(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego:

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP (96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: (13) (51) T3 Int.Cl. C12N 1/14 ( ) Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: Europejski Biuletyn Patentowy 2011/41 EP B1 (54) Tytuł wynalazku: Podłoże hodowlane do otrzymywania grzybów nitkowatych (30) Pierwszeństwo: EP (43) Zgłoszenie ogłoszono: w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2006/43 (45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono: Wiadomości Urzędu Patentowego 2012/03 (73) Uprawniony z patentu: UREA CASALE S.A., Lugano-Besso, CH (72) Twórca(y) wynalazku: PL/EP T3 ELISABETH PANCHAUD-MIRABEL, Toulouse, FR (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Mirosława Ważyńska KANCELARIA PATENTOWA KULIKOWSKA & KULIKOWSKI SP.J. SKR. POCZT Warszawa Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).

2 21530/PE/11 EP B1 Opis Dziedzina wynalazku [0001] Wynalazek należy do dziedziny techniki obejmującej środki fitosanitarne. [0002] W szczególności, wynalazek dotyczy podłóż do hodowli grzybów nitkowatych (strzępkowych), w szczególności grzybów nicieniobójczych (Nematophagus). Stan techniki [0003] Coraz powszechniejsze staje się zastosowanie w praktyce mikroorganizmów, a w szczególności grzybów, jako środków fitosanitarnych. [0004] Obecnie wprowadza się do obrotu produkty oparte na grzybach do walki z owadami, grzybami fitopatogennymi i innymi pasożytami typowo występującymi w uprawach rolniczych. [0005] Na przykład, w patencie US opisano środki nicieniobójcze do zwalczania nicieni z rodzaju Meloidogyne, Hetherodera i Ditylenchus, składające się z poszczególnych szczepów grzybów nitkowatych: Arthrobotrys conoides Dreschsler. [0006] Wspomniane powyżej nicienie są odpowiedzialne za poważne choroby warzyw i grzybów i powodują ogromne straty gospodarcze, ponieważ narażone jest 50-70% zbiorów. [0007] Zastosowanie grzybów nicieniobójczych jako alternatywy dla tradycyjnych przeciwpasożytniczych środków chemicznych (na przykład dla bromku metylu, trichloronitrometanu, dichloropropenu, itp.) do stosowania na glebę przed uprawą

3 2 lub karbaminianów stosowanych bezpośrednio na uprawy, pozwala uniknąć poważnych problemów, takich jak sterylizacja gleby, zniszczenie równowagi ekologicznej i potencjalna toksyczność dla ludzi i zwierząt. [0008] Grzyby nicieniobójcze są więc szczególnie odpowiednie do stosowania w rolnictwie ekologicznym, jednakże ich stosowanie nadal związane jest z dość wysokimi kosztami, z powodu trudności występujących przy ich produkcji przemysłowej z dużą wydajnością. [0009] Zatem, istnieje potrzeba opracowania uzyskiwania tańszych grzybów nicieniobójczych, które będą dostępne do stosowania w rolnictwie. [0010] Bastos (Bastos CN, Summa Phytopathologica, tom 27, strony 73-77, listopad 2000 r.) zajmował się uprawą grzybów nicieniobójczych Trichoderma nov. sp. i zbadał tworzenie konidiów w różnych podłożach hodowlanych. [0011] Problemem będącym podstawą wynalazku było dostarczenie podłoża do hodowli grzybów nitkowatych a w szczególności grzybów nicieniobójczych, które umożliwia produkcję tych mikroorganizmów na skalę przemysłową z dużą wydajnością i w krótkim czasie, co w konsekwencji doprowadzi do obniżenia kosztów wytworzenia produktu końcowego. Streszczenie wynalazku [0012] Opisany problem został rozwiązany zgodnie z wynalazkiem, którego przedmiotem jest podłoże hodowlane do hodowli grzybów nitkowatych zawierające [0013] 60-65% melasy, 10-15% sacharozy, 10-15% namoku kukurydzianego i 10-15% ekstraktu drożdżowego. Korzystnie,

