(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB03/004502

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61K 9/19 ( ) (54) Trwały ciekły wodny preparat farmaceutyczny zawierający ludzkie przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworów alfa (30) Pierwszeństwo: , US, 10/222,140 (73) Uprawniony z patentu: ABBVIE BIOTECHNOLOGY LTD., Hamilton, BM (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 13/12 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 10/14 (72) Twórca(y) wynalazku: HANS-JUERGEN KRAUSE, Worms, DE LISA BAUST, Mannheim, DE MICHAEL DICKES, Rodersheim-Gronau, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski

2 2 PL B1 Opis wynalazku Stan techniki Przedmiotem wynalazku jest trwały ciekły wodny preparat farmaceutyczny zawierający ludzkiego przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworów alfa. Czynnik martwicy nowotworu a (TNF ) jest cytokiną wytwarzaną przez liczne typy komórek, w tym monocyty i makrofagi, którą pierwotnie wykryto na podstawie jej zdolności indukowania martwicy pewnych nowotworów u myszy (patrz np. Old, L. (1985) Science 230: ). Następnie wykazano, że czynnik nazywany kachektyną, związany z kacheksją, ma cząsteczkę identyczną jak TNF. TNF pośredniczy we wstrząsie (patrz np. Beutler, B. i Cerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: ; Beutler, B. i Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: ). Ponadto, TNF bierze udział w patofizjologii różnorodnych innych chorób i zaburzeń u człowieka, w tym posocznicy, zakażenia, chorób autoimmunizacyjnych, odrzucania przeszczepu i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (patrz np. Moeller, A., i in. (1990) Cytokine 2: ; opis patentowy US nr , Moeller i in. ; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Moeller, A., i in. Yasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: ; Tracey, KJ. i Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: ). Ze względu na szkodliwe działanie ludzkiego TNF (htnf ) w różnorodnych zaburzeniach u człowieka, ułożono strategie terapeutyczne do hamowania lub przeciwdziałania aktywności htnf. W szczególności, poszukuje się przeciwciał wiążących się z i neutralizujących htnf jako środka do hamowania aktywności htnf. Niektórymi z najwcześniejszych takich przeciwciał były mysie przeciwciała monoklonalne (mab), wydzielane przez hybrydoma wytworzone z limfocytów myszy immunizowanych htnf (patrz np. Hahn T; i in., (1985) Proc Natl Acad Sci USA 82: ; Liang, C-M., i in. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: ; Hirai, M., i in. (1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, B.M., i in. (1987) Hybridoma 6: ; Moeller, A., i in. (1990) Cytokine 2: ; opis patentowy US nr , Moeller i in.; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Wallach, D.; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr A1, Old i in.; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Moeller, A., i in.). Podczas gdy te mysie przeciwciała anty-htnf często przejawiały wysokie powinowactwo do htnf (np. K d < 10-9 M) i były zdolne neutralizować aktywność htnf, ich zastosowanie in vivo może być ograniczone przez problemy związane z podawaniem mysich przeciwciał ludziom, takie jak krótki okres połtrwania w osoczu, niezdolność do wywołania pewnych funkcji efektorowych u ludzi i wywoływanie niepożądanej odpowiedzi immunologicznej przeciwko mysim przeciwciałom u ludzi (odpowiedź ludzkich przeciwciał antymysich" (HAMA)). Próbując pokonać trudności związane z zastosowaniem całkowicie mysich przeciwciał u ludzi, metodą inżynierii genetycznej otrzymano bardziej podobne do ludzkich" mysie przeciwciała antyhtnf. Przykładowo, wytworzono chimeryczne przeciwciała, w których części zmienne łańcuchów przeciwciał są pochodzenia mysiego, a części stałe łańcuchów przeciwciał są pochodzenia ludzkiego, (Knight, D.M, i in. (1993) Mol Immunol. 30: ; publikacja PCT nr WO 92/16553, Daddona, P.E., i in.). Ponadto, wytworzono także przeciwciała humanizowane, w których domeny hiperzmienne części zmiennych przeciwciał są pochodzenia mysiego, a reszta części zmiennych i stałych przeciwciał jest pochodzenia ludzkiego (publikacja PCT nr WO 92/11383, Adair, J.R., i in.). Jednakże, ponieważ te chimeryczne i humanizowane przeciwciała wciąż zawierają pewne sekwencje mysie, mogą nadal wywoływać niepożądaną odpowiedź immunologiczną, odpowiedź przeciw chimerycznym przeciwciałom (HACA) u człowieka, szczególnie podawanym przez dłuższy okres czasu, np. w wyniku wskazań ze względu na stany przewlekłe, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów (patrz np. Elliott, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ; Elliot, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ). Korzystniejszym niż mysie mab lub ich pochodne (np. przeciwciała chimeryczne lub humanizowane) środkiem hamującym htnf byłoby całkowicie ludzkie przeciwciało przeciw htnf, ponieważ taki środek nie powinien wywoływać odpowiedzi HAMA, nawet w przypadku długotrwałego stosowania. Przy zastosowaniu technik ludzkiej hybrydomy wytworzono ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw htnf (Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152: ; Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152: ; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr A2, Boyle, i in.). Jednakże, według doniesień, autoprzeciwciała monoklonalne pochodzące z hybrydomy mają zbyt małe powinowactwo do htnf, aby je obliczyć typowymi sposobami, nie były w stanie wiązać rozpuszczalnego htnf ani znieść cytotoksyczności wywołanej przez htnf (patrz Boyle, i in.; powyżej). Ponadto, powodzenie technik z zastosowaniem ludzkich hybrydom zależy od naturalnej obecności u czło-

