliny, zwierzęta, wirusy, Protista 20 25nt Drosha (u zwierząt) + Dicer Transkrypcja przez Pol II/Pol III Regulacja stabilności mrna (cięcie mrna), inhibicja translacji mirtrony pochodzące z intronów prekursorów mrna genów kodujących białka; występują u zwierząt; niezależne od Drosha sirna (small interferring RNA) większość działa in cis, za wyjątkiem tasirna exo-sirna (pochodzenia egzogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista 21-24nt Dicer Transgeniczny, wirusowy lub inny egzogenny RNA Post-transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, obrona przeciwwirusowa endo-sirna (pochodzenia endogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista ~21nt Dicer Transkrypcja dwukierunkowa lub zbieżna, wiązanie mrna z transkryptami pseudogenów o przeciwnej orientacji Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów tasirna (trans-acting sirna) rośliny 21nt DCL4 TAS RNA cięte przez mirna Regulacja posttranskrypcyjna natsirna (natural antisense transcripts-derived sirna) rośliny 24nt 21nt DCL2 DCL1 Transkrypcja dwukierunkowa indukowana stresem Regulacja genów odpowiedzi na stres 3

4 TGS: transkrypcyjne wyciszanie genów Klasy małych RNA: sirna (small interferring RNA) endo-sirna (pochodzenia endogennego) rośliny, grzyby, zwierzęta, Protista ~21nt Dicer Transkrypcja dwukierunkowa lub zbieżna, wiązanie mrna z transkryptami pseudogenów o przeciwnej orientacji Post-transkrypcyjna i transkrypcyjna regulacja ekspresji genów, regulacja aktywności transpozonów hc-sirna (heterochromatic sirna) rośliny, S. pombe 24-26nt DCL3 Transpozony, powtórzenia Modyfikacja chromatyny pirna (Piwi-interacting RNA) Drosophila, C. elegans, ssaki, Danio rerio 24 30nt niezależne od Dicer Długie pierwotne transkrypty (?) Regulacja aktywności transpozonów, inne nieznane funkcje 4

5 Białka Dicer i Argonaute (AGO): główne elementy szlaku wyciszania RNA Dwuniciowy RNA (double-stranded RNA, dsrna) jest cięty przez Dicer na krótkie dwuniciowe cząsteczki steczki RNA, które sąs wiązane przez jedno z białek rodziny ARGONAUTE. DICER AGO wyciszenie 5

6 Wyciszanie ekspresji genów sirna-posttranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów AGO AAAn DCL AGO AGO RNA Pol mirna - inhibicja translacji, cięcie mrna AGO AAAn DCL MIR gene RNA Pol AGO AAAn AGO AAAn mrna AAAn RNA Pol 6

7 Dicer i Dicer-like Podczas biogenezy sirna i mirna, białka Dicer lub Dicer-like (DCL) tną długie dsrna lub RNA o strukturze spinki (hairpin) na fragmenty ~ 21 25nt. RIII PAZ RIII Struktura białka Dicer umożliwia równomierne r rozcinanie RNA na fragmenty o takiej samej długod ugości. MacRae,, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic,, A., Brooks, A.N., Cande,, W.., Adams, P.D., and Doudna,, J.A. (2006) Science 7

8 Dicer i Dicer-like RIII PAZ konserwatywna domena wiążą ążąca dsrna (dsrbd- dsrna-binding domain) oddziałuje z końcem 3 3 dsrna PAZ RIII 2 domeny typu RNazy III aktywność endonukleolityczna 5 P P / 3 OH3 MacRae,, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic,, A., Brooks, A.N., Cande,, W.., Adams, P.D., and Doudna,, J.A. (2006) Science 8

9 Argonaute Białka ARGONAUTE wiążą srna i mrna PAZ A. thaliana ago1 Argonauta argo N-term PIWI MID Nazwa ARGONAUTE pochodzi od mutanta argonaute1 A. thaliana; który swoim kształtem przypomina ośmiornicężeglarka (Argonauta). Bohmert,, K., Camus,, I., Bellini,, C., Bouchez,, D., Caboche,, M., and Benning,, C. (1998) EMBO J. Song, J.-J., J., Smith, S.K., Hannon, G.J., and Joshua-Tor Tor,, L. (2004) Science 9

10 Argonaute Białka ARGONAUTE wiążą srna i mrna N-term PAZ PIWI MID PAZ oddziałuje z końcem 3 3 srna MID (middle) MID oddziałuje z nukleotydem na końcu 5 5 srna PIWI struktura podobna do RNazyH w niektórych białkach Ago: cięcie cie RNA zwiazanego z srna (slicer activity) 10

