Prof. dr.hab. Andrzej Kaczanowski Instytut Zoologii Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego

Transkrypt

1 1 Prof. dr.hab. Andrzej Kaczanowski Instytut Zoologii Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Recenzja rozprawy doktorskiej Pani mgr. Julity Gruchoty p.t. Proces rearanżacji genomu Paramecium tetraurelia jako model do badania udziału czynników elongacji transkrypcji w syntezie niekodujących RNA Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska P. mgr. Julity Gruchoty zawiera dwie wielo autorskie opublikowane już prace: (1) : J. Gruchota, CD Wilkes, O. Arnaiz, L. Sperling, JK Nowak : A meiosis specific Spt15 homolog involoved in non coding transcription. Nucleic Acid Research (Impact.factor = 10,1 ) 45: (2) oraz K. Maliszewska- Olejniczak,. J. Gruchota, R. Gromadka C.D Wilkes, O Arnaiz, N Matthy, S Duharcout, JK Nowak 2015 TIIS-dependent non-coding transcription regulates developmental genome rearrangements PLOS Genetics (impact factor = 6.1) Doi Pani mgr Julita Gruchota jest głównym wykonawcą wszystkich doświadczeń i głównym autorem w pierwszej z tych prac, oraz ma bardzo znaczący wkład w drugiej z nich. Publikacje te są wynikiem wieloletniej i bardzo owocnej pracy zespołowej w IBB PAN (obecnie w zespole kierowanym przez dr. hab. Jacka Nowaka) i współ pracy instytutu z laboratoriami francuskimi, wiodącymi w dziedzinie molekularnej genetyki Paramecium. Do wyżej wymienionych prac Pani.mgr Julita Gruchota dołączyła streszczenie, wstęp, dyskusje i wnioski w języku polskim. Warto przypomnieć, że IBB PAN miał znaczący udział w realizacji projektu badania genomu Paramecium, co zapoczątkowało wyżej wymienioną współpracę i udział Instytutu w następnych wspólnych projektach. badawczych. Pani mgr. Julita Gruchota umieściła na początku swojej pracy następujące motto: The truth however is, that the Protista are very small but they are not very simple CC Dobell.

2 2 Jest ono bardzo celne wobec niezwykle skomplikowanych mechanizmów związanych z nieznanymi do niedawna funkcjami nie kodujących RNA, które tłumaczą większość niezrozumiałych poprzednio zjawisk dotyczących genetyki i epigenetyki orzęsków. Paramecium zawiera dwa rodzaje jąder: generatywne mikronukleusy które podlegają mitozie podczas podziałów komórki, oraz mejozie w czasie procesu płciowego. Makronukleusy podlegają podziałowi amitotycznemu ponieważ zawierają acentromeryczne minichromosomy, z których każdy jest powielony około 800 razy. Nowe makronukleusy powstają podczas procesu płciowego z jąder, które są produktami jąder zygotycznych, a poprzedni stary makronukleus ulega degradacji. Powstawanie nowych makronukleusów związane jest z cięciem chromosomów mitotycznych, oraz z wycinaniem wewnątrz genowych sekwencji zwanych IES (od słów internaly eliminated sequemces). Ich wycinanie jest warunkiem skutecznej trankrypcji mrna i translacji kodowanych białek. Oprócz sekwencji IES w trakcie rozwoju makronukleusa wycinane są także między genowe odcinki DNA, które zawierają między innymi sekwencje homologiczne do znanych transpozonów typu Mariner. Mikronuklearny genom Paramecium (a więc genom jądra generatywnego i jądra zygotycznego ma wielkość 88 MB, a genom makronuklearny jedynie 76MB po czym ulega amplifikacji około 800x. Sekwencje IES sumarycznie zawierają około 3,5MB, a usuwane sekwencje międzygenowe około 8,5 MB. Wszystkie sekwencje usuwane podczas rozwoju nowego makronukleusa są wycinanne przez transpozazę Piggy Mac, która jest homologiem transpozazy Piggy Bac występującej w Baccilovirus. Transpozaza ta jest adresowana docelowo do wycinanych sekwencji przez małe homologiczne do nich 25 nt cząsteczki RNA. Wycinanie nie kodujących DNA związane jest z transkrypcją obu nici całego genomu mikronuklearnego, która zachodzi jedynie podczas procesu płciowego (koniugacji, lub autogamii). Następnie zachodzi cięcie dwu niciowych transkryptów z udziałem białek typu dicer na 25 nt RNA i ich i skanowanie. W procesie