3 PL B1 3 wieka limfocytów krwi obwodowej wytwarzających autoprzeciwciała swoiste dla htnf. W niektórych badaniach wykryto u człowieka autoprzeciwciała osocza przeciw htnf (Fomsgaard, A., i in. (1989) Scand. J. Immunol. 30: ; Bendtzen, K., i in. (1990) Prog. Leukocyte Biol 10B: ), podczas gdy w innych badaniach - nie (Leusch, H-G., i in. (1991) J. Immunol. Methods 13 9: ). Alternatywą naturalnie występujących ludzkich przeciwciał przeciw htnf byłoby rekombinowane przeciwciało htnf. Dotychczas opisano rekombinowane ludzkie przeciwciała wiążące htnf o względnie słabym powinowactwie (tj., K d ~10-7 M) i dużej stałej dysocjacji (tj., K off ~10-2 s -1 ) (Griffiths, A.D., i in. (1993) EMBO J. 12: ). Jednakże, ze względu na ich względnie szybką kinetykę dysocjacji, przeciwciała te mogą być nieodpowiednie do stosowania terapeutycznego. Ponadto, opisano rekombinowane ludzkie przeciwciało przeciw htnf, które nie neutralizuje aktywności htnf, a raczej zwiększa wiązanie htnf z powierzchnią komórek i zwiększa internalizację htnf (Lidbury, A., i in. (1994) Biotechnol Ther. 5:27-45; publikacja PCT nr WO 92/03145, Aston, R. i in.) Opisano również rekombinowane ludzkie przeciwciała wiążące rozpuszczalne htnf o dużym powinowactwie i powolnej kinetyce dysocjacji, mogące neutralizować aktywność htnf, w tym powodować zniesienie cytotoksyczności wywołanej przez htnf (in vitro i in vivo) oraz aktywacji komórek wywołanej przez htnf, (patrz opis patentowy US nr ). Istota wynalazku Istnieje zapotrzebowanie na trwały preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego o długim dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierający przeciwciało nadające się do zastosowania terapeutycznego w celu hamowania lub przeciwdziałania szkodliwej aktywności htnf. Istnieje także zapotrzebowanie na trwały preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego o długim dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierający przeciwciało nadające się do zastosowania terapeutycznego, łatwe do podawania i zawierające wysokie stężenie białka. Przedmiotem wynalazku jest ciekły wodny preparat farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera 30 do 120 mg/ml ludzkiego przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworów alfa (htnf ), lub jego części wiążącej antygen, w roztworze buforującym zawierającym bufor cytrynianowy i fosforanowy, który to preparat ma ph 4 do 8 i przy czym ten preparat ma dopuszczalny okres przechowywania wynoszący co najmniej 18 miesięcy; albo ma dopuszczalny okres przechowywania wynoszący co najmniej 18 miesięcy w stanie ciekłym; albo zachowuje trwałość po co najmniej 3 cyklach zamrażanie/rozmrażanie preparatu; albo ma zwiększoną trwałość wynoszącą co najmniej 12 miesięcy w temperaturze 2-8 C. Korzystnie, preparat nadaje się do stosowania w jednorazowym zastrzyku podskórnym. W korzystnej postaci preparatu stężenie przeciwciała wynosi pomiędzy około mg/ml. Korzystnie stężenie przeciwciała wynosi pomiędzy około mg/ml. Także korzystnie stężenie przeciwciała wynosi pomiędzy około mg/ml. Również korzystnie stężenie przeciwciała jest większe niż około 45 mg/ml. Także korzystnie, stężenie przeciwciała wynosi około 50 mg/ml. Przedmiotem wynalazku jest także ciekły wodny preparat farmaceutyczny, charakteryzujący się tym, że zawiera (a) mg/ml ludzkiego przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworów alfa (htnf ) lub jego części wiążącej antygen, (b) 5-20 mg/ml mannitolu, (c) 0,1-10 mg/ml monooleinianu polioksyetylenosorbitolu i (d) układ buforujący zawierający cytrynian i/lub fosforan, mający ph 4 do 8. W korzystnej postaci preparatu ph wybiera się spośród zakresów obejmujących zakres od około 4,5 do około 6,0, od około 4,5 do około 5,5 i od około 5,0 do około 5,2. Korzystnie preparat zawiera (a) około 50 mg/ml przeciwciała lub jego części wiążącej antygen, (b) około 12 mg/ml mannitolu, (c) około 1 mg/ml monooleinianu polioksyetylenosorbitolu i (d) układ buforujący zawierający cytrynian i fosforan, mający ph 4 do 8. Korzystniej układ buforujący obejmuje (a) około 1,3 mg/ml kwasu cytrynowego, (b) około 0,3 mg/ml cytrynianu sodu, (c) około 1,5 mg/ml dihydratu fosforanu disodu, (d) około 0,9 mg/ml dihydratu diwodorofosforanu sodu i (e) około 6,2 mg chlorku sodu. Przedmiotem wynalazku jest także ciekła wodna kompozycja farmaceutyczna, charakteryzująca się tym, że zawiera poliol, środek powierzchniowo czynny i układ buforujący zawierający cytrynian i fosforan, mający ph 4 do 8, w ilościach wystarczających do sformułowania ludzkiego przeciwciała przeciw czynnikowi martwicy nowotworów alfa (TNF ), lub jego części wiążącej antygen, do stosowania terapeutycznego w stężeniu wynoszącym powyżej około 45 mg/ml.

