(12)OPIS PATENTOWY (19) PL (11)

Transkrypt

1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12)OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (13) B1 (21) Numer zgłoszenia: Urząd Patentowy (22) Data zgłoszenia: Rzeczypospolitej Polskiej (51) IntCl6: C12P 27/00 C12N 1/14 C12R 1:77 ( 5 4 ) Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 01/93 (73)Uprawniony z patentu: Polska Akademia Nauk, Instytut Chemii Bioorganicznej, Poznań, PL (72) Twórcy wynalazku: Krzysztof Gulewicz, Poznań, PL Zbigniew Michalski, Poznań, PL Maria Rataj-Guranowska, Poznań, PL (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP.10/95 (74) Pełnomocnik: Szykuła Mirosław, Biuro Usług Prawno- Technicznych "Dr. A. Au. & Co." PL B1 (57) 1. Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną, w którym do fermentatora z odpowiednio przygotowaną pożywką, zawierającą źródło węgla, azotu, konieczne makro- i mikroorganizmy oraz niezbędne witaminy, wprowadza się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme i następnie prowadzi się jego hodowlę, zaś po zakończeniu fermentacji wytworzoną grzybnię w postaci płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme odsącza się, a klarowny przesącz zakwasza się i następnie zawarte w nim gibereliny ekstrahuje się dowolnym znanym sposobem, znamienny tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się autoklawowany i następnie ostudzony roślinny ekstrakt, uzyskiwany w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem przemywającym w postaci wody, zawierający od około 1% do 4% suchej masy, najkorzystniej około 2% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu. 4. Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną, w którym zawierającą źródło węgla, azotu, konieczne makro- i mikroorganizmy oraz niezbędne witaminy, wprowadza się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme i następnie prowadzi się jego hodowlę, zaś po zakończeniu fermentacji wytworzoną grzybnię w postaci płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme odsącza się, a klarowny przesącz zakwasza się i następnie zawarte w nim gibereliny ekstrahuje się dowolnym znanym sposobem, znamienny tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się autoklawowany i następnie ostudzony rozwodniony roślinny ekstrakt, otrzymany po oddzieleniu ekstrahenta od roztworu poekstrakcyjnego, uzyskiwanego w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem w postaci wodnego roztworu alkoholu alifatycznego, zawierający po rozwodnieniu od około 1% do około 4% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu, najkorzystniej około 2% tej suchej masy.

2 Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną Zastrzeżenia patentowe 1. Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną, w którym do fermentatora z odpowiednio przygotowaną pożywką, zawierającą źródło węgla, azotu, konieczne makro- i mikroorganizmy oraz niezbędne witaminy, wprowadza się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme i następnie prowadzi się jego hodowlę, zaś po zakończeniu fermentacji wytworzoną grzybnię w postaci płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme odsącza się, a klarowny przesącz zakwasza się i następnie zawarte w nim gibereliny ekstrahuje się dowolnym znanym sposobem, znamienny tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się autoklawowany i następnie ostudzony roślinny ekstrakt, uzyskiwany w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem przemywającym w postaci wody, zawierający od około 1% do 4% suchej masy, najkorzystniej około 2% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że do autoklawowanej pożywki na każdy 11 dodaje się od /00,0051-0,0151/5 x 106, najkorzystniej 0,011 5x 106 komórek zarodników grzyba Fusarium moniloforme, zaś hodowlę prowadzi się w ciemności w temperaturze od 22 C - 35 C, najkorzystniej w temperaturze 28 C bez dodatkowego napowietrzania, przez okres kilku dni, korzystnie 5 dni, a uzyskany przesącz zakwasza się HCl do ph od 2,5-3,0. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że pożywkę, przed wprowadzeniem do fermentatora, autoklawuje się przez okres około 20 minut w temperaturze około 126 C przy ciśnieniu około 1 Atm. 4. Sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną, w którym zawierającą źródło węgla, azotu, konieczne makro- i mikroorganizmy oraz niezbędne witaminy, wprowadza się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme i następnie prowadzi się jego hodowlę, zaś po zakończeniu fermentacji wytworzoną grzybnię w postaci płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme odsącza się, a klarowny przesącz zakwasza się i następnie zawarte w nim gibereliny ekstrahuje się dowolnym znanym sposobem, znamienny tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się autoklawowany i następnie ostudzony rozwodniony roślinny ekstrakt, otrzymany po oddzieleniu ekstrahenta od roztworu poekstrakcyjnego, uzyskiwanego w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem w postaci wodnego roztworu alkoholu alifatycznego, zawierający po rozwodnieniu od około 1 % do około 4% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu, najkorzystniej około 2% tej suchej masy. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że do autoklawowanej pożywki na każdy 11 dodaje się od (0,0051-0,0151) 5 x 106, najkorzystniej 0,0115 x 106 komórek zarodników grzyba Fusarium moniliforme, zaś hodowlę prowadzi się w ciemności w temperaturze od 22 C - 35 C, najkorzystniej w temperaturze 28 C, bez dodatkowego napowietrzania, przez okres kilku dni, korzystnie 5 dni, a uzyskany przesącz zakwasza się HCl do ph od 2,5-3,0. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że pożywkę, przed wprowadzeniem do fermentatora, autoklawuje się przez okres około 20 minut w temperaturze około 126 C przy, ciśnieniu około 1 Atm. * * * Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną poprzez hodowlę grzyba Fusarium moniliforme. Znane dotychczas i stosowane metody wytwarzania giberelin oparte są na hodowli grzyba Fusarium moniliforme, wytwarzającego gibereliny, na specjalnie przygotowanych pożywkach, zawierających źródło węgla i azotu w postaci substancji organicznych, niezbędne makro- i