3 3 skanowania usuwane są te małe RNA, które są homologiczne do sekwencji DNA starego makronukleusa. Pozostałe 25nt cząsteczki RNA (scnrna, czyli skanujące RNA) są transportowane do nowych makronukleusów i rekrutują transpozazę PiggyMac do tych odcinków DNA, które nie występują w starym makronukleusie w tym sekwencje IES. Dzięki temu każdy fragment DNA usunięty z makronukleusa w poprzednim pokoleniu zostaje usunięty także w następnym. pokoleniu. W ten sposób genom zostaje zabezpieczony przed wprowadzaneim do niego jakichkolwiek nowych sekwencji w wyniku szeroko pojętego transferu horyzontalnego w myśl zasady, że coś co zostało wprowadzone do jądra generatywnego ale czego nie ma w starym makronukleusie zostanie usunięte z nowego makronukleusa. Wydaje się, że Paramecium jest szczególnie podatne na horyzontalny transfer genów w tym transpozonów, ponieważ odżywia się na drodze fagocytozy bakterii, które niekiedy wydostają się z wodniczek trawiennych na teren cytoplazmy i prawdopodobnie mogą stanowić źródło transferów horyzontalnych. Mechanizm wycinania sekwencji specyficznych dla mikronukleusa może być więc postrzegany jako sposób kontroli genomu, skierowany przeciwko ewentualnym pasożytom genomowym. Dotychczasowe badania genomu P. tetraurelia wykazały, że gatunki z rodzaju Paramecium przeszły trzy razy duplikacje całego genomu i w ich wyniku zawierają funkcjonalne paralogi wielu genów. Paralogi te mogą podlegać zróznicowaniu swoich funkcji. Procesy skanowania genomu Paramecium i usuwania z niego sekwencji IES wymaga tarnskrypcji całych genomów zarówno w mikronukleusie jak i w starym makronukleusie, co prowadzi do powstawania zarówno długich jak i krótkich nie kodujących transkryptów RNA. Dlatego można było się spodziewać, że efektywność tych procesów zależy od obecności białek które są czynnikami elongacji transkrypcji. RNA i dla tego Pani. mgr Julita Gruchota badała występowanie paralogów genów SPT5 i TFII 4S, które u kodują czynniki elongacji

4 4 transkrypcji RNA w innych organizmach (czynnik SPT5 występuje we wszystkich organizmach żywych). W przedstawionych pracach przeprowadzano wyciszanie rozpoznanych paralogów genów SPT5 i TFIIS4. W obu przypadkach wykazano występowanie paralogów specyficznych jedynie dla procesu płciowego, których wyciszenie skutkowało brakiem przeżywalności autogamontów, ale nie hamowało podziałów somatycznych, oraz paralogów które odwrotnie hamowaly wzrost somatyczny ale nie miały wpływu na przebieg procesu płciowego. Następnie wykazano lokalizację białek Spt5 w jądrach mejotycznych produktach mejozy i nowych makronukleusa, oraz białka TFIIS głownie w nowych makronukleusach stosując odpowiednie konstrukty kodujące białka fuzyjne z GFP. Zgodnie z lokalizacją Spt5m w jądrach mejotycznych wyciszenie genu SPT5, hamowało wycinanie niemal wszystkich IES ów i pozostałych sekwencji specyficznych dla mikronukleusa (mic specific) podobnie jak wyciszenie genu PIGGY MAC. W drugiej z przedstawionych prac wykazano, że w okresie rozwoju nowych makronukleusów transkrybowany jest ich genom zanim następuje wycinanie mic-specyficznych fragmentów DNA. W ten sposób podczas póżnej fazy autogamii powstają długie IES+ transkrypty zawierające transkrybowane odcinki IES. Wg. przedstawionego modelu te długie transkrypty hybrydyzują z krótkimi homologicznymi sekwencjami scn RNA i kompleksy te oddziaływują na DNA ułatwiając wycinanie IES ów. Wykazano również transkrypcje sekwencji IES która zachodzi już po ich wycięciu w póżnej fazie autogamii, co prowadzi do powstawania transkryptów nt. Okazało się jednak że jedynie wycinanie spośród wszystkich IES-ów wymaga białka TfIIS4. Uzyskano pełne i bardzo dokładne dane dotyczące jego wpływu na wycinanie sekwencji IES w stosunku do całego genomu, co było możliwe dzięki temu, że uzyskano czystą frakcję nowych makronukleusów, W pracy tej wykazano również, że wyciszenie genu EZL1 który koduje trójmetylaze lizyny w