4 4 PL B1 W korzystnej postaci preparatu poliol stanowi mannitol. Korzystniej preparat zawiera 5-20 mg/ml mannitolu. W korzystnej postaci preparatu środek powierzchniowo czynny stanowi monooleinian polioksyetylenosorbitol. Korzystniej preparat zawiera 0,1-10 mg/ml monooleinianu polioksyetylenosorbitolu. W korzystnej postaci preparatu przeciwciało lub jego część wiążąca antygen jest ludzkim przeciwciałem, lub jego częścią wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, z których obie określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz neutralizuje działanie cytotoksyczne ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. W innej korzystnej postaci preparatu przeciwciało lub jego część wiążąca antygen (a) dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, co określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego; (b) zawiera domenę CDR3 łańcucha lekkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO: 3 lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 albo przez jedną do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; (c) domenę CDR3 łańcucha ciężkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO. 4 lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 albo przez jedną do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. W kolejnej korzystnej postaci preparatu przeciwciało zawiera domenę zmienną CDR2 łańcucha lekkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO: 5 i domenę zmienną CDR2 łańcucha ciężkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO:6; przy czym ewentualnie przeciwciało zawiera domenę zmienną CDR1 łańcucha lekkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO:7 i domenę zmienną CDR2 łańcucha ciężkiego obejmującą sekwencję aminokwasową oznaczoną jako SEQ ID NO:8. W innej korzystnej postaci preparatu przeciwciało lub jego część wiążąca antygen zawiera region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR) obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 1 i region zmienny ciężkiego łańcucha (HCVR) obejmujący sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 2 Korzystniej przeciwciało lub jego część wiążąca antygen jest przeciwciałem D2E7 lub jego częścią wiążącą antygen. Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie preparatu zdefiniowanego powyżej do wytwarzania leku do leczenia osobnika z zaburzeniem, w którym aktywność TNF jest szkodliwa. W korzystnej postaci zaburzeniem, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, jest zaburzenie autoimmunizacyjne. W korzystniejszej postaci zaburzenie autoimmunizacyjne jest wybrane z grupy obejmującej reumatoidalne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów, alergię, stwardnienie rozsiane, cukrzycę spowodowaną chorobą autoimmunizacyjną, autoimmunizacyjne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy. W korzystnej postaci zaburzeniem, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, jest zaburzenie jelitowe. W korzystniejszej postaci zaburzenie jelitowe stanowi idiopatyczna choroba zapalna jelit. W szczególności idiopatyczną chorobę zapalną jelit stanowi choroba Crohna lub wrzodziejące zapalenie okrężnicy. W korzystnej postaci zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, jest wybrane z grupy obejmującej chorobę zakaźną, odrzucenie przeszczepu, nowotwór złośliwy, zaburzenie płucne, zaburzenie sercowe i posocznicę. W szczególności choroba zakaźna jest wybrana z grupy obejmującej malarię, zapalenie opon mózgowych, AIDS i grypę. W szczególności zaburzenie płucne jest wybrane z grupy obejmującej zespół ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, płuco wstrząsowe, przewlekłą chorobę zapalną płuc, zwłóknienie płuc, sarkoidozę płucną i pylicę krzemową. W szczególności zaburzeniem sercowym jest niedokrwienie serca lub niewydolność serca. W szczególności zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, jest wybrane z grupy obejmującej łuszczycę, łuszczycowe zapalenie stawów, chorobę Stilla u dorosłych, chorobę Alzheimera, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, astmę, nowotwór i kacheksję, miażdżycę naczyń,

5 PL B1 5 przewlekłą miażdżycę naczyń, zespół przewlekłego zmęczenia, niewydolność wątroby, przewlekłą niewydolność wątroby, obturacyjną chorobę płuc, przewlekłą obturacyjną chorobę płuc, zastoinową niewydolność serca, zapalenie skórnomięśniowe i wielomięśniowe, makrowaskulopatię cukrzycową, gruczolistość, gorączkę okresową rodzinną, zwłóknienie, hemodializę, reakcję Jarischa-Herxheimera, młodzieńcze zapalenie stawów, zespół Kawasakiego, zespół mielodysplastyczny, zawał mięśnia sercowego, zaburzenie o nazwie panciaticular vulgaris, chorobę ozębnej, neuropatię obwodową, zaburzenia wielostawowe, zapalenie wielomięśniowe, postępującą niewydolność nerek, zespół Reitera, sarkoidozę, twardzinę, spondyloartropatie, chorobę Stilla, udar, zespół związany z terapią, zespół zapalny wywołany terapią, zespół zapalny w wyniku podawania IL-2, operację tętniaka aorty w odcinku piersiowobrzusznym (TAAA), chorobę Vasulo-Behceta, szczepionkę przeciw żółtej febrze, cukrzycę typu 1, cukrzycę typu 2, ból neuropatyczny, rwę kulszową, obrzęk mózgu, obrzęk rdzenia i/lub wokół rdzenia kręgowego, zapalenie naczyń, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie tętnicy skroniowej, bóle mięśni typu reumatoidalnego, zapalenie tętnic Takayasu, guzkowe zapalenie tętnic, mikroskopowe zapalenie wielonaczyniowe, zespół Churga-Strauss, zespół Felty'ego, zespół Sjogrena, mieszaną chorobę tkanki łącznej, nawracające zapalenie wielochrząstkowe, stan zapalny przypominający dnę moczanową, obluzowanie protez, autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, stwardniające zapalenie dróg żółciowych, ostre zapalenie trzustki, przewlekłe zapalenie trzustki, kłębuszkowe zapalenie nerek, popaciorkowcowe zapalenie kłębuszkowe nerek lub popaciorkowcową nefropatię IgA, chorobę reumatyczną serca, kardiomiopatię, zapalenie jąder, piodermię zgorzelinową, szpiczaka mnogiego, okresowy zespół związany z receptorem TNF [TRAPS], miażdżycę naczyń, sterydozależne olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic i mięśni, zapalenie błony naczyniowej oka i reakcje na leki. Płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego może zawierać przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które ma region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34. Przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, może neutralizować aktywność ludzkiego TNF, TNF szympansa i TNF co najmniej jednej dodatkowej małpy naczelnej wybranej z grupy obejmującej TNF pawiana, TNF marmozety, TNF małpy cynomolgus i TNF rezusa. Preparat według wynalazku może zawierać przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które także neutralizuje aktywność mysiego TNF. Preparat według wynalazku może zawierać także przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które neutralizuje aktywność TNF świni. Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek ten dotyczy płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego o ph około 4 do około 8 zawierającego białko w dużym stężeniu, zawierającego przeciwciała w stężeniu w zakresie od około 30 do około 120 mg/ml i o zwiększonej trwałości. Wynalazek dotyczy także płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego do zastosowania terapeutycznego u osobnika dotkniętego stanem charakteryzującym się szkodliwym działaniem TNF. Preparat według wynalazku zawiera następujące składniki: przeciwciało wiążące ludzki TNF o dużym powinowactwie, małej stałej dysocjacji i dużych możliwościach neutralizacji; bufor, w tym kwas cytrynowy, cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu i dihydrat diwodorofosforanu sodu; środki osmotyczne, w tym mannitol i chlorek sodu; detergent, w tym polysorbate 80; i wodorotlenek sodu, w celu regulacji ph. Definicje W celu ułatwienia zrozumienia wynalazku niektóre określenia zdefiniowano na wstępie. Określenie osobnik" dotyczy organizmów żywych, np. Prokaryota i Eukaryota. Przykłady osobników obejmują ssaki, np. ludzi, psy, krowy, konie, świnie, owce, kozy, koty, myszy, króliki, szczury i zwierzęta transgeniczne. W konkretnych postaciach wynalazku, osobnikiem jest człowiek. Określenie preparat farmaceutyczny" dotyczy preparatów, które są w postaci umożliwiającej zdecydowaną skuteczność biologiczną składników czynnych i które nie zawierają żadnych dodatkowych składników w sposób istotny toksycznych względem osobników, którym podawano by preparat. Zaróbki (podłoża, substancje dodatkowe) dopuszczalne farmaceutycznie" to takie, które można w sposób rozsądny podawać ssakowi otrzymując skuteczną dawkę stosowanego składnika czynnego.