3 mikroelementy oraz witaminy, przy czym hodowlę prowadzi się w ściśle określonych warunkach środowiskowych takich jak ph, naświetlenie, temperatura itp., zależnych od rodzaju pożywki. Metoda fermentacyjna pozwala uzyskać płynną kulturę grzyba Fusarium moniliforme. Po zakończeniu fermentacji grzybnię przesącza się, a wytworzone gibereliny pozostają w przesączu. Uzyskany przesącz zakwasza się do określonego ph, a następnie ekstrahuje się gibereliny octanem etylu. Zarówno metoda fermentacyjna jak i rodzaje stosowanych pożywek opisane są w pracy P.K.R. Kumara i B.K. Lonsane "Microbial Production of Gibberellins. State of the Art." opublikowanej w Advanced in Applied Microbiology, rok 1985, vol. 14, str Metody te charakteryzują się dużą pracochłonnością z uwagi na rodzaje stosowanych pożywek, zaś uzyskiwane wydajności wytwarzanych ilości giberelin są ciągle niezadawalające i nie zaspokajają zapotrzebowania na ten naturalny hormon stymulujący wzrost i rozwój roślin. W sposobie wytwarzania giberelin metodą fermentacyjną według wynalazku istota rozwiązania polega na tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się autoklawowany i następnie ostudzony roślinny ekstrakt, uzyskiwany w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem przemywającym w postaci wody, zawierający od około 1% do około 4% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu, najkorzystniej około 2% tej suchej masy. Sposób według wynalazku polega również na tym, że jako pożywkę, do której dodaje się komórki zarodników grzyba Fusarium moniliforme, stosuje się, autoklawowany i następnie ostudzony, rozwodniony roślinny ekstrakt, otrzymany po oddzieleniu ekstrahenta od roztworu poekstrakcyjnego, uzyskiwanego w procesie traktowania nasion łubinu przez okres co najmniej kilku godzin znanym ekstrahentem w postaci wodnego roztworu alkoholu alifatycznego, zawierający po rozwodnieniu od około 1 % do około 4% suchej masy wyestrahowanej z nasion łubinu, najkorzystniej około 2% tej suchej masy. W obydwu sposobach istotne jest również to, że korzystnie jest, gdy do autoklawowanej pożywki na każdy 11 dodaje się od (0,0051-0,0151) 5 x 106, najkorzystniej 0,0115 x 106 komórek zarodników grzyba Fusarium moniliforme, zaś hodowlę prowadzi się w ciemności w temperaturze od 22 C - 35 C, najkorzystniej w temperaturze 28 C, bez dodatkowego napowietrzania, przez kilka dni, korzystnie przez 5 dni, a uzyskany przesącz zakwasza się HCl do ph od 2,5-3,0. Korzystnie jest również w obu sposobach, gdy pożywkę, przed wprowadzeniem do fermentatora, autoklawuje się przez okres około 20 minut w temperaturze około 126 C przy ciśnieniu około 1 Atm. Sposoby według wynalazku umożliwiają prowadzenie hodowli grzyba Fusarium moniliforme dla wytwarzania giberelin przy wykorzystaniu pożywki stanowiącej produkt łatwy do uzyskania, w szczególności stanowiący produkt odpadkowy w postaci roztworu poekstrakcyjnego w procesach odgoryczania nasion łubinu gorzkiego, przy czym w równym stopniu można wykorzystywać ekstrakt uzyskany przy przemywaniu znanymi ekstrahentami łubinów słodkich. Z uwagi jednak na ich cenę wyższą od ceny łubinów gorzkich, najkorzystniej jest wykorzystywać do tego celu te ostatnie. Te korzystne cechy ekstraktów zastosowanych w charakterze pożywki dla hodowli grzyba Fusarium moniliforme rozpoznano zupełnie nieoczekiwanie w pracach ubocznych prowadzonych przy badaniach doświadczalnych nad możliwością wykorzystywania roztworu poekstrakcyjnego ze znanych procesów odgoryczania nasion łubinów gorzkich i związanych z nimi badaniach analitycznych składu chemicznego tych roztworów. Zauważono mianowicie, że w czasie przechowywania roztworu poekstrakcyjnego w pewnych warunkach wykazuje on cechy fermentacyjne. Rozpoznanie ich wykorzystano do próbnych hodowli niektórych grzybów, między innymi grzyba Fusarium nomiliforme, o którym wiadomo, że jego wyhodowane miedzy innymi metodą fermentacyjną płynne kultury zawierają gibereliny. Okazało się nieoczekiwanie, że odpowiednio przygotowany i wykorzystany roztwór poekstrakcyjny z procesem odgoryczania łubinu umożliwia przygotowanie taniej pożywki dla wytwarzania giberelin. Analiza chemiczna roztworu poekstrakcyjnego wykazała, że zawiera on wszystkie składniki konieczne do rozwoju grzyba Fusarium moniliforme tj. źródło węgla, azotu,