5 /45000 przypadków powoduje retencje IES. Trójmetylacja 9 i 27 lizyny w histonie H3 zmienia konformacje chromatyny (powstanie heterochromatyny), która jest warunkiem wycicięcia danego IES. Pani mgr Julita Gruchota w swojej pracy stosowała m. innymi nastepujące metody izolacje frakcji rozwijajacyh się makronukleusów, wielko skalowe sekwencjonowania, badanie ekspresji genów przy pomocy mikromacierzy, konstrukty które indukowały powstawanie w komórce Paramecium białek fuzyjnych zawierających GFP w celu lokalizacji ich występowania w określonych kompartmentach komórkowych i w określonych stadiach koniugacji a także metody bioinformatycznej obróbki danych i poszukiwanie in silico paralogów badanych genów, korzystając z pomocy bioinformatykow. Znajomósć tak wielu i tak zaawansowanych technik zasługuje na uznanie. Na uznanie zasługuje także fakt, że przedstawione wyniki zostały już opublikowane w prestiżowych czasopismach. Z drugiej strony wykonanie przedstawionych badań wymagało udziału w ich wykonaniu wielu badaczy. a także współpracy z laboratoriami francuskimi. Dlatego bardzo ważną częścią przedstawionej mi do oceny pracy są wstęp i omówienie w wyników opublikowanych prac, które wskazują na to, że P. mgr Julita Gruchota doskonale rozumie ich znaczenie dla głównego nurtu badań nad nie kodującymi cząsteczkami RNA i ich perspektywę. Jako czytelnikowi tego tekstu brakowało mi jedynie wyjaśnienia pochodzenia tanspozazy Piggy Mac i jej nazwy. Sądzę, że uwaga ta mogłaby być przydatna gdyby autorka chciała opublikować jakiś artykuł popularyzujący genetykę i epigenetykę Paramecium. Na koniec mam trzy pytania dotyczące wyników doktorantki i jej współpracowników 1. Autorzy prac wyciszali geny : SPT5m, TFIIS4, oraz PGM, a nastepnie badali wpływ tego wyciszania na retencje sekwencji IES w wielko skalowych eksperymentach co stanowi samo w sobie ogromną wartość obu prac. Autorzy podawali wskaźnik retencji IES oznaczany jako RS. Wartość 0 oznaczała jej brak a wartość 1 zatrzymanie wycinania danego IES we

6 6 wszystkich przypadkach. Jak należy interpretować ułamkowe wartości tego wskaźnika? Czy odnoszą się one jedynie do danego momentu wykonania doświadczenia? Wówczas wskaźnik ułamkowy mógłby oznaczać jedynie opóżnienie w wycinaniu danego IES. Czy też wskażnik RS oznacza prawdopodobieństwo wycięcia danego IES bez względu na czas? 2. Skoro genom Paramecium jest amplifikowany aż 800 razy zachodzi pytanie czy wycinanie sekwencji IES zachodzi wyłącznie zanim rozpoczyna się proces amplifikacji, czy już w trakcie początkowej fazy tej amplifikacji? 3. Powstawanie scnrna w czasie autogamii wymaga cięcia długich dwu niciowych transkryptów RNA w czasie autogamii, a więc obecności białek typu dicer. W pracy Lhuillier-Akakpo M. et al, Plos Genetics wykazanpo że znane białka dicer-like wystepujące u Paramecium: Dcl2/3 i Dcl5 wprawdzie są konieczne dla usuwania wszystkich wycinanych między genowych fragmentów DNA (w tym sekwencji homologicznych do znanych transpozonów), ale nieoczekiwanie okazało się, że wycinanie tylko niewielkiej cześci IESów zależy od znanych białek typu dicer. Autorzy wyżej wymienionej pracy sądzili, że wycinanie najmniejszych IES nie wymaga scnrna. Z drugiej strony doktorantka wraz z jej współautorami wykazali, że wycinanie niemal wszystkich IES wymaga aktywności genu SPT5m, a więc zapewne także zależnych od niego scnrna. Zachodzi więc pytanie czy w genomie Paramecium występują nie rozpoznane jeszcze inne geny kodujące białko(a) typu dicer? W dyskusji autorka sugeruje jednak że pewne srna mogą powstawać bez udziału białka dicer. Czy możliwa jest bezpośrednia transkrypcja krótkich cząsteczek RNA, które od razu stają się scn RNA i nie wymagają ich cięcia? A może białko Spt5 nie tylko wzmacnia transkrypcje RNA w okresie mejozy, ale także pełni inne nie rozpoznane jeszcze funkcje?

7 7 Chociaż powyższe pytania wiążą się z tematyką pracy doktorskiej Pani mgr Julity Gruchoty odpowiedzi na nie wykraczają poza zakres przedstawionej mi do oceny pracy i prawdopodobnie wymagają dalszych badań. W konkluzji stwierdzam, że rozprawa doktorska Pani mgr Julity Gruchoty spełnia wszystkie warunki stawiane pracom doktorskim i wnoszę o Jej dopuszczenie do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto uważam, że doktorantka w trakcie wykonywania pracy doktorskiej wykazała się dużą dojrzałością do samodzielnej pracy naukowej, ogromną pracowitością i uzyskała bardzo ciekawe wyniki. Uważam, że przedstawiona mi do oceny praca doktorska Pani mgr. Julity Gruchoty stanowi ważny etap badań nad mechanizmami rearanżacji DNA u Paramecium i roli różnych rodzajów nie kodującego RNA w tym procesie. Stawiam więc wniosek o jej wyróżnienie przyznaniem stosownej nagrody. Andrzej Kaczanowski