6 6 PL B1 Określenie trwały" preparat dotyczy takiego preparatu, w którym przeciwciało w zasadzie zachowuje trwałość fizyczną i/lub trwałość chemiczną i/lub aktywność biologiczną podczas przechowywania. Znane w dziedzinie różne techniki analityczne do pomiaru trwałości białek opisano na przykład w Peptide and Protein Drug Delivery, , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, N. Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: (1993). Trwałość można zmierzyć w wybranej temperaturze w wybranym okresie czasu. Korzystnie, preparat jest trwały w temperaturze pokojowej (około 30 C) lub w temperaturze 40 C przez co najmniej 1 miesiąc i/lub trwały w temperaturze około 2-8 C przez co najmniej 1 rok lub przez co najmniej 2 lata. Ponadto, korzystne jest, aby preparat zachowywał trwałość po zamrożeniu (do np. -70 C) i rozmrożeniu, co dalej określa się jako cykl zamrażanie/rozmrażanie". Przeciwciało zachowuje fizyczną trwałość" w preparacie farmaceutycznym jeśli przy oględzinach gołym okiem lub przy pomiarze za pomocą rozpraszania światła UV lub chromatografii wykluczania nie wykazuje żadnych objawów agregacji, wytrącania i/lub denaturacji przejawiających się zmianą zabarwienia i/lub klarowności. Przeciwciało w preparacie farmaceutycznym zachowuje chemiczną trwałość", jeśli trwałość chemiczna w danym momencie jest taka, że przeciwciało zachowuje aktywność biologiczną, jak zdefiniowano poniżej. Trwałość chemiczną można określić przez wykrywanie i określanie ilościowe postaci przeciwciała zmienionych chemicznie. Zmiana chemiczna może obejmować zmianę wielkości (np. przycinanie), którą można oszacować stosując na przykład chromatografię wykluczania, SDS-PAGE i/lub spektrometrię masową z laserową desorpcją i jonizacją próbki wspomaganą matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI/TOF MS). Inne rodzaje zmian chemicznych obejmują zmianę ładunku (np. zachodzącą w wyniku dezaminacji), którą można oszacować na przykład za pomocą chromatografii jonowymiennej. Przeciwciało w preparacie farmaceutycznym zachowuje aktywność biologiczną", jeśli przeciwciało w preparacie farmaceutycznym jest biologicznie czynne w stopniu odpowiednim do zamierzonego celu. Przykładowo, aktywność biologiczna jest zachowana jeśli aktywność biologiczna przeciwciała w preparacie farmaceutycznym mieści się w zakresie około 30%, około 20%, lub około 10% (w granicach błędu pomiaru) aktywności biologicznej wykazywanej podczas wytwarzania preparatu farmaceutycznego (np. określonej w teście wiązania antygenu). Określenie izotoniczny" jest znane w dziedzinie. Izotoniczny może oznaczać, np. że dany preparat ma w zasadzie takie samo ciśnienie osmotyczne jak krew człowieka. Preparaty izotoniczne na ogół mają ciśnienie osmotyczne od około 250 do 350 mosm. Izotoniczność można zmierzyć stosując na przykład osmometr typu parowego lub z zamrażaniem lodem. Określenie środek osmotyczny" oznacza związek, który nadaje preparatowi izotoniczność. Określenie poliol" oznacza substancję zawierającą wiele grup hydroksylowych i obejmuje cukry (cukry redukujące i nieredukujące), alkohole i kwasy cukrowe. Preferowane tu poliole mają masę cząsteczkową poniżej około 600 kd (np. w zakresie od około 120 do około 400 kd). Określenie cukier redukujący" oznacza cukier zawierający grupę półacetalową, redukującą jony metali lub reagującą kowalencyjnie z lizyną i innymi grupami aminowymi białek, a określenie cukier nieredukujący" oznacza cukier, który nie ma właściwości cukru redukującego. Przykładami cukrów redukujących są fruktoza, mannoza, maltoza, laktoza, arabinoza, ksyloza, ryboza, ramnoza, galaktoza i glukoza. Cukry nieredukujące obejmują sacharozę, trehalozę, sorbozę, melezytozę i rafinozę. Mannitol, ksylitol, erytrytol, treitol, sorbitol i glicerol stanowią przykłady alkoholi cukrowych. Kwasy cukrowe obejmują L-glukonian i jego sole z metalami. W przypadku gdy wymagane jest, żeby preparat zachowywał trwałość pomimo zamrażania i rozmrażania, korzystne jest, by poliol nie krystalizował w temperaturze zamarzania (np. -20 C) co destabilizowałoby przeciwciała w preparacie. Poliol może także działać jako środek osmotyczny. W jednej postaci wynalazku, jednym ze składników preparatu jest mannitol w stężeniu 5 do 20 mg/ml. W korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi 7,5 do 15 mg/ml. W korzystniejszej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi mg/ml. Stosowane tu określenie bufor" odnosi się do roztworu buforowego, który przeciwdziała zmianom ph za pośrednictwem składników, którymi są sprzężony kwas i zasada. Bufor zgodnie z wynalazkiem ma ph w zakresie od około 4 do około 8; korzystnie od około 4, 5 do około 7; a najkorzystniej, ph w zakresie od około 5,0 do około 6,5. Przykłady buforów kontrolujących ph w tym zakresie obejmują octan (np. octan sodu), bursztynian (taki jak bursztynian sodu), glukonian, histydynę, cytrynian i inne bufory kwasów organicznych.