4 makro- i mikroelementy oraz niezbędne witaminy. Okazało się, że źródłem węgla dla rozwoju tego grzyba na pożywkach według sposobów opisanych wyżej jest cukier w postaci węglowodanów rodziny rafinozy, stanowiący znaczny procent suchej masy ekstraktu, zaś źródło azotu stanowią aminokwasy, peptydy, a także związki amidowe. W ekstraktach znajdują się także makroelementy takie jak K, Ca, Mg, Na oraz mikroelementy takie jak Cu, Mn, Zn, Fe i Mo. Przedstawione sposoby według wynalazku pozwalają uniknąć znacznych nakładów na przygotowywanie dotychczas stosowanych pożywek do hodowli grzyba Fusarium moniliforme w procesie fermentacyjnego wytwarzania giberelin. Zastosowany jako pożywka poekstrakcyjny roztwór z procesu odgoryczania nasion łubinu stanowi odpadkowy produkt dotychczas nie wykorzystywany. Przy wysokiej cenie giberelin jest to bardzo korzystna cecha sposobów według wynalazku. Z uzyskanych w trakcie procesów próbnych wyników wydajność sposobów według wynalazku sięga co najmniej od 0,4-0,5g giberelin na 1 litr przesączu uzyskanego po procesie fermentacyjnej hodowli płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme. Wpływ na wyżej określoną wydajność mają oczywiście również odpowiednio dobrane parametry prowadzenia procesu. Przykład I. Do przygotowania pożywki użyto ekstraktu łubinowego uzyskanego z procesu odgoryczania nasion łubinu gorzkiego Lupinus angustifolius odmiany Mirela 70% roztworem wodnym mentanolu, którym nasiona łubinu przemywano przez okres około 24 godzin. Poniższa tabela przedstawia skład chemiczny suchej masy ekstraktu. Składnik % s.m. Węglowodany 47,04 Nielotne kwasy organiczne 5,50 Białko (N x 6,25) 3,16 Wolne aminokwasy, peptydy 6,97 Alkaloidy 9,58 Popiół 10,78 Inne 16,97 Ekstrakt łubinowy zawierający 83% suchej masy rozcieńczono wodą destylowaną w stosunku około 1 :40 i uzyskano około 10 litrów roztworu, zawierającego około 2% suchej masy ekstraktu, który następnie poddano autoklawowaniu przez okres około 20 minut w 20 - litrowym autoklawie ELMI-typ ESS-201, temperaturze 126 C przy ciśnieniu około 1 Atm. Po ostudzeniu roztwór stanowiący odpowiednio przygotowaną pożywkę wlano do 40-litrowego fermentatora typu Bio-Fli New Brunswick. Na każdy 1 litr roztworu dodano do tego fermentatora około 0,011 5 x 106 komórek zarodników grzyba Fusarium moniliforme. Następnie prowadzono hodowlę metodą fermentacyjną w temperaturze 28 C, bez dodatkowego napowietrzania przez okres 5 dni. Po upływie tego czasu zawartość fermentatora przesączono uzyskując przesącz w ilości 0,1 litra. Następnie do przesączu celem jego zakwaszenia dodano HCl zakwaszając go do uzyskania ph około 2,5-3,0. Uzyskany zakwaszony przesącz estrahowano znanym sposobem octanem etylu. Fazę octanu etylu oddzielono od fazy wodnej na rozdzielaczu, zaś octan etylu odparowano pod próżnią. Suchą pozostałość rozpuszczono w wodzie i przy pomocy testu wydłużeniowego hypokotylu sałaty określono stopień zawartości giberelin w uzyskanej suchej masie. Test, opisany w publikacji "Effectof gibberellic acid on hypocotyl growth of lettuce seedlings" Nature 185, 255, B.Frankland, P.F.Wareing, 1960, polega na obserwacji wydłużania się hypokotyli siewek sałaty pod wpływem wzrastającego stężenia giberelin w badanym roztworze. Nasiona sałaty masłowej wysiano na wilgotnej bibule i kiełkowano w temperaturze 25 C w ciemności przez dwie doby. W międzyczasie tj. po około 24 godz. nasiona naświetlano światłem dziennym przez okres około min. Po dwóch dobach siewki przeniesiono na szalki Petriego wyłożone krążkami bibuły nasączonej testowanym roztworem. Na każdej szalce umieszczono po 10 siewek, a każdy wariant wykonano w trzech powtórzeniach. Dalszy wzrost siewek przebiegał w temperaturze 22 C w świetle ciągłym przy zapewnionej maksymalnej wilgotności środowiska. Jako kontrolę stosowano siewki rosnące równolegle na bibule nasączonej wodą oraz siewki

