2. Wykazywanie obecności bakterii nitryfikacyjnych w glebie

Transkrypt

1 METABOLIZM BAKTERII 1. Określanie typu pokarmowego Posiew i badanie wzrostu na: podłożu AB podłoże mineralne, zawiera sól A (Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4 ), sól B (NH 4 Cl, MgSO 4, Na 2 S 2 O 3 ), czerwień fenolową (wskaźnik ph), sól Tuovinena (zestaw mikroelementów), agaroid (agar + woda) podłożu AO agar odżywczy, zawiera agar, wodę, NaCl, pepton, ekstrakt drożdżowy, wyciąg mięsny. Chemolitoautotrofy rosną na podłożu AB. Energię mogą czerpać z utleniania S 2 O 3 2- do SO W efekcie dochodzi do zakwaszenia podłoża i zmiany jego barwy z czerwonej na żółtą. Przykład: Halothiobacillus neapolitanus. Warunkowe chemolitoautotrofy rosną na obu podłożach, przy czym wykazują lepszy wzrost na podłożu AO, a to ze względu na obecność gotowych związków organicznych, czynników wzrostowych i braku konieczności wydatku energetycznego na wiązanie CO 2. Przykład: Paracoccus versutus. Chemoorganoheterotrofy rosną na podłożu AO. Uwaga: należy pamiętać, że aby przesądzić o bezwzględności bądź warunkowości typu pokarmowego, trzeba powtarzać badania na różnych podłożach mineralnych i organicznych (np. gatunek bakterii chemoorganoheterotroficznej może okazać się warunkowym chemolitoautotrofem na podłożu z odpowiednim dla niego związkiem, który mógłby utlenić, a z drugiej strony nie wszystkie chemoorganoheterotrofy rosną na podłożu AO, np. Caulobacter). 2. Wykazywanie obecności bakterii nitryfikacyjnych w glebie Próbkę badanej gleby wprowadzamy do probówki z płynnym podłożem dla nitryfikatorów, zawierającym wodę wodociągową, CaCO 3 (jako bufor i 'nośnik' dla rozwijających się bakterii),(nh 4 ) 2 SO 4, MgSO 4, FeSO 4, K 2 HPO 4 i NaCl. Po inkubacji (1-2 tyg., temp. pok.) sprawdzamy obecność azotynów w próbie przy pomocy odpowiedniego odczynnika (np. firmy Merck). Pojawienie się różowego zabarwienia świadczy o obecności azotynów w hodowli, a więc także bakterii nitryfikacyjnej w badanej glebie. Nitryfikatory jako chemolitoautotrofy czerpią energię z utleniania: - nitrozobakterie: amoniaku do azotynów (dwuetapowo, posiadają monooksygenazę amoniakową i oksydoreduktazę hydroksyloaminową). - nitrobakterie: azotynów do azotanów (jednoetapowo, posiadają oksydoreduktazę azotynową) Bakterie nitryfikacyjne nie tworzą kolonii. 3. Badanie zdolności chemoorganoheterotrofów do wykorzystywania różnych źródeł węgla 1