7 PL B1 7 Pod względem farmakologicznym, w kontekście według wynalazku, określenie ilość skuteczna terapeutycznie" lub skuteczna ilość" przeciwciała odnosi się do ilości skutecznie zapobiegającej lub leczącej zaburzenia, w leczeniu którego stwierdzono skuteczność przeciwciała. Określenie zaburzenie" oznacza jakikolwiek stan, w którym leczenie przeciwciałem przynosi korzyści. Obejmuje on przewlekłe i ostre zaburzenia lub choroby obejmujące takie stany patologiczne, które usposabiają do wystąpienia danego zaburzenia. Określenie środek konserwujący" oznacza związek, który może być zawarty w preparacie w celu istotnego zmniejszenia w nim aktywności bakteryjnej, a tym samym ułatwienia na przykład wytwarzania preparatów do różnorodnego zastosowania. Przykłady potencjalnych środków konserwujących obejmują chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametonium, chlorek benzalkonium (mieszaninę chlorków alkilobenzylodimetyloamoniowych, w których grupami alkilowymi są związki długołańcuchowe) i chlorek benzetonium. Inne rodzaje środków konserwujących obejmują alkohole aromatyczne, takie jak fenol, butyl i alkohol benzylowy, alkiloparabeny, takie jak metylo- lub propyloparaben, katechol, rezorcyna, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Określenie leczenie" odnosi się zarówno do postępowania terapeutycznego jak i profilaktyki lub działań zapobiegawczych. Osoby wymagające leczenia obejmują osoby już cierpiące na dane zaburzenie jak również te, u których ma być stosowana profilaktyka tego zaburzenia. Stosowane tu określenia podawanie pozajelitowo" i podawany pozajelitowo" oznaczają sposoby podawania, inne niż podawanie dojelitowo i miejscowo, zazwyczaj przez zastrzyk, które obejmują, bez ograniczeń: zastrzyk i wlew dożylny, domięśniowy, dotętniczy, dooponowy, wewnątrztorebkowy, dooczodołowy, dosercowy, śródskórny, dootrzewnowy, dotchawiczy, podskórny, podnaskórkowy, dostawowy, podtorebkowy, podpajęczynówkowy, dordzeniowy i domostkowy. Stosowane tu określenia podawanie ogólnoustrojowe", podawany ogólnoustrojowo", podawanie obwodowe" i podawany obwodowo", np. podawanie podskórnie, oznaczają podawanie związku, leku lub innego środka w sposób inny, niż bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego, tak, aby znalazł się w organizmie pacjenta, a zatem był poddany metabolizmowi i innym podobnym procesom. Określenie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik" jest znane w dziedzinie i obejmuje farmaceutycznie dopuszczalny środek, kompozycję lub podłoże, odpowiednie do podawania ssakom. Nośniki obejmują płynne lub stałe wypełniacze, rozcieńczalniki, zaróbki, rozpuszczalniki lub środki kapsułkujące, biorące udział w przenoszeniu lub transportowaniu danego środka z jednego narządu, lub części ciała, do innego narządu, lub części ciała. Każdy nośnik musi być dopuszczalny" czyli być zgodny z innymi składnikami preparatu i nieszkodliwy dla pacjenta. Stosowane tu określenie ludzki TNF " (przedstawione tu za pomocą skrótu htnf, lub po prostu htnf) dotyczy ludzkiej cytokiny, która występuje w postaci 17 kd wydzielanej i postaci 26 kd związanej z błoną, której biologicznie czynna postać składa się z trimeru niekowalencyjnie związ a- nych cząsteczek 17 kd. Budowę htnf opisano dokładniej np. w Pennica, D., i in. (1984) Nature 312: ; Davis, J.M., i in. (1987) Biochemistry 26: ; i Jones, E.Y., i in. (1989) Nature 338: Określenie ludzki TNF " obejmuje rekombinowany ludzki TNF (rhtnf ), który można wytworzyć za pomocą standardowych sposobów rekombinacyjnej ekspresji lub nabyć drogą kupna (R&D Systems, Catalog nr 210-TA, Minneapolis, MN). Stosowane tu określenie przeciwciało" odnosi się do cząsteczek immunoglobulin składających się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwóch łańcuchów ciężkich (H) i dwóch łańcuchów lekkich (L) połączonych ze sobą wiązaniami disulfidowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (określanego tu skrótem HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się trzech domen, CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (określanego tu skrótem LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL mogą być dalej podzielone na regiony hiperzmienne, nazywane regionami określającymi komplementarność (CDR), położone naprzemiennie z regionami o mniejszej zmienności, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech regionów CDR i czterech regionów FR, uszeregowanych w następującej kolejności od końca aminowego do końca karboksylowego: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. W jednej postaci wynalazku, preparat zawiera przeciwciało o sekwencjach CDR1, CDR2 i CDR3, takimi jak te przedstawione w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Stosowane tu określenie część przeciwciała wiążąca antygen" (lub po prostu część przeciwciała") odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność

8 8 PL B1 swoistego wiązania z antygenem (np. htnf ). Wykazano, że fragmenty pełnej długości przeciwciał mogą spełniać rolę przeciwciał polegającą na wiązaniu antygenu. Przykłady fragmentów wiążących objętych określeniem część przeciwciała wiążąca antygen" obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab') 2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab związane mostkiem disulfidowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH przeciwciał jednoramiennych, (v) fragment dab (Ward i in., (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny VH; i (vi) wyizolowany region określający komplementarność (CDR). Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez odrębne geny, mogą być one połączone, przy zastosowaniu metod rekombinacyjnych, za pomocą syntetycznej grupy łączącej, która umożliwia ich powstanie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH łączą się w parę z wytworzeniem jednowartościowej cząsteczki (znanej pod nazwą jednołańcuchowy Fv (scfv); patrz np. Bird i in. (1988) Science 242: ; i Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: ). Określenie część przeciwciała wiążąca antygen" obejmuje także takie jednołańcuchowe przeciwciała. Obejmuje ono również inne postacie jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak fragmenty przeciwciała o podwójnej swoistości (diabody). Fragmenty przeciwciała o podwójnej swoistości są dwuwartościowymi, swoistymi względem dwóch antygenów przeciwciałami, których domeny VH i VL ulegają ekspresji w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, za pomocą grupy łączącej zbyt krótkiej by umożliwić łączenie się dwóch domen takiego samego łańcucha, co powoduje łączenie się tych domen z komplementarnymi domenami innych łańcuchów w rezultacie tworząc dwa miejsca wiążące antygen (patrz np. Holliger, P., i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: ; Poljak, R.J., i in. (1994) Structure 2: ). W jednej postaci wynalazku, preparat zawiera fragment wiążący antygen przedstawiony w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Ponadto, przeciwciało lub jego część wiążącą antygen może stanowić część większej cząsteczki immunoadhezyjnej, utworzonej przez kowalencyjne lub niekowalencyjne wiązanie przeciwciała lub części przeciwciała z jednym lub większą liczbą innych białek lub peptydów. Przykłady takich cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzeniowego streptawidyny w celu wytworzenia tetramerycznej cząsteczki scfv (Kipriyanov, S.M., i in. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) oraz zastosowanie reszty cysteinowej, markera peptydowego i C-końcowego znacznika polihistydynowego w celu wytworzenia dwuwartościowej i biotynylowanej cząsteczki scfv (Kipriyanov, S.M., i in. (1994) Mol. Immunol. 3J,: ). Fragment przeciwciała, taki jak fragmenty Fab i F(ab ) 2 można wytworzyć z całego przeciwciała stosując typowe techniki, takie jak trawienie całych przeciwciał papaina lub pepsyną. Ponadto, przeciwciała, fragmenty przeciwciał i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymać stosując, jak opisano, standardowe techniki rekombinowacji DNA. Stosowane tu określenie ludzkie przeciwciało", obejmuje przeciwciała o zmiennych i stałych regionach pochodzących z sekwencji immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasów niekodowanych przez sekwencje immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych (np. w wyniku losowych lub ukierunkowanych mutacji in vitro lub w wyniku mutacji somatycznych in vivo), np. w CDR, a w szczególności w CDR3. Jednakże, stosowane tu określenie ludzkie przeciwciało" nie obejmuje przeciwciał, w których sekwencje CDR pochodzące z komórek zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak. mysz, zostały wszczepione do ludzkich sekwencji zrębowych. Stosowane tu określenie rekombinowane ludzkie przeciwciało" obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała przygotowywane, ulegające ekspresji, wytwarzane lub izolowane za pomocą metod rekombinacji, takie jak przeciwciała ulegające ekspresji z zastosowaniem zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, którym transfekowano komórki gospodarzy (co dokładniej opisano poniżej w rozdziale II), przeciwciała izolowane ze biblioteki kombinatorycznej rekombinowanych ludzkich przeciwciał (co dokładniej opisano poniżej w rozdziale III), przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które są transgeniczne dla ludzkich genów immunoglobuliny (patrz np. Taylor, L.D., i in. (1992) Nucl. Acids Res. 20: ) lub przeciwciała przygotowane, ulegające ekspresji, wytworzone lub izolowane za pomocą jakichkolwiek innych sposobów polegających na składaniu sekwencji ludzkiego genu immunoglobuliny wraz z innymi sekwencjami DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają zmienne i stałe regiony pochodzące od sekwencji immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych. W niektórych postaciach, jednakże, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała poddaje się mutagenezie in vitro (lub, przy użyciu zwierząt transgenicznych dla ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej

9 PL B1 9 in vivo), a zatem, sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które pomimo, że pochodzą od i są pokrewne sekwencjom VH i VL ludzkich komórek zarodkowych, mogą nie występować w sposób naturalny in vivo w repertuarze przeciwciał ludzkich komórek zarodkowych. Stosowane tu określenie wyizolowane przeciwciało" odnosi się do przeciwciał zasadniczo wolnych od innych przeciwciał o odmiennych właściwościach antygenowych (np. wyizolowane przeciwciało, które wiąże się swoiście z htnf będące zasadniczo wolne od przeciwciał swoiście wiążących antygeny inne niż htnf ). Wyizolowane przeciwciało, które wiąże się swoiście z htnf może, jednakże, przejawiać reaktywność krzyżową względem innych antygenów, takich jak cząsteczki TNF od innych gatunków. Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych substancji komórkowych i/lub środków chemicznych. Stosowane tu określenie przeciwciało neutralizujące", (lub przeciwciało neutralizujące aktywność htnf ") dotyczy przeciwciał, których związanie się z htnf powoduje hamowanie aktywności biologicznej htnf. Hamowanie aktywności biologicznej htnf można określić za pomocą pomiaru jednego lub większej liczby wskaźników aktywności biologicznej htnf, takich jak działanie cytotoksyczne spowodowane przez htnf (in vitro albo in vivo), aktywacja komórek wywołana przez htnf i wiązanie się htnf z receptorami htnf. Te wskaźniki aktywności biologicznej htnf można oszacować za pomocą jednego lub większej liczby z kilku standardowych, znanych w dziedzinie, testów in vitro lub in vivo, przedstawionych w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Korzystnie, zdolność przeciwciała do neutralizacji aktywności htnf określa się poprzez hamowanie cytotoksyczności wywołanej przez htnf względem komórek L929. Jako dodatkowy lub alternatywny parametr aktywności htnf można określić zdolność przeciwciała do hamowania ekspresji ELAM-1 na HUVEC wywołanej przez htnf, jako wskaźnik aktywacji komórek wywołanej przez htnf. Stosowane tu określenie technika powierzchniowego rezonansu plazmonowego", dotyczy zjawiska optycznego umożliwiającego analizę swoistych biologicznych oddziaływań w czasie rzeczywistym za pomocą wykrywania zmian w stężeniu białka w macierzy czujników biologicznych, np. stosując układ BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, NJ). Dokładniejszy opis, patrz Jonsson, U., i in. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i in. (1991) Biotechniques 11: ; Johnsson, B., i in. (1995) J. Mol Recognit. 8: ; i Johnsson, B., i in. (1991) Anal. Biochem. 198: Stosowane tu określenie K off " oznacza stałą dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen. Stosowane tu określenie K d " odnosi się do stałej dysocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało-antygen. II. Przeciwciała preparatu Wynalazek dotyczy płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego przeciwciała w ilości skutecznej terapeutycznie w roztworze buforowym powodującym, że ph preparatu mieści się pomiędzy około 4 i około 8, a cały preparat ma przedłużony dopuszczalny okres przechowywania, wynoszący korzystnie co najmniej około 18 miesięcy. W innej postaci, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego według wynalazku ma zwiększoną trwałość. W kolejnej postaci wynalazku, preparat nie jest wrażliwy na światło. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku pozostaje trwały po co najmniej 3 cyklach zamrażanie/rozmrażanie. W jeszcze innej postaci, preparat farmaceutyczny według wynalazku jest odpowiedni do pojedynczego zastosowania jako zastrzyk podskórny. Przeciwciała, które można stosować w preparacie obejmują przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, rekombinowane, jednołańcuchowe, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, lub ich fragmenty. Stosować można także cząsteczki o budowie podobnej do przeciwciał zawierające jedno lub dwa miejsca wiążące antygen oraz fragment Fc immunoglobulin. Przykładem cząstki o budowie podobnej do przeciwciał jest składnik czynny: etanercept lub infliksimab. Przeciwciałami korzystnymi do zastosowania w preparacie są przeciwciała ludzkie, które klonuje się z ludzkich komórek lub z archiwów genowych stanowiących zasób ludzkich przeciwciał. Pośród ludzkich przeciwciał, szczególnie korzystne są przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi TNF, w tym ludzkiemu TNF (czyli htnf ).