11 Dicer i Argonaute u różnych r nych organizmów Species Argonaute-PIWI PIWI-like Argonaute PIWI Dicer-like RdRP Plantae Arabidopsis thaliana Oryza sativa 10 (AGO1-10) (DCL 1-4) Saccharomyces cerevisiae Fungi Schizosaccharomyces pombe Neurospora crassa Aspergillus nidulans Caenorhabditis elegans (Dicer + Drosha) 4 Metazoa Drosophila melanogaster Danio rerio (2 Dicers + Drosha) 2 (Dicer + Drosha) - - Homo sapiens (Dicer + Drosha) - 11

12 U roślin w biogenezie mirna i sirna uczestniczą różne białka DCL AtDCL1 mirna DCL1 AtDCL2-4 sirna DCL4 Rośliny mają 4 (i więcej) białek DCL: większa niż u innych organizmów w liczba białek DCL umożliwia roślinom bardziej precyzyjną i skuteczną obronę przed patogenami. Margis,, R., Fusaro,, A.F., Smith, N.A., Curtin, S.J., Watson, J.M., Finnegan, E.J., and Waterhouse, P.M. (2006) FEBS Lett. 12

13 U roślin w biogenezie mirna i sirna uczestniczą różne białka DCL AtDCL1 mirna DCL1 Arabidopsis thaliana: DCL1 21nt mirna AGO1/7/10 DCL2 22nt sirna AtDCL2-4 sirna DCL4 DCL3 24nt sirna AGO4/6 DCL4 21nt sirna AGO1 tasirna 13

14 sirna strażnicy genomu ochrona genomu przed obcym materiałem em genetycznym (exo( exo-sirna): transgenicznym wirusowym (VIGS viral induced gene silencing) endo-sirna sirna: wyciszanie transpozonów i sekwencji powtórzonych utrzymywanie niektórych genów w stanie epigenetycznie nieaktywnym 14 Lam, E., Kato, N., and Lawton, M. (2001). Nature

15 Exo-siRNA: wyciszanie transgenów Transgeny wprowadzane sztucznie sąs często wyciszane przez sirna Wyciszenie może e być wywołane: bardzo wysokim poziomem ekspresji transgenu dwuniciowym RNA pochodzącym cym z ekspresji transgenu nieprawidłowymi RNA pochodzącymi cymi z ekspresji transgenu Transgeny są wyciszane post-trans transkrypcyjnie i transkrypcyjnie sirna-posttranskrypcyjne lub transkrypcyjne wyciszanie ekspresji genów AGO AAAn DCL RISC (RNA-induced silencing complex) AGO AGO RNA Pol 15

16 Post-transkrypcyjne transkrypcyjne wyciszanie genów w u roślin transgene-induced post-transcriptional transcriptional silencing Eksperymenty modyfikacji koloru kwiatów petunii (Petunia hybrida) - odkrycie mechanizmu wyciszania genów jądro komórkowe komórka roślinna DNA Agrobacterium tumefaciens na powierzchni komórki roślinnej Martha Hawes, University of Arizona 16

17 Manipulacja ekspresją genu syntazy chalkonowej: zmiana pigmentacji kwiatów w petunii CHS Dzikie kwiaty petunii zawierają antocyjaniny nadające purpurową barwę syntaza chalkonowa (CHS) enzym szlaku biosyntezy antocyjanin antocyjaniny 17 Aksamit-Stachurska et al. BMC Biotechnology 2008 Foto: Richard Jorgensen

18 Oczekiwanie synteza RNA o prawidłowej orientacji pogłę łębi barwę kwiatów... gen PRO ORF mrna translacja mrna transgen konstrukt o orientacji sens mrna dodatkowa translacja mrna mrna 18

19 a a synteza RNA o odwróconej orientacji zablokuje syntezę barwnika gen PRO ORF mrna translacja mrna transgen konstrukt o orientacji sens mrna dodatkowa translacja mrna mrna transgen konstrukt o orientacji antysens RNA antysensowny tworzenie dupleksów w RNA sens-antysens inhibicja translacji 19

20 Nieoczekiwanie, wprowadzenie zarówno konstruktów sens jak i antysens prowadzi do inhibicji syntezy barwnika rośliny zawierające transgen CHS CaMV 35S pro : CHS lub CaMV 35S pro : sens antysens CHS 20 Foto: Richard Jorgensen

21 W modyfikowanych roślinach nie dochodzi do syntezy ani endogennej ani transgenicznej CHS purpurowe kwiaty białe kwiaty Zjawisko wyciszania zarówno endogennego jak i sztucznie wprowadzonego genu nazywamy kosupresją transgeniczny RNA endogenny RNA RNase protection 21 Napoli,, C., Lemieux,, C., and Jorgensen, R. R (1990) Plant Cell

