ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI

Transkrypt

1 ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI Monografie i Rozprawy INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY 2010 KRAKÓW 44

2 REDAKCJA Redaktor naczelny dr hab. Sylwester Świątkiewicz, prof. nadzw. IZ PIB Zastępcy redaktora naczelnego prof. dr hab. Ewa Słota, prof. dr hab. Mariusz Pietras Sekretarz redakcji mgr Magdalena Bielska Projekt okładki Beata Barszczewska-Wojda Adres redakcji Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, ul. Sarego 2, Kraków Copyright by Instytut Zootechniki PIB Druk: Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Zespół Wydawnictw i Poligrafii, Balice k. Krakowa. Nakład 150 egz. PL ISSN ISBN

3 ROCZNIKI NAUKOWE ZOOTECHNIKI Monografie i Rozprawy Zastosowanie osiągnięć naukowych z zakresu genetyki i biotechnologii rozrodu w nowoczesnej produkcji trzody chlewnej INSTYTUT ZOOTECHNIKI PAŃSTWOWY INSTYTUT BADAWCZY KRAKÓW 2010

4 Recenzenci pracy dr hab. prof. nadzw. Agnieszka Korwin-Kossakowska, Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Jastrzębiec prof. dr hab. Barbara Rejduch, Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Kraków Opracowanie redakcyjne mgr Magdalena Bielska

5 Wstęp Nowoczesna produkcja trzody chlewnej jest w zasadzie niczym innym jak umiejscowieniem tego procesu w aktualnych warunkach ekonomicznych. Wiąże się to bezpośrednio z opłacalnością produkcji, a zatem bilansem kosztów związanych z otrzymaniem tucznika i ceną, jaką się za niego uzyska. Może się wydawać, że jest to zadanie dla ekonomistów, a nie dla biologów czy zootechników. Jeśli jednak popatrzymy szerzej na to zagadnienie, okaże się, że właśnie ci ostatni mogą znacząco przyczynić się do zmniejszenia kosztów produkcji, dając pewne rozwiązania wynikające z przeprowadzenia badań. W przedstawionej monografii zwrócono uwagę na dwa ważne zagadnienia, a mianowicie prace z zakresu genetyki i biotechnologii, które często nie są brane pod uwagę w procesie hodowlano-produkcyjnym, a mają duży wpływ na jego opłacalność. Jedną z przyczyn, powodujących zmniejszenie wskaźników użytkowości rozpłodowej, jest nieprawidłowy kariotyp zwierząt. Kariotyp taki może występować u prawidłowo zbudowanych zwierząt i nie mieć wpływu na parametry nasienia w przypadku knurów. Użycie takich osobników, szczególnie w celu pozyskiwaniu nasienia do inseminacji, może być powodem szybkiego rozprzestrzeniania się wad, powodując straty w hodowli i produkcji o istotnym znaczeniu ekonomicznym. Można temu zapobiec poprzez wczesne diagnozowanie i eliminowanie zwierząt dotkniętych aberracjami chromosomowymi. Ważnym elementem, zmniejszającym koszty produkcji, jest posiadanie w chowie zwierząt o wysokiej wartości genetycznej. Prace z tego zakresu prowadzi się poprzez doskonalenie części krajowej populacji zwanej populacją aktywną, która również nazywa się populacją zarodową. Uzyskany tam postęp zostaje przenoszony do populacji produkcyjnej poprzez rozprowadzanie osobników męskich i żeńskich. Podstawą prac selekcyjnych jest ocena zwierząt, która musi być dokładna, bowiem od tego zależy postęp hodowlany. Należy nadmienić, że jest to również związane z kosztami. Optymalne, z uwagi na osiągnięcie wysokiego postępu hodowlanego, jest ocenienie z odpowiednią dokładnością dużej liczby zwierząt. Możliwości takie istnieją wówczas, gdy do oceny wartości genetycznej zwierząt zastosuje się markery genetyczne. Zastosowanie w ocenie wartości hodowlanej markerów genetycznych jest również korzystne, gdyż można ją przeprowadzać w młodym wieku zwierząt, co nie tylko pozwala na objęcie nią dużej ich liczby, ale też zmniejszenie kosztów z nią związanych. Szczególnie dotyczy to cech jakościowych mięsa, które można ocenić w zasadzie po uboju zwierzęcia.