10 10 PL B1 W jednej postaci, preparat według wynalazku zawiera połączenie przeciwciał (dwóch lub większej liczby) lub koktaj1" przeciwciał. Przykładowo, preparat może zawierać przeciwciało D2E7 i jedno lub większą liczbę przeciwciał dodatkowych. W korzystnej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 m lub mniej i stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, przy czym obie stałe określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. Preparat według wynalazku może zawierać przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, tak jak to przedstawiono w opisie patentowym US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Preparat według wynalazku może zawierać przeciwciała D2E7 i fragmenty przeciwciał, przeciwciała pokrewne D2E7 i fragmenty przeciwciał, oraz inne ludzkie przeciwciała i fragmenty przeciwciał o właściwościach odpowiadających D2E7, takich jak wiązanie się z dużym powinowactwem z htnf o powolnej kinetyce dysocjacji i dużej zdolności do neutralizacji. Korzystnie, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, co określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. Wyizolowane ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, może dysocjować od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej, lub nawet korzystniej, ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniej. Wyizolowane ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, może powodować zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-8 M lub mniej, a jeszcze korzystniej, z IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej, a jeszcze korzystniej z IC 50 wynoszącym 5 x M lub mniej. Preparat może zawierać przeciwciało, które jest wyizolowanym rekombinowanym przeciwciałem ludzkim, lub jego częścią wiążącą antygen. Preparat może zawierać przeciwciało, które neutralizuje również aktywację komórek wywołaną przez TNF, co oszacowano stosując standardowy test wykrywający ekspresję ELAM-1 na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) wywołaną przez TNF in vitro. III. Wytwarzanie preparatu Wynalazek dotyczy preparatów (np. preparatów białkowych i/lub preparatów przeciwciał) o lepszych właściwościach w porównaniu z preparatami uznanymi w dziedzinie. Przykładowo, preparaty według wynalazku mają dłuższy dopuszczalny okres przechowywania i/lub większą trwałość w porównaniu z preparatami uznanymi w dziedzinie. W korzystnym aspekcie, preparaty według wynalazku zawierają białko w dużym stężeniu, np. stężenie białka powyżej około 45 mg/ml, stężenie białka powyżej około 50 mg/ml, stężenie białka powyżej około 100 mg/ml. W korzystnej postaci, przeciwciałem jest przeciwciało D2E7. Wynalazek dotyczy także wodnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej poliol, środek powierzchniowo czynny i układ buforujący zawierający cytrynian i/lub fosforan o ph około 4 do 8, w ilości wystarczającej do wytworzenia przeciwciała do zastosowania terapeutycznego w stężeniu przekraczającym około np. 45 mg/ml. Wytwarzanie danego przeciwciała przeprowadza się standardowymi sposobami znanymi w dziedzinie. W korzystnej postaci wynalazku, zastosowane w preparacie przeciwciało ulega ekspresji w komórkach CHO, a następnie oczyszcza się je za pomocą serii standardowych etapów chromatografii. W kolejnej korzystnej postaci, przeciwciało skierowane jest przeciwko htnf i wytwarza się je zgodnie ze sposobami przedstawionymi w opisie patentowym US nr i , załączonymi tu na zasadzie odsyłacza. Po wytworzeniu danego przeciwciała, wytwarza się preparat farmaceutyczny zawierający to przeciwciało. Skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała występującego w preparacie określa się np. biorąc pod uwagę pożądaną objętość dawki i sposób (sposoby) podawania. W jednej postaci wynalazku, stężenie przeciwciała w preparacie mieści się pomiędzy około 30 do około 120 mg przeciwciała na ml płynnego preparatu. W kolejnej korzystnej postaci, stężenie przeciwciała w preparacie mieści się pomiędzy około 25 do około 50 mg/ml. W korzystnej postaci, stężenie przeciwciała wynosi 50 mg/ml. W innej postaci wynalazku, stężenie przeciwciała w preparacie wynosi około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, lub około 75 mg/ml. Wynalazek obejmuje również pośrednie zakresy wymienionych stężeń. Przykładowo, wynalazek obejmuje jaki-

11 PL B1 11 kolwiek zakres wartości będący kombinacją dowolnych z powyższych wartości jako górnej i/lub dolnej granicy. W jednej postaci, wynalazek dotyczy preparatu o przedłużonym dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierającego składnik czynny, korzystnie przeciwciało, w połączeniu z mannitolem, monohydratem kwasu cytrynowego, cytrynianem sodu, dihydratem fosforanu disodu, dihdratem diwodorofosforanu sodu, chlorkiem sodu, Polysorbate 80, wodą i wodorotlenkiem sodu. W kolejnej postaci, preparat według wynalazku ma przedłużony dopuszczalny okres przechowywania w stanie ciekłym, wynoszący co najmniej około 18 miesięcy. W celu dalszego wydłużenia dopuszczalnego okresu przechowywania można również stosować zamrażanie preparatu według wynalazku. Preparat w postaci roztworu wodnego wytwarza się umieszczając przeciwciało w roztworze buforowym. Bufor według wynalazku utrzymuje ph w zakresie od około 4 do około 8, korzystnie od około 4,5 do około 6,0, korzystniej od około 4,8 do około 5,5, a najkorzystniej, utrzymuje ph pomiędzy około 5,0 do około 5,2. Zakresy pośrednie względem wymienionych wartości ph także wchodzą w zakres wynalazku. Przykładowo, wynalazek obejmuje także zakresy wartości wykorzystujące kombinację dowolnej z wyżej wymienionych wartości jako górną i/lub dolną granicę. Przykłady buforów, które regulują ph w tym zakresie obejmują octan (np. octan sodu), bursztynian (taki jak bursztynian sodu), glukonian, histydynę, cytrynian i inne bufory na bazie kwasów organicznych. W korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera układ buforujący, w którego skład wchodzi cytrynian i fosforan w celu utrzymywania ph w zakresie od około 4 do około 8. W kolejnej korzystnej postaci, zakres ph wynosi od około 4,5 do około 6,0, korzystniej od około ph 4,8 do około 5,5, a najkorzystniej od około 5,0 do około 5,2. W kolejnej korzystnej postaci, układ buforujący