2 Związki drobnocząsteczkowe (konieczność posiadania odpowiednich systemów ich transportu do wnętrza komórki i enzymów je hydrolizujących): 3.1. Laktoza Wykonujemy posiew na podłożu EMB (zawierającym agar odżywczy, eozynę, błękit metylenowy) z laktozą, inkubujemy w 37 C. Kolonie bakterii wykorzystujących laktozę (zakwaszenie podłoża) są fioletowe z metalicznym połyskiem. Kolonie bakterii niezdolnych do zużycia cukru, wykorzystujących jako źródło węgla aminokwasy z peptonu (alkalizacja podłoża) są różowe. Przykład bakterii zużywającej laktozę: Escherichia coli. Związki wielkocząsteczkowe (konieczność posiadania hydrolizujących je ektoenzymów): 3.2. Skrobia Wykonujemy posiew na podłoże agar odżywczy ze skrobią. Po inkubacji zalewamy płytkę płynem Lugola. Brak fioletowego zabarwienia wokół strefy wzrostu bakterii świadczy o jej zdolności do hydrolizy skrobi. Przykład: Bacillus subtilis Tłuszcz Wykonujemy posiew na podłoże agar odżywczy z tłuszczem (upłynniony agar łączony z wrzącą margaryną). Po inkubacji zalewamy płytkę 20% roztworem CuSO 4. Pojawienie się szmaragdowego zabarwienia wokół linii wzrostu świadczy o zdolności bakterii do hydrolizy tłuszczu. Przykład: Pseudomonas fluorescens Kazeina z mleka Wykonujemy posiew na podłoże agar odżywczy z mlekiem (jałowe, odtłuszczone). Przejrzyste strefy wokół linii wzrostu bakterii świadczą o ich zdolności do hydrolizy kazeiny. Przykład: Bacillus subtilis Żelatyna Wykonujemy posiew na słupek z żelatyną odżywczą (woda, żelatyna, pepton). Upłynnienie żelatyny w górnej warstwie słupka świadczy o zdolności bakterii do jej hydrolizy. Przykład: Bacillus subtilis. 4. Prototrofia i auksotrofia Wykonujemy posiew i badamy wzrost na: podłożu Davisa dla prototrofa zawiera sól Davisa (K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, (NH 4 ) 2 SO 4, MgSO 4, cytrynian sodu), glukozę i agaroid podłożu Davisa dla auksotrofa podłoże jak dla prototrofa, uzupełnione hydrolizatem kazeiny (aminokwasy) i odpowiednimi innymi czynnikami wzrostowymi. Prototrofy zdolne są do wzrostu na podłożu bez czynników wzrostowych, wystarcza im proste źródło węgla (tu: glukoza) i sole mineralne. Przykłady: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens. 2

3 Auksotrofy wymagają do wzrostu czynników wzrostowych, np. aminokwasów, witamin, zasad azotowych etc. Przykłady: Proteus vulgaris, Enterococcus faecalis, Haemophilus influenzae, bakterie mlekowe, mutanty prototrofów. 5. Izolowanie z gleby bakterii wiążących azot cząsteczkowy Używamy podłoża bezazotowego (woda, mannitol, K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, MgSO 4, NaCl, CaCO 3, ślady MnSO 4, FeCl 2, Na 2 MoO 4 ) w kolbie i w zamykanej szczelnie probówce (z dodatkiem sacharozy!). Zaszczepiamy pożywki glebą. Kolba: obserwujemy wzrost Azotobacter sp. w postaci kożucha na powierzchni pożywki. Bakteria wiąże azot i fermentuje mannitol, jest chemoorganoheterotroficznym tlenowcem. Rośnie jako dwoinka w otoczce. Można ją obserwować przeżyciowo (cysty silnie załamują światło) lub w preparacie tuszowym dobarwionym błękitem metylenowym (widać otoczkę). Probówka: obserwujemy odrywające się z dna pęcherzyki gazu, wyczuwamy zapach kwasu masłowego świadczy to o wzroście Clostridium pasteurianum. Bakteria wiąże azot, wykorzystuje sacharozę, przeprowadza fermentację (ale nie fermentuje mannitolu!), jest chemoorganoheterotroficznym beztlenowcem. Można ją obserwować po zmieszaniu kropli hodowli z płynem Lugola (na fioletowo wybarwia się materiał zapasowy granuloza). 6. Wykorzystanie różnych źródeł azotu Badamy wzrost bakterii na pożywkach zawierających różne źródła azotu, np. NH 4 Cl, KNO 3, hydrolizat kazeiny (aminokwasy). Podstawą pożywek w każdym przypadku jest podłoże Davisa, składające się z bezazotowych soli Davisa, glukozy i agaroidu. Jony NH 4 + są najlepiej przyswajalnym źródłem azotu. Do wykorzystania jonów NO 3 - konieczne jest posiadanie przez bakterię reduktazy azotanowej asymilacyjnej. Przykłady: Paracoccus versutus, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis. Aminokwasy mogą być źródłem azotu m.in. dla: Paracoccus versutus, Pseudomonas fluorescens, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Pseudomonas stutzeri. Uwaga: E. coli nie jest zdolna do wykorzystania NO 3 - jako źródła azotu brak reduktazy azotanowej asymilacyjnej! 7. Określanie stosunku bakterii do tlenu Obserwujemy wzrost bakterii w hodowli płynnej (bulion odżywczy): na niskim słupie dla tlenowców na wysokim słupie dla beztlenowców: bulion zagęszczony glukozą, zagrzany i szybko ostudzony, zalany jałową parafiną (ograniczenie dostępu tlenu) Inkubację prowadzimy w 37 C. 3