6 6 M. Różycki Niezmiernie ważnym elementem w produkcji świń jest prawidłowy rozród, gdyż gwarantuje wysoką użytkowość rozpłodową. Szacuje się, że produkcja żywca wieprzowego może być opłacalna (przy odpowiednich relacjach cen: pasza żywiec), gdy otrzyma się od lochy w roku co najmniej 21 prosiąt, które ukończą tucz. Tuczniki te muszą charakteryzować się dobrą mięsnością, co w dużym stopniu gwarantuje pochodzenie po dobrej jakości ojcu. Liczba takich knurów jest ograniczona, zatem wskazane jest ich bardzo intensywne wykorzystanie, co można uzyskać stosując inseminację. Będzie ona efektywna wtedy, gdy użyte w niej knury będą charakteryzowały się dobrą jakością nasienia. Z punktu widzenia efektywności inseminacyjnego użytkowania knura istotna jest liczba ruchliwych plemników w ejakulacie, ponieważ od niej zależy liczba możliwych do wykonania dawek inseminacyjnych. Należy nadmienić, że nie tylko ilość plemników gwarantuje zapłodnienie odpowiedniej liczby komórek jajowych, ale również ich jakość. W związku z tym poszukuje się nowych metod laboratoryjnej oceny nasienia. Podane w niniejszym opracowaniu metody dadzą możliwość kompleksowej jego oceny, co może znacznie poprawić efektywność zabiegów inseminacyjnych. Świnie są gatunkiem zwierząt, które mogą być w przyszłości wykorzystane do pozyskiwania narządów używanych w ksenotransplantacji. Aby to nastąpiło, należy stworzyć transgeniczne zwierzęta, których narządy nie byłyby odrzucane przez ludzki organizm. Prace te wymagają pozyskiwania odpowiedniej ilości oocytów oraz ich konserwacji. Z tych powodów uważano za celowe umieszczenie w monografii prac z tego zakresu. Dążąc do zwiększenia efektywności produkcji tuczników, można część prosiąt przeznaczonych do tuczu uzyskiwać od pierwiastek, które następnie są przeznaczone na ubój. Przy dobrych cenach żywca można w ten sposób obniżyć koszt wyprodukowania prosiąt. Postępowanie takie będzie jednak efektywne tylko wtedy, gdy pierwiastki po odchowaniu prosiąt będą stanowiły pełnowartościowy materiał rzeźny. Aby spełnić ten warunek, proponuje się przyspieszyć dojrzałość płciową loszek przeznaczonych do produkcji prosiąt. Można tego dokonać poprzez ich odpowiednie żywienie, stosując dietę zawierającą łatwo strawne węglowodany. Badania wykazały, że takie postępowanie pozwala na pozyskiwanie od loszek jednorazówek mięsa dobrej jakości, nie różniącego się od mięsa zwierząt tuczonych standardowo, przy możliwie pełnym i wczesnym wykorzystaniu ich zdolności reprodukcyjnych. prof. dr hab. Marian Różycki

