Dr Marek Daniel Koter / dr hab. Marcin Filipecki

Transkrypt

1 Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie Międzywydziałowe Studium Biotechnologii Katedra Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin Dr Marek Daniel Koter / dr hab. Marcin Filipecki

2 Struktura RNA wirusa HIV, fot. HO Reuters

3

4

5

6 Szlaki biogenezy mirna u zwierząt (A) i roślin (B) Tingting Du, and Phillip D. Zamore Development 2005;132:

7 Badacze biogenezy Białka Pierwsze Protein First Theory Świat RNA RNA World Walter Gilbert 1986 Czy cząsteczki będące budulcem białek i RNA były obecne w tzw. praocenie? W doświadczeniach symulujących warunki panujące na Ziemi przed 4 mld lat można zsyntetyzować: prawie wszystkie aminokwasy z wyjątkiem zasadowych 4 zasady azotowe, ale nie można uzyskać rybozy, a więc też rybonukleotydów

8 Thomas Cech odkrył, że w RNA wycinanie intronów zachodzi samoczynnie, co oznacza że proces jest autokatalityczny i przebiega bez udziału białek. Nazwa snrnp Rybozymy typu hammerbead lub hairpin snornp Guide RNA Telomeraza strna (small temporal) sirna (small interfering) Aktywność Małe jądrowe rybonukleoproteiny, biorą udział w splicingu pre-mrna; Fragmenty wirusoidowych RNA, rozcinają konkatamery replikacyjne RNA na pojedyncze cząsteczki; Małe jąderkowe rybonukleoproteiny, w dojrzewaniu jądrowych pre-rrna; Procesy redagowania RNA; Rybonukleoproteina odpowiedzialna za dobudowywanie końców chromosomów; Regulują ekspresję na poziomie translacji; Regulują ekspresję na poziomie mrna;

9 mrna Ang. messenger RNA, koduje białka rrna rybosomalny RNA, tworzy strukturalną podstawę rybosomów, katalizuje tworzenie wiązania peptydowego trna transferowy RNA, cząsteczka adaptorowa, podczas syntezy białka łączy aminokwasy z mrna snrna Skrót od small nuclear RNA (drobne jądrowe RNA) uczestniczy w różnorakich procesach w obrębie jądra komórkowego np. w procesie wycinania intronów z prekursora mrna. snorna Skrót od small nucleolar RNA (drobne jąderkowe RNA) uczestniczy w obróbce i chemicznej modyfikacji rrna. mirna Mikro RNA. Reguluje ekspresję genów zwykle poprzez blokowanie translacji wybranych cząsteczek mrna. sirna Skrót od small interfering RNA (drobne interferujące cząsteczki RNA) wyłączają ekspresję genów poprzez kierowanie do degradacji wybranych cząsteczek mrna lub poprzez indukowanie gęsto upakowanej struktury chromatyny w obrebie wybranych genów. Figure 1.12 Genomes 3 ( Garland Science 2007)

10 Polimeraza RNA Polimeraza RNA 1. Polimeraza RNA I 2. Polimeraza RNA II 3. Polimeraza RNA III A. Polimeraza mt B. Polimeraza cp Procariota Wszystkie geny Eucariota Transkrybowane geny 1. Geny kodujące 28S, 58S, 18S rrna; 2. Geny kodujące białka; 3. Geny kodujące trna, 55 rrna, U6 (snrna), sno RNA i scrna (małe cytoplazmatyczne RNA; A. Geny mitochondrialne; B. Geny chloroplastowe;

11 Rycina ze zbioru prof. K. Staronia

12 Nagroda Nobla w dziedzinie chemii 2009 rok Venkatraman Ramakrishnan Thomas A. Steitz Ada E. Yonath Rycina ze zbioru prof. K. Staronia

13 Metoda fenolowa Gotowy reagent Metoda TRIzolowa Gotowy reagent Concert RNA plant Reagent? Β-merkaptoetanol + azydek sodu Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction

14 Znajdują się nie tylko w komórkach poddawanych lizie ale wszędzie w otoczeniu; Brak prostych metod inaktywacji; Zdolność do hydrolizowania wiązań diestrowych pomiędzy zasadami azotowymi i cząsteczkami cukru; Wewnętrzne mostki dwusiarczkowe; Nie wymagają dwuwartościowych kationów do aktywności;

15 Dwa najczęstsze źródła RNAz: Skażone bufory - podejrzane roztwory wyrzucać (nie autoklawować); Pipety automatyczne (tipsy, aerozole, wyrzutnik najlepiej oddzielny zestaw); Nie przeceniać mocy rękawiczek (dotykanie brody, włosów, skóry, długopisu, lodówki niweczy ich skuteczność); Oddzielny sprzęt umyty, odtłuszczony, wysterylizowany 3% H 2 O 2 lub 0,5M NaOH i opłukany wodą traktowaną DEPC; Szkło najlepiej prażyć w 300 C przez 4 godz.; Tipsy i probówki od wiarygodnych partnerów autoklawowane 121 C 17 minut x2; Małe porcje buforów; Operacje na RNA z użyciem inhibitorów RNaz;

16 INHIBITORY RNaz Dietylopirowęglan (DEPC) silny środek alkilujący (działa na białka, RNA i niektóre składniki buforów np. Tris); Wanadowe kompleksy rybonukleozydów analogi rybonukleaz w stanie przejściowym wiążące się w centra aktywne większości RNaz. Białkowe inhibitory Rnaz ; Sole chaotropowe: np. izotiocyjanian guanidyny lub chlorek guanidyny niszczą 2-rzędową strukturę białek; preparaty komercyjne;

17

18 startery oligo(dt)

19 Odwrotna transkryptaza polimeraza DNA syntetyzująca nić DNA (cdna) na matrycy RNA. Odkryta w 1970 roku. Odwrotna transkryptaza nie posiada właściwości naprawczych, co prowadzi do znacznej zmienności powstających sekwencji DNA. Dogmat o jednokierunkowym przekazie informacji: DNA RNA proteiny AMV avian myeloblastosis virus RT; zachowuje aktywność do 55 C; eliminuje problemy związane ze strukturą II-rzędową; częstotliwość błędu: 1 na par zasad (wg. Promega) Mo-MLV Moloney strain of murine leukemia virus RT; posiada szczątkową aktywność RNazyH (w porównaniu z AMV-RT); lepsza do syntezy pełnej długości cząsteczek cdna (do 5 kpz); częstotliwość błędu: 1 na par zasad (wg. Promega)

20 Między innymi: RT-PCR; technika wydłużania startera ("primer extension"); qrt-pcr (Real-Time PCR); RACE (rapid amplification of cdna ends); (

21 Oligo-dT-adaptor primer RNase H

22 Oligo-dT-adaptor primer

23 RNA-Seq (Hoffman, 2009)