zawiera monohydrat kwasu cytrynowego, cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu i/lub dihydrat diwodorofosforanu sodu. W kolejnej korzystnej postaci, układ buforujący zawiera około 1,3 mg/ml kwasu cytrynowego (np. 1,305 mg/ml), około 0,3 mg/ml cytrynianu sodu (np. 0,305 mg/ml), około 1,5 mg/ml dihydratu fosforanu disodu (np. 1,53 mg/ml), około 0,9 mg/ml di hydratu diwodorofosforanu sodu (np. 0,86) oraz około 6,2 mg/ml chlorku sodu (np. 6, 165 mg/ml). W kolejnych korzystnych postaciach, układ buforujący zawiera 1-1,5 mg/ml kwasu cytrynowego, 0,25 do 0,5 mg/ml cytrynianu sodu, 1,25 do 1,75 mg/ml dihydratu fosforanu disodu, 0,7 do 1,1 mg/ml dihydratu diwodorofosforanu sodu oraz 6,0 do 6,4 mg/ml chlorku sodu. W kolejnej postaci, ph preparatu reguluje się wodorotlenekiem sodu. W skład preparatu wchodzi także poliol, który działa jako środek regulujący osmotyczność i może stabilizować przeciwciało. Poliol dodaje się do preparatu w ilości, która zależy od pożądanego stopnia izotoniczności preparatu. Korzystnie, preparat w postaci roztworu wodnego jest izotoniczny. Ilość dodawanego poliolu może także zależeć do masy cząsteczkowej poliolu. Przykładowo, w porównaniu z disacharydem (takim jak trehaloza) można dodać mniejszą ilość monosacharydu (np. mannitolu). W korzystnej postaci wynalazku, poliolem stosowanym w preparacie jako środek osmotyczny jest mannitol. W korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około 5 do 20 mg/ml. W kolejnej korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około 7, 5 do 15 mg/ml. W korzystniejszej postaci preparatu według wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około mg/ml. W najkorzystniejszej postaci, stężenie mannitolu wynosi około 12 mg/ml. W innej postaci wynalazku, poliolem wchodzącym w skład preparatu jest sorbitol. Do preparatu przeciwciał dodaje się także detergent lub środek powierzchniowo czynny. Przykładowe detergenty obejmują detergenty niejonowe, takie jak polisorbaty (np. Polysorbate 20, 80 itp.) lub poloksamery (np. Poloxamer 188). Dodaje się taką ilość detergentu, aby następowało zmniejszenie agregacji przeciwciała i/lub minimalizacja powstawania cząstek w preparacie i/lub zmniejszanie adsorpcji. W korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera środek powierzchniowo czynny, którym jest polisorbat. W kolejnej korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera detergent, którym jest Polysorbate 80 lub Tween 80. Tween 80 jest określeniem używanym dla polioksyetylenowanego (20) monooleinianu sorbitolu (patrz Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, wydanie 4, 1996). W korzystnej postaci, preparat zawiera pomiędzy około 0,1 i około 10 mg/ml Polysorbate 80, korzystniej pomiędzy około 0,5 i około 5 mg/ml. W kolejnej korzystnej postaci, w preparacie według wynalazku znajduje się około 0,1% Polysorbate 80. W korzystnej postaci wynalazku, preparat jest 0,8 ml roztworem w fiolce zawierającym składniki przedstawione w tabeli 1, poniżej.

12 12 PL B1 T a b e l a 1 Jedna fiolka 0,8 ml roztworu do wstrzykiwania 1 ) zawiera: Składnik Ilość Funkcja substancja czynna: przeciwciało (D2E7) 2) 40,0 mg substancja czynna zaróbki: mannitol 9,6 mg środek osmotyczny monohydrat kwasu cytrynowego kwas cytrynowy 1,044 mg bufor cytrynian sodu cytrynian sodu 0,244 mg bufor dihydrat fosforanu disodu dihydrat dwuzasadowego fosforanu sodu dihydrat diwodorofosforanu sodu dihydrat jednozasadowego fosforanu sodu 1,224 mg bufor 0,688 mg bufor chlorek sodu 4,932 mg środek osmotyczny Polysorbate 80 0,8 mg detergent woda do iniekcji woda do iniekcji 759, ,048 mg rozpuszczalnik wodorotlenek sodu 3) 0,02-0,04 mg regulacja ph Łącznie 817,6 mg 1) Gęstość roztworu: 1,022 g/ml 2) Stosuje się jako koncentrat 3) Dodaje się jako roztwór 1M W jednej postaci, preparat zawiera wymienione powyżej substancje (tj. przeciwciało, bufor, poliol i detergent) i jest zasadniczo wolny od jednego lub większej liczby środków konserwujących, takich jak alkohol benzylowy, fenol, m-krezol, chlorobutanol i chlorek benzetonium. W innej postaci, preparat może zawierać środek konserwujący, szczególnie wtedy, gdy preparat jest preparatem wielodawkowym. Preparat może zawierać jeden lub większą liczbę innych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, zaróbek lub stabilizatorów, takich jak te opisane w Remington's Pharmaceutical Sciences wydanie 16, red. Osol, A. (1980), pod warunkiem, że nie wpływają one w sposób istotny szkodliwie na pożądane właściwości preparatu. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach oraz stężeniach i obejmują: dodatkowe bufory; współrozpuszczalniki; przeciwutleniacze, w tym kwas askorbinowy i metioninę; środki chelatujące, takie jak EDTA; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); biodegradowalne polimery, takie jak poliestry; i/lub przeciwjony tworzące sole, takie jak sodowe. Zgodnie z koniecznością wynikającą z danego leczonego stanu, opisywany preparat można także połączyć z jednym lub większą liczbą innych środków terapeutycznych, korzystnie o działaniu uzupełniającym, nie wpływającymi szkodliwie na przeciwciała preparatu. Takie środki terapeutyczne występują w preparacie w odpowiedniej ilości, która jest skuteczna do zamierzonego celu. Dodatkowe środki terapeutyczne, które można łączyć z preparatem według wynalazku przedstawiono bardziej szczegółowo w opisach patentowych US nr i , z których każdy załącza się tu na zasadzie odsyłacza. Preparaty przeznaczone do podawania in vivo muszą być sterylne. Daje się to łatwo uzyskać za pomocą filtracji przez sterylizujące membrany filtracyjne przed lub po wytworzeniu preparatu. IV. Podawanie preparatu Preparat według wynalazku można stosować ze wskazań podobnych do tych przedstawionych w opisach patentowych US nr i , z których oba załącza się tu na zasadzie odsyłacza, oraz szczegółowo opisanych poniżej. Określenie skuteczna ilość" preparatu oznacza ilość konieczną lub wystarczającą do hamowania aktywności TNF, np. zapobiegania różnym objawom morfologicznym i somatycznym zaburzenia wywoływanego przez szkodliwe działanie TNF. W innej postaci, skuteczna ilość preparatu oznacza ilość konieczną do uzyskania pożądanego skutku. Przykładowo, skuteczna ilość preparatu oznacza