7 CZĘŚĆ I. ZASTOSOWANIE OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH Z ZAKRESU GENETYKI

8

9 Zastosowanie metod cytogenetyki molekularnej w diagnozie i profilaktyce wad genetycznych u świń* * E w a S ł o t a, B a r b a r a D a n i e l a k - C z e c h Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Dział Immuno- i Cytogenetyki Zwierząt, Balice k. Krakowa Wzrost produkcyjności trzody chlewnej w okresie ostatnich kilkudziesięciu lat jest efektem postępu w hodowli świń związanego z szerokim zastosowaniem najnowszych osiągnięć nauk zootechnicznych i biologicznych. Dotyczy to przede wszystkim wprowadzania do badań genetycznych technik biologii molekularnej (klonowanie molekularne, amplifikacja fragmentów DNA metodą PCR, sekwencjonowanie DNA, hybrydyzacja in situ ISH, identyfikacja polimorfizmu sekwencji mikrosatelitarnych), które przyczyniły się do poszerzenia wiedzy o molekularnym podłożu zmienności cech produkcyjnych. Cytogenetyka molekularna (techniki hybrydocytochemiczne: FISH, PCR/RT- PCR in situ, PRINS, CGH) odgrywa istotną rolę w badaniach struktury, funkcji i zmian chromosomów metafazowych lub interfazowych (w komórkach somatycznych, rozrodczych, zarodkowych), zapewniając znaczący postęp w zakresie genomiki strukturalnej świni domowej (Pinkel i in., 1986; Basrur i Stranzinger, 2008; Świtoński, 2008; Rubeš i in., 2009). Analiza molekularna obejmująca techniki FISH coraz częściej znajduje zastosowanie w praktyce hodowlanej jako uzupełnienie klasycznej diagnostyki cytogenetycznej, niezbędnej do identyfikacji i charakterystyki wad genetycznych uwarunkowanych aberracjami chromosomowymi oraz oceny ich skutków biologicznych i populacyjnych (Charon i Świtoński, 2000; Świtoński i in., 2006; Villagόmez i Pinton, 2008; Rubeš i in., 2009). Podstawą konwencjonalnej diagnostyki cytogenetycznej jest mikroskopowa analiza chromosomów metafazowych uzyskanych metodą hodowli limfocytów krwi in vitro (Moorhead i in., 1960; Arakaki i Sparkes, 1963) i barwionych nieróżnicująco odczynnikiem Giemsy, co pozwala określić diploidalną liczbę 2n = 38 i morfologię Praca wykonana w ramach programu wieloletniego finansowanego przez MRiRW, zadanie nr