4 Tlenowce wykazują wzrost na niskim słupie. Niektóre tlenowce warunkowe rosną na obu podłożach, przy czym ich wzrost jest intensywniejszy na niskim słupie. Przykłady: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Serratia marcescens (charakterystyczne czerwone zabarwienie hodowli barwnik prodigiozyna wytwarzany tylko w warunkach tlenowych) Beztlenowce rosną na wysokim słupie. Jeżeli wykazują aerotolerancyjność, mogą rosnąć także (słabiej) na niskim słupie. Przykład: Enterococcus faecalis. 8. Badanie obecności katalazy Katalaza chroni tlenowce przed szkodliwym działaniem nadtlenku wodoru, powstającego ubocznie w procesie oddychania tlenowego. O jej obecności świadczy wydzielanie się pęcherzyków gazu (tlenu) po zalaniu hodowli tlenowców na płytkach wodą utlenioną. Beztlenowce, jak Enterococcus faecalis, nie wytwarzają katalazy. 9. Oddychanie azotanowe i denitryfikacja Wykonujemy posiew na podłoże płynne słup bulionu odżywczego z dodatkiem KNO 3. W probówkach umieszczamy rurki Durhama. Po inkubacji sprawdzamy obecność gazu w rurce i obecność azotynów za pomocą odpowiedniego odczynnika (np. firmy Merck). Obecność gazu i azotynów świadczy o tym, że bakteria jest zdolna do denitryfikacji (oddychania azotanowego z wytworzeniem produktów gazowych). Przykład: Pseudomonas stutzeri. Obecność azotynów bez obecności gazu wskazuje, że bakteria jest co prawda zdolna do oddychania azotanowego, ale nie redukuje azotynów do produktów gazowych, czyli nie jest denitryfikatorem. Przykłady: Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas fluorescens, Paracoccus versutus, Serratia marcescens. Wszystkie wymienione bakterie są warunkowymi tlenowcami. Brak gazu i azotynów wskazuje, że bakteria jest niezdolna do oddychania azotanowego. Przykład: Enterococcus faecalis. 10. Fermentacja i peptonizacja mleka Wykonujemy posiew do probówek zawierających odtłuszczone, jałowe mleko z lakmusem jako wskaźnikiem ph. Inkubujemy w 37 C, obserwujemy zmiany w podłożu. Jeżeli bakteria fermentuje laktozę z wytworzeniem gazu (np. E. coli), obserwujemy zaróżowienie podłoża (zakwaszenie), powstanie porozrywanego (przez gaz) skrzepu kwaśnego (kazeina wytrącona pod wpływem niskiego ph) oraz lekkie odbarwienie lakmusu w dolnej części słupa (warunki częściowo beztlenowe, lakmus jako końcowy akceptor elektronów). 4

5 Jeżeli bakteria fermentuje laktozę bez wytwarzania gazu (np. Enterococcus faecalis), obserwacje odpowiadają powyższym, poza porozrywaniem skrzepu otrzymujemy skrzep gładki. W przypadku E. faecalis odbarwienie lakmusu jest intensywne (bakteria beztlenowa). Jeżeli bakteria nie fermentuje laktozy, ale wykazuje zdolność do peptonizacji kazeiny (np. Bacillus subtilis), następuje zmiana barwy lakmusu na fioletowoniebieską (alkalizacja) oraz powstanie skrzepu słodkiego (kazeina wytrącona przez podpuszczkę) z tendencją do upłynniania się (bakteria wykorzystuje kazeinę). 11. Test redukcji błękitu metylenowego Test wykonywany w celu demonstracji intensywności procesu oddechowego. Używamy zwiększających się rozcieńczeń hodowli bulionowej E. coli, uzupełnionych błękitem metylenowym. W czasie inkubacji w 37 C obserwujemy odbarwienie błękitu, tym szybsze, im większa była zawartość hodowli, a więc również intensywność oddychania, w probówce (E. coli zdolna do wykorzystania błękitu metylenowego jako końcowego akceptora elektronów). Odbarwienie postępuje od dna probówki (mniej tlenu). Po wstrząśnięciu probówki następuje utlenienie błękitu, który odzyskuje swoją zwykłą barwę. 5