5 rosnące równolegle na bibułach nasączonych roztworami gibereliny GA3 o zróżnicowanych skokowo i ściśle określonych stężniach odpowiednio 50; 5; 0,5, 0,05 ug/ml. Po czterech dobach pod binokularem mierzono długość hypokotyli siewek. Zmierzone długości odnoszono do krzywej wzorcowej w postaci długości hypokotyla sałaty w funkcji stężenia gibereliny GA3, w której długość podana jest w mm, zaś stężenie w ug/ml. Średnia długość hypokotyla siewek sałaty w opisanym przykładzie wynosiła 27 mm, co odpowiadało stężeniu giberelin GA3/ w testowanych próbkach około 5 ug/ml. P r z y k ł a d II. Do przygotowania pożywki użyto ekstraktu łubinowego uzyskanego z procesu przemywania nasion łubinu gorzkiego Lupinus angustofolius odmiany Mirela wodą w obiegu ciągłym przez okres około 48 godzin. Poniższa tabela przedstawia skład chemiczny suchej masy ekstraktu. Składnik % suchej masy Węglowodany 46,84 Nielotne kwasy organiczne 5,60 Białko (Nx6,25) 3,21 Wolne aminokwasy, peptydy 6,92 Alkaloidy 7,58 Popiół 11,90 Inne 17,12 Ekstrakt łubinowy rozcieńczono do zawartości około 2,1% s.m. wodą i uzyskano około 10 litrów roztworu, który następnie, w autoklawie jak w przykładzie I, poddano autoklawowaniu przez okres 22 minut w temperaturze 123 C przy ciśnieniu 1 Atm. Po ostudzeniu roztwór stanowiący odpowiednio przygotowaną pożywkę wlano do fermentatora typu jak w przykładzie I. Na każdy 1 litr roztworu dodano do tego fermentatora około 0, x 106 komórek zarodników grzyba Fusarium moniliforme. Następnie prowadzono hodowlę metodą fermentacyjną w temperaturze 29 C bez dodatkowego napowietrzania przez okres około 4,5 dnia. Po upływie tego okresu zawartość fermentatora w postaci płynnej kultury grzyba Fusarium moniliforme przesączono uzyskując przesącz w ilości około 8,9 litra. Następnie przesącz zakwaszono HCl do ph około 2,8. Uzyskany zakwaszony przesącz ekstrahowano znanym sposobem octanem etylu. Fazę octanu etylu oddzielono na oddzielaczu i odparowano octan etylu pod próżnią, zaś suchą masę uzyskaną w ten sposób, zawierającą gibereliny poddano testowi na zawartość giberelin jak w przykładzie I, przy pomocy opisanego uprzednio testu wydłużeniowego hypokotyla sałaty. Wydajność procesu określono na poziomie około 0,4g giberelin na 1 litr przesączu uzyskanego po procesie hodowli grzyba Fusarium moniliforme.

6 Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 1,50 zł