10 10 E. Słota i B. Danielak-Czech chromosomów wyznaczoną położeniem centromeru). Kolejny etap diagnostyczny to różnicujące barwienie prążkowe QFQ, GTG lub RBA (i jego modyfikacje) (o rozdzielczości 5 10 mln par zasad), które umożliwia identyfikację 19 par chromosomów homologicznych na podstawie podobieństwa długości, typu morfologicznego i układu prążków poprzecznych Q, G, R (autosomy submetacentryczne: 1 5; subtelocentryczne: 6, 7; metacenytryczne: 8 12 i heterosomy płci X, Y; telocentryczne/ akrocentryczne: 13 18) (Caspersson i in., 1968; Wang i Fedorrof, 1972; Dutrillaux i in., 1973; Gustavsson,1980; Charon i Świtoński, 2000; Świtoński i in., 2006). Dopełnieniem podstawowych metod prążkowych jest barwienie ujawniające lokalizację specyficznych regionów chromosomów: heterochromatyny konstytutywnej prążki C (centromery autosomów i chromosomu X, ramię p heterosomu Y); obszary jąderkotwórcze prążki Ag-I (przycentromerowy rejon ramion p chromosomów par 8 i 10); rejony telomerowe prążki T (telomery ramion p i q) (Dutrillaux, 1973; Dutrillaux i in., 1973; Bloom i Goodpasture, 1976; Howell i Black, 1980; Sumner, 1983; Gustavsson, 1980; Charon i Świtoński, 2000; Świtoński i in., 2006). Zastosowanie opisanej procedury diagnostycznej umożliwia ustalenie kariotypu komórek somatycznych konkretnego osobnika na podstawie porównania indywidualnego wzoru prążkowego na chromosomach ze standardowym dla gatunku układem 300 prążków Q, G i R w haploidalnym zestawie chromosomów, opracowanym w formie wzorca kariotypu Sus strofa domestica L. (Ford i in., 1980; Gustavsson, 1988). Rozszerzeniem standardowej analizy cytogenetycznej są wysoko rozdzielcze techniki prążkowe HRBT (2 5 mln par zasad), których efektem jest obraz 600 prążków i subprążków G lub R w haploidalnym zestawie wydłużonych chromosomów prometafazowych (uzyskanych według zmodyfikowanej procedury hodowli limfocytów krwi z zahamowaniem replikacji i kondensacji chromosomów), odpowiadający wzorcom kariotypu opracowanym dla chromosomów prometafazowych świni domowej (Yunis, 1976; Rønne, 1989, 1990 a, b; Galman i in., 1991; Yerle i in., 1991; Świtoński i in., 2006). Techniki prążkowe są podstawowym narzędziem w cytogenetycznych badaniach przesiewowych i diagnostyce nieprawidłowości chromosomowych u świń (Gustavsson, 1988; 1990; Sysa, 1991; Danielak; 1992; Charon i Świtoński, 2000; Świtoński i in., 2006). Efektem monitoringu cytogenetycznego, którym objęto w ciągu ostatnich czterdziestu lat liczne populacje świń na świecie, jest identyfikacja około 200 wad kariotypu, głównie strukturalnych aberracji chromosomowych (ponad 150 translokacji wzajemnych, 3 translokacje Robertsonowskie, 1 tandem-fuzja translokacja, co najmniej kilkanaście inwersji para- i pericentrycznych) oraz nielicznych aneuploidii (39 XXY, 37 X, 40 XXXY) i kilkunastu przypadków chimeryzmu limfocytarnego (Gustavsson, 1990; Long, 1991; Chowdhary, 1998; Basrur i Stranzinger, 2008; Danielak-Czech i Słota, 2008 a, b; Ducos i in., 2007, 2008). Spośród opisanych dotąd u świń mutacji chromosomowych osiem zdiagnozowano w Polsce (wszystkie, z wyjątkiem jednej, w Instytucie Zootechniki PIB w Balicach k. Krakowa) (tab. 1).

11 Cytogenetyka molekularna w diagnozie wad genetycznych u świń 11 Typ aberracji chromosomowej Translokacja wzajemna Tabela 1. Aberracje chromosomowe u świń zdiagnozowane w Polsce Zdiagnozowane przypadki t(7;13)(q13;q26) t(8;14)(p21;q25) t(1;5)(q21;q21) t(9;14)(q14;q23) t(10;13)(q16;q21) Obniżenie płodności nosicieli (śr. liczba prosiąt w miotach %) * 100 * Tandem fuzja-translokacja der(14;17)(q29;q10) * Inwersja inv(8)(p11;p12) inv(1)(p22;q11) * 0 Piśmiennictwo Danielak-Czech i in., 1994, 1996 b, 1997, 2006 Danielak-Czech i in., 1994, 1997 Danielak-Czech i in., 1994 Rejduch i in., 2003, 2006 Danielak-Czech i Słota, 2007, 2008 Danielak-Czech i Słota, 2008 Danielak-Czech i in., 2010 Świtoński, 1991, Danielak-Czech i in., 1996 a Świtoński i in., 1998 Charakterystyczną cechą kariotypu świni domowej jest wyjątkowo częste występowanie rearanżacji strukturalnych, które pojawiają się na ogół de novo jako rezultat pęknięć w niestabilnych regionach genomu (miejscach łamliwych chromosomów fragile sites) pod wpływem szkodliwego działania czynników środowiskowych (Yunis i in., 1987; Rubeš i in., 1991, 1992; Danielak-Czech i Słota, 2002; Słota i Danielak-Czech, 2002; Danielak-Czech i Słota, 2004; Danielak-Czech, 2005). Nie stwierdzono dotąd u tego gatunku dwóch identycznych aberracji strukturalnych u niespokrewnionych osobników, zaobserwowano jednak, że są one efektem powtarzających się, nielosowych pęknięć chromatyd, zarówno pod względem zaangażowania poszczególnych chromosomów, jak i ich regionów (Gustavsson, 1990; Long, 1991; Basrur i Stranzinger, 2008; Ducos i in., 2002, 2007, 2008). W przypadkach translokacji wzajemnych, które dominują wśród nieprawidłowości kariotypu świń i dotyczą wszystkich chromosomów autosomalnych i heterosomów płci (najczęściej chromosomów par 1, 6, 7, 11, 13, 14 i 15), punkty pęknięć w większości korelują z 60 miejscami łamliwymi (indukowanymi niedoborem folianów lub działaniem mutagenów w warunkach in vitro) w pozytywnych lub negatywnych prążkach G/R (Riggs i in., 1993; Yang i Long, 1993; Rønne i in., 1994; Rønne, 1995; Chowdhary, 1998; Riggs i Rønne, 2009). Nosicielstwo wad kariotypu wiąże się zwykle z niepłodnością lub obniżoną płodnością (sporadycznie powiązaną z cechami fenotypu obojnaczego), przesądzając o niskiej przydatności rozpłodowej zwierząt hodowlanych obarczonych tymi nieprawidłowościami. Wady te nie mogą być rozpoznane bez przeprowadzenia diagnostyki cytogenetycznej, ponieważ na ogół występują u osobników o normalnym eksterierze (i prawidłowych parametrach nasienia w przypadku knurów), a poprzez sztuczną inseminację mogą być szybko rozprzestrzeniane w populacjach, powodując straty w hodowli o istotnym znaczeniu ekonomicznym. Można temu zapobiec poprzez wczesne diagnozowanie i eliminację zwierząt dotkniętych aberracjami chromosomowymi, przede wszystkim monitorując cytogenetycznie knury inseminacyjne przed

12 12 E. Słota i B. Danielak-Czech ich wykorzystaniem w rozrodzie. W związku z tym w wielu krajach europejskich funkcjonują systemy kontroli kariotypu knurów utrzymywanych w Stacjach Hodowli i Unasieniania Zwierząt (najdłużej we Francji od ponad 40 lat, w Polsce od 2007 roku realizowany w Instytucie Zootechniki PIB w Balicach) (Popescu i in., 1984; Legault, 1985; Gustavsson, 1990; Bonneau i in., 1991; Long, 1991; Sysa, 1991; Legault i Popescu, 1993; Danielak-Czech i in., 1996 b; Charon i Świtoński, 2000; Świtoński i in., 2006; Danielak-Czech i Słota, 2008; Ducos i in., 2008; Basrur i Stranzinger, 2008; Villagomez i Pinton, 2008). Największym problemem hodowlanym są dziedziczne zrównoważone translokacje wzajemne drastycznie obniżające liczbę prosiąt w miotach (5 100%, całkowita bezpłodność dotyczy nosicieli translokacji X; autosom), nieco mniejszym translokacje Robertsonowskie lub fuzje tandemowe (obniżenie płodności 5 22%) czy inwersje (tylko w nielicznych przypadkach płodność nieznacznie niższa) (Gustavsson, 1990; Long, 1988, 1991; Sysa, 1991; Charon i Świtoński, 2000; Benet i in., 2005; Świtoński i in., 2006; Basrur i Stranzinger, 2008; Ducos i in., 2008; Villagomez i Pinton, 2008). Przyczyną obniżenia płodności nosicieli wad kariotypu są zaburzenia procesu gametogenezy spowodowane nieprawidłową koniugacją i segregacją nietypowych struktur chromosomowych (tetrawalent, triwalent, uniwalent zamiast charakterystycznych biwalentów), co prowadzi do powstawania gamet, a po ich zapłodnieniu zarodków o niezrównoważonym kariotypie, które eliminowane są we wczesnych etapach rozwoju (Long, 1988; 1991, Gustavsson, 1990; Sysa, 1991, Świtoński i Stranzinger, 1998; Benet i in., 2005; Rejduch i in., 2006; Villagomez i Pinton, 2008). W związku z tym w przypadku knurów obarczonych aberracjami chromosomowymi, do klasycznej diagnostyki cytogenetycznej włącza się dodatkowe procedury analityczne umożliwiające ocenę przebiegu spermatogenezy w tkankach jąder. Procedury te obejmują analizę procesu koniugacji w spermatocytach I rzędu w stadium pachytenu profazy I podziału mejotycznego przy użyciu techniki uwidaczniania kompleksów synaptonemalnych w mikroskopie świetlnym lub elektronowym oraz badanie mikroskopowe prawidłowości segregacji (barwionych odczynnikiem Giemzy) chromosomów w stadium metafazy I i II w trakcie konwencjonalnej oceny przebiegu mejozy w spermatocytach (Evans i in., 1964; Counce i Meyer, 1973; Wachtler i in., 1986; Villagomez, 1993). Zdiagnozowanie zaburzeń przebiegu mejozy umożliwiło poznanie podłoża niepłodności lub obniżonej płodności osobników obarczonych zrównoważonymi mutacjami chromosomowymi, ze szczególnym uwzględnieniem nosicieli translokacji konstytutywnych (Villagomez, 1993; Świtoński i Stranzinger, 1998; Villagomez i Pinton, 2008). Od kilkunastu lat niezastąpionym narzędziem diagnostycznym w przypadkach kompleksowych rearanżacji międzychromosomowych, mikrorearanżacji wewnątrzchromosomowych (inwersje, delecje, duplikacje) czy obecności chromosomów markerowych stała się analiza molekularna obejmująca techniki fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) (o rozdzielczości 0,5 10 mln par zasad) z wykorzystaniem sond molekularnych o różnym stopniu specyficzności (sondy malujące dla całych chromosomów i ich fragmentów lub specyficzne dla regionów subtelomerowych, telomerowych, centromerowych i określonych loci chromosomowych (Pinkel i in.,

13 Cytogenetyka molekularna w diagnozie wad genetycznych u świń ; Kałużewski i in., 2003; Rubeš i in., 2009). Ze względu na prawie zupełny brak gatunkowo-specyficznych komercyjnych sond (poza sondami dla heterosomów X i Y) w badaniach prowadzonych u świni domowej stosuje się najczęściej sondy malujące oraz sondy będące efektem klonowania insertów genomowego DNA z bibliotek genomowych ( (sondy kosmidowe z insertami DNA <20 40 kb; sondy bakteryjne BAC z insertami DNA kb) (Rubeš i in., 2009). Najbardziej przydatne do analizy genomu świń techniką FISH są chromosomowo-specyficzne sondy malujące uzyskiwane w wyniku sortowania chromosomów (w cytometrze przepływowym) i amplifikacji metodą DOP-PCR lub PARM-PCR oraz technikami igłowej lub laserowej mikrodysekcji chromosomów (dla całych chromosomów i segmentów chromosomów) (Meltzer i in., 1992; Telenius i in., 1992; Milan i in., 1993; Schermelleh i in., 1999; Chowdhary i Raudsepp, 2001; Kubickova i in., 2002; Pinton i in., 2003). Zestaw obecnie dostępnych sond malujących dla gatunku Sus strofa domestica (Cambridge Resource Centre for Comparative Genomics http// obejmuje: sondy sortowane metodą cytometrii przepływowej dla chromosomów SSC1, 13, 18, X, Y (Langford i in., 1992), SSC3, 7, X, Y (Schmitz i in., 1992) i wszystkich chromosomów (Dixon i in., 1992; Langford i in., 1993; Yerle i in., 1993); sondy uzyskane techniką mikrodysekcji dla SSC1p, 13, 15 i chromosomowo-specyficzne dla prążków (Chaudhary i in., 1998), SSC4p, SSC4q (Pinton i in., 2003) i wszystkich chromosomów (Kubickova i in., 2002); sondy komercyjne X;Y mix oraz X i Y. Dostępne są także oligonukleotydowe sondy (startery) stosowane w technice PRINS (primed in situ labeling), umożliwiające wyznakowanie powtarzalnych sekwencji DNA: telomerowych, centromerowych, centromerowych w zestawie chromosomów akrocentrycznych (SSC 13 18) i metacentrycznych (SSC1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 11 i X) oraz chromosomowo-specyficznych (SSC1, 9, 11, 14, Y) (Koch i in., 1989; Pellestor i in., 1995; Rogel-Gaillard i in., 1997; Pinton i in., 1998; Coullin i in., 2002; Rubeš i in., 2009). W identyfikacji nieprawidłowości kariotypu świń najbardziej przydatna okazała się technika FISH z zastosowaniem sond malujących otrzymanych metodą sortowania chromosomów (cytometria przepływowa) oraz technika PRINS znakująca sekwencje centromerowe, dzięki którym potwierdzono lub zweryfikowano punkty pęknięć chromosomów w kilkunastu translokacjach wzajemnych, określone wcześniej na podstawie wzorów prążkowych (Konfortova i in., 1995; Pinton i in., 1998, 2000; Ducos i in., 2002). W diagnozie kilku międzychromosomowych i wewnątrzchromosomowych rearanżacji (translokacje wzajemne, inwersje) dotyczących niewielkich fragmentów chromosomów wykorzystano technikę FISH z sondami malującymi dla całych chromosomów lub ich ramion czy regionów, uzyskanymi metodą mikrodysekcji chromosomów oraz sondami locus-specyficznymi (sekwencje mikrosatelitarne) (Kubickova i in., 2002; Pinton i in., 2002, 2003; Danielak-Czech i in., 2006; Rejduch i in., 2006). Stosując podobne sondy i technikę FISH, przeprowadzono również ocenę częstości spontanicznych stałych aberracji chromosomowych w wybranych populacjach świń (Rezacova i in., 2003).

14 14 E. Słota i B. Danielak-Czech Technika FISH z sondami kosmidowymi lub bakteryjnymi BAC była dotąd sporadycznie wykorzystywana w badaniach rearanżacji chromosomowych, posłużyła tylko do identyfikacji kilku przypadków inwersji peri- i paracentrycznych (Ducos i in., 1997; Massip i in., 2009). Przykładem zastosowania techniki PCR in situ może być cytogenetyczna identyfikacja niestabilnych trzynukleotydowych sekwencji powtarzalnych w miejscach łamliwych chromosomów świni domowej (fragile sites), przeprowadzona metodą mapowania porównawczego (comparative mapping). Stosując znakowane locus specyficzne sondy oligonukleotydowe dla ludzkich sekwencji flankujących powtórzenia CGG i CTG w genach FRM1 i DMPK oraz CCG w przycentromerowym, niekodującym rejonie 16p13 zlokalizowano homologiczne sekwencje trzynukleotydowe w regionach: SSC Xq26, 6q12, 3p12 genomu świni (o wysokim stopniu niestabilności strukturalnej indukowanej mutagenami u loch z zaburzeniami płodności) (Danielak-Czech, 2005; Danielak-Czech i Słota, 2006; Słota i in., 2007; Kaczor i in., 2009). Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ okazała się bardzo przydatna w analizach zestawu chromosomów w główkach zdekondensowanych plemników (sperm- FISH), umożliwiając ustalenie proporcji żeńskich (X) i męskich plemników (Y) oraz częstości aneupoloidii u normalnych osobników, a także ocenę segregacji mejotycznej u nosicieli translokacji wzajemnych, fuzji centrycznych i inwersji (Kawarasaki i in., 1998; Rubeš i in., 1999; Parilla i in., 2003; Pinton i in., 2004, 2009; Massip i in., 2009). Technikę sperm-fish wykorzystano również do przeprowadzenia między- i wewnątrzosobniczej analizy zmienności profili segregacji mejotycznej translokacji wzajemnej oraz określenia potencjalnych efektów międzychromosomowych u nosicieli tego typu aberracji (Massip i in., 2008; Bonnet-Garnier i in., 2009). Technika FISH z sondami malującymi lub chromosomowo-specyficznymi sondami dla satelitarnych sekwencji DNA znalazła też zastosowanie w badaniach mejozy u osobników żeńskich, których celem było określenie częstości aneuploidii w dojrzewających in vitro oocytach metafazy II u loch o normalnym kariotypie oraz nosicielek dwóch translokacji wzajemnych rcp(3;15)(q27;q13), rcp(12;14)(q13;q21) i fuzji centrycznej t(13;17) (Vozdova i in., 2001; Pinton i in., 2005, 2009; Lechniak i in., 2007). Porównanie męskich i żeńskich profili segregacji mejotycznej umożliwiło ocenę wpływu płci na segregację mejotyczną tych rearanżacji. Kolejne eksperymenty dotyczące komórek embrionalnych dowodzą, że metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ stała się przydatnym narzędziem do seksowania zarodków lub wykrywania aneuploidii chromosomowej (Kawarasaki i in., 2000; Zudova i in., 2003; Malekinejad i in., 2007). Ostatnio podjęto próby ujawniania aneuploidii we wczesnych zarodkach świńskich przy wykorzystaniu metody porównawczej hybrydyzacji genomowej (Comparative Genomie Hybridization) CGH, umożliwiającej detekcję fragmentów chromosomowych, które uległy amplifikacji lub delecji (Hornak i in., 2009). Technikę CGH stosuje się coraz częściej w onkocytogenetyce zwierząt domowych, czego przykładem może być analiza dziedzicznego czerniaka skóry u świń, która ujawniła utratę regionu chromosomowego 13q36-q49 w komórkach

15 Cytogenetyka molekularna w diagnozie wad genetycznych u świń 15 czerniaka guzkowatego, najbardziej złośliwej postaci tego nowotworu (Apiou i in., 2004). Należy przypuszczać, że nowe narzędzia diagnostyczne ilościowej cytogenetyki molekularnej, takie jak CGH czy mcgh (metoda microarray-cgh polegająca na hybrydyzacji znakowanego DNA do mikroczipu), przyczynią się do identyfikacji kolejnych mutacji chromosomowych i poszerzenia wiedzy na temat etiopatogenezy wad genetycznych u świń. Piśmiennictwo A p i o u F., V i n c e n t - N a u l l e a u S., S p a t z A., V i e l h P., G e f f r o t i n C., F r e l a t G., D u t r i l l - a u x B., L e C h a l o n y C. (2004). Comparative genomic hybridization analysis of hereditary swine cutaneous melanoma revealed loss of the swine 13q36-49 chromosomal region in the nodular melanoma subtype. Int. J. Cancer, 110: A r a k a k i D.T., S p a r k e s R.S. (1963). Microtechnique for culturing leucocytes from whole blood. Cytogenetics, 2: B a s r u r P.K., S t r a n z i n g e r G. (2008). Veterinary cytogenetics: past and perspective. Cytogenet. Genome Res., 120: B e n e t J., O l i v i e r - B o n e t M., C i f u e n t e s P., T e m p l a d o C., N a v a r r o J. (2005). Segregation of chromosomes in sperm of reciprocal translocation carriers: a review. Cytogenet. Genome Res., 111