22 Kosupresja jest wynikiem produkcji sirna typ dziki PRO gen ORF mrna translacja mrna roślina transgeniczna kosupresja mrna AGO AGO AAAA konstrukt sens PRO gen ORF mrna produkcja sirna AGO AAAA De Paoli, E., Dorantes-Acosta, A., Zhai, J., Accerbi,, M., Jeong,, D.-H., Park, S., Meyers, B.C., Jorgensen, R.A., and Green, P.J. (2009). 09). RNA 22

23 VIGS - viral induced gene silencing wirusowa polimeraza RNA zależna od RNA wirusowy ssrna wirusowy dsrna DCL4 Większość roślinnych wirusów to wirusy RNA, których replikacja odbywa się poprzez dsrna dsrna jest cięty przez DCL4 (lub DCL2) powstają 21-22nt sirna które wiążą się z AGO1 wyciszenie replikacji wirusa AGO1 AGO1 23

24 Infekcja wirusowa powoduje akumulację sirna AGO DCL liść inokulowany 24

25 Sygnał wyciszający cy może e rozprzestrzeniać się w całej roślinie poprzez floem Arabidopsis thaliana: egzogenne sirna 21 i 24nt wyciszanie transgenu GFP endogenne sirna tylko 24nt sąs mobilne (zaangażowane głównie g w TGS poprzez remodelowanie chromatyny, pochodzą z transpozonów i innych zmetylowanych rejonów genomu) wyciszenie inokulowany liść Chitwood D. H., Timmermans M. C. P. (2010)) Nature 25 Voinnet,, O., and Baulcombe,, D. (1997) Nature

26 Mutanty biogenezy sirna są mniej odporne na choroby wirusowe i patogeny bakteryjne Wyciszanie wirusa TRV Tobacco Rattle Virus (wirus nekrotycznej kędzierzawki tytoniu) w roślinach A. thaliana dzikiego typu zapobiega objawom choroby. Mutanty dcl są niezdolne do zahamowania infekcji. WT Arabidopsis inokulowany TRV Podwójny mutant dcl2-dcl4 dcl4 inokulowany TRV Deleris,, A., Gallego-Bartolome Bartolome,, J., Bao,, J., Kasschau,, K., Carrington, J.C., and Voinnet,, O. (2006) Science Navarro, L., Jay, F., Nomura, K., He, S.Y., and Voinnet,, O. (2008) Science A. thaliana dzikiego typu (La-er) i mutanty biogenezy srna (dcl1-9 i hen1-1) inokulowane bakteriami Pseudomonas. 26

27 VIGS - podsumowanie Wyciszanie ekspresji genów za pośrednictwem sirna jest ważnym mechanizmem obrony roślin przed patogenami wirusami i bakteriami sirna hamują replikację wirusową u roślin (również u zwierząt - Drosophila melanogaster) sirna działają ogólnoustrojowo u roślin mogą się przemieszczać poprzez wiązki przewodzące Większość wirusów wytwarza białka supresorowe,, hamujące szlak wyciszania 27

28 Exo-siRNA u zwierząt: dsrna najsilniejszy inicjator wyciszania modyfikacje genetyczne nicienia C. elegans: Wprowadzanie do organizmów nicieni Caenorhabditis elegans RNA o prawidłowej lub odwróconej orientacji, oraz dwuniciowych RNA, odpowiadających sekwencji genu unc-22, kodującego miofilamentowe białko komórek mięśniowych. Wyciszenie unc-22 powoduje fenotyp kurczenia ciała (twitching) RNA sens bez zmian fenotypowych RNA antysens bez zmian fenotypowych dsrna fenotyp twitching 28 Fire, A. et al., (1998) Nature

29 Exo-siRNA u zwierząt: U ssaków w i C. elegans tylko jedno białko Dicer,, odpowiada za biogenezę zarówno sirna,, jak i mirna Drosophila melanogaster: Dcr1 mirna Dcr2 sirna, wiązane przez AGO2 obrona przeciwwirusowa egzogenny dsrna wirusowy dsrna cięcie cie mrna obrona przeciwwirusowa 29 Okamura K. & Lai E.C. (2008) Mol Cell Biol

30 Efekt wyciszenia jest wzmacniany przez amplifikację sirna RdRP polimeraza RNA zależna od RNA (RNA-dependent RNA Polymerase) DCL RdRP 1-rzędowy sirna Wyciszenie może się rozprzestrzeniać poza miejsce infekcji wirusowej dzięki aktywności RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) i biogenezie 2-rzędowych sirna. DCL 2-rzędowy sirna 30

31 Efekt wyciszenia jest wzmacniany przez amplifikację sirna 1 sirna 1 sirna 2 sirna 2 sirna 31 Ghildiyal & Zamore (2009) Nat Rev Genet