4 3 takie podłoże zawiera dodatkowo 5 do 8% źródła azotu mineralnego, w szczególności wodorofosforanu diamonu. Szczegółowy opis wynalazku [0014] Wynalazek będzie bliżej opisany w odniesieniu do niektórych przykładów wykonania, które zostały przedstawione w celu zilustrowania wynalazku, lecz nie ograniczają jego zakresu. [0015] Przed przystąpieniem do ilustracji wynalazku na podstawie przykładów, uważamy, że warto podać kilka szczegółów technicznych dotyczących składników podłoża według wynalazku. [0016] Melasa i sacharoza są używane jako źródło węgla. [0017] Melasa stanowi produkt uboczny przemysłu cukrowniczego i ma postać czarno-brunatnej lepkiej cieczy zawierającej 10% wody, 35% sacharozy, 20% innych cukrów i 15% popiołu. [0018] Ekstrakt drożdżowy i namok kukurydziany są używane jako źródło organicznego azotu. [0019] Ekstrakt drożdżowy jest otrzymywany w wyniku autolizy Saccharomyces cerevisiae i ma postać drobnego bladożółtego proszku, łatwo rozpuszczalnego w wodzie. Ekstrakt drożdżowy zawiera peptydy, wolne aminokwasy, zasady purynowe i pirymidynowe, jak również rozpuszczalne w wodzie witaminy z grupy B. W ekstrakcie drożdżowym całkowita zawartość azotu wynosi 10% a azotu α-amonowego wynosi 5%. [0020] Namok kukurydziany jest uzyskiwany poprzez moczenie ziaren kukurydzy w temperaturze 50 C przez godzin w wodzie zawierającej dwutlenek siarki. Odczynnik ten umożliwia zniszczenie białkowej sieci otaczającej ziarna skrobi i zapewnia dodatkową korzyść polegającą na zapobieganiu

5 4 rozwojowi niepożądanych mikroorganizmów podczas maceracji. Całkowita zawartość azotu w namoku kukurydzianym wynosi 7%, azotu α-amonowego 1,7%, namok zawiera także 5% cukrów, 4% potasu, 3% fosforu i 17% różnych minerałów. [0021] Przetestowano różne podłoża hodowlane oparte na wymienionych powyżej źródłach węgla i azotu. [0022] Zawartość procentowa źródła azotu organicznego w podłożu według wynalazku może być zmniejszona, w wyniku zamiany części źródła azotu organicznego na źródło azotu nieorganicznego (azotany amonu lub inne związki), które dodaje się stopniowo w małych ilościach podczas hodowli. [0023] Ten dodatek nieorganicznego azotu podczas hodowli pozwala na lepsze odżywienie drobnoustrojów oraz, w przypadku grzybów nitkowatych, wzmocnienie strzępek grzybni. [0024] Zamiana części źródła azotu organicznego na źródło azotu nieorganicznego ma również tę zaletę, że obniża koszty produkcji, gdyż źródła azotu organicznego (ekstrakt drożdżowy i namok kukurydziany) stanowią najdroższe składniki podłoża według wynalazku. [0025] Podłoże według wynalazku jest szczególnie odpowiednie do stosowania w produkcji grzybów nitkowatych z rodziny Moniliales. W szczególności, w przykładach wskazanych poniżej stosowano grzyby nitkowate Arthrobotrys conoides Dreschsler. PRZYKŁAD 1 [0026] Hodowlę grzybów nitkowatych przeprowadzono w kolbie Erlenmeyera o pojemności 300 ml, zawierającej 150 ml podłoża hodowlanego. [0027] Podłoże składało się z 25 g/l melasy, 5 g/l sacharozy, 5 g/l namoku kukurydzianego i 5 g/l ekstraktu drożdżowego, a

6 5 podłoże to sterylizowano przed wysiewem konidiów badanych grzybów. [0028] Hodowle inkubowano w temperaturze około 27 C przez 6 dni od momentu wysiewu. [0029] Począwszy od trzeciego dnia hodowli, w celu ustalenia suchej masy (g/l) i liczby diaspor (zarodników) (CFU/l), pobierano próbki podłoża. W celu określenia suchej masy, 20 ml pożywki filtrowano, a następnie suszono w piecu w temperaturze 100 C przez 24 godziny. Liczbę diaspor wyznaczano na 1 ml podłoża. [0030] Podsumowanie uzyskanych wyników przedstawiono w tabeli 3, poniżej. Tabela 3 Dzień ph Sucha masa (g/l) CFU/l 0 5,07 0 0,00 3 4,87 1,58 3, ,20 3,82 1, ,46 6,76 1, ,98 9,995 3, PRZYKŁAD 2 [0031] Test przeprowadzony w przykładzie 1 powtórzono w 2 litrowym mini-reaktorze, jak opisano w przykładzie 2, zawierającym 1,2 litra pożywki takiej jak w przykładzie 1. Warunki doświadczalne były takie same jak w przykładzie 1, z tą tylko różnicą, że pobieranie próbek rozpoczęto dzień po wysianiu zarodników. [0032] Podsumowanie uzyskanych wyników przedstawiono w tabeli 1, poniżej.

7 6 Tabela 1 Dzień ph Sucha masa (g/l) CFU/l 0 5,07 0 0,00 1 5,04 2,675 9, ,01 3,9 3, ,44 5,125 5, ,11 8,295 8, ,69 2,75 1, ,32 3,485 2, ,65 10,164 3, [0033] Wyniki przedstawione dla kolejnych dni po dniu piątym mogą wydawać się nietypowe, lecz wynikają one tylko z nadmiernej koncentracji grzybów w podłożu, co uniemożliwia na pobranie jednorodnych próbek. [0034] Ostatnią próbkę pobrano bezpośrednio z reaktora. [0035] W tym przypadku uzyskano w ciągu siedmiu dni ponad 10 gramów grzybni na litr pożywki hodowlanej, przy zawartości diaspor (zarodników) 3, PRZYKŁAD 7 [0036] Podłoża hodowlane z przykładu 1 zostało następująco zmodyfikowane, aby zmniejszyć zawartość dwóch źródeł azotu organicznego, które stanowią najbardziej kosztowne składniki: 25 g/l melasy; 5 g/l sacharozy; 2,5 g/l namoku kukurydzianego; 2,5 g/l ekstraktu drożdżowego.

8 7 [0037] Stosując taką pożywkę hodowlaną przeprowadzono hodowlę testową (A), porównując ją z dwoma innymi hodowlami testowymi (B i C), które prowadzono na tym samym podłożu hodowlanym, do którego - począwszy od czwartego dnia hodowli - kolejnymi porcjami dodawano źródło azotu mineralnego. [0038] W hodowli testowej B dodano trzykrotnie 0,21 g wodorofosforanu diamonu od czwartego dnia (dokładniej w dniu czwartym, szóstym i ósmym), w sumie dodano 0,63 g, a w hodowli testowej C dodano trzykrotnie 0,28 g wodorofosforanu diamonu, również rozpoczynając od czwartego dnia (dokładniej w dniu czwartym, szóstym i ósmym) w sumie dodano 0,84 g. [0039] Testy przeprowadzano w 500 ml kolbach Erlenmeyera, zawierających 300 ml podłoża, sterylizowanego przed wysianiem zarodników. [0040] W dziewiątym i ostatnim dniu hodowli, całkowita zawartość azotu w pożywce hodowlanej (A) wynosiła 0,85 g/l, natomiast w podłożach, do których dodano wodorofosforan diamonu (A i B) wynosiła, odpowiednio, 1,05 g/l (A) i 1,26 g/l (B). [0041] W celu określenia suchej masy (g/l) i liczby diaspor (zarodników) (CFU / l), począwszy od trzeciego dnia, co dwa dni pobierano próbki pożywki. W celu określenia suchej masy, 20 ml pożywki filtrowano a następnie suszono w piecu w temperaturze 100 C przez 24 godziny. Liczbę diaspor oznaczono na 1 ml pożywki. [0042] Podsumowanie uzyskanych wyników przedstawiono w tabeli 2, poniżej.

9 8 Tabela 2 Dzień A A A B B B C C C ph MS CFU ph MS CFU ph MS CFU 0 5,06 0,00 0,00 5,06 0,00 0,00 5,09 0,00 0,00 3 4,92 3,94 5, ,80 2,84 2, ,80 3,36 2, ,12 3,44 1, ,89 4,57 4, ,30 3,48 3, ,68 6,45 1, ,47 8,32 3, ,39 5,48 4, ,14 8,63 3, ,44 11,30 7, ,86 7,86 6, MS = sucha masa (g/l). CFU = diaspory (zarodniki)/litr. Jak widać z tabeli przedstawionej powyżej, dodanie źródła azotu mineralnego, zwłaszcza niewielkiej ilości (test B), pozwala na znaczne zwiększenie suchej masy, którą można otrzymać począwszy od siódmego dnia hodowli i ponad 100% zwiększenie liczby diaspor, które uzyskuje się w tym samym czasie hodowli.

10 21530/PE/11 EP B1 Zastrzeżenia patentowe 1. Podłoże hodowlane do hodowli grzybów nitkowatych zawierające 60-65% melasy, 10-15% sacharozy, 10-15% namoku kukurydzianego i 10-15% ekstraktu drożdżowego. 2. Podłoże według zastrz. 2, zawierające dodatkowo od 5 do 8% źródła azotu mineralnego. 3. Podłoże według zastrz. 2, w którym źródłem azotu mineralnego jest wodorofosforan diamonu. 4. Sposób uzyskiwania na skalę przemysłową grzybów nitkowatych, w szczególności grzybów nicieniobójczych, obejmujący etap wysiewu konidiów tych grzybów w podłożu hodowlanym określonym w zastrz. 1 i utrzymywanie podłoża w temperaturze C przez 5-10 dni w celu określenia reprodukcji i wzrostu grzybni.

11 /PE/11 EP B1 DOKUMENTY PRZYTOCZONE W OPISIE Lista przytoczonych przez Zgłaszającego dokumentów została zamieszczona wyłącznie do informacji czytelnika i nie stanowi części składowej europejskiego dokumentu patentowego. Została ona zestawiona z największą starannością; EUP nie ponosi jednakże żadnej odpowiedzialności za ewentualne błędy lub braki. Literatura patentowa przytoczona w opisie US A [0005] Literatura niepatentowa przytoczona w opisie Bastos CN. Summa Phytopathologica, November 2000, vol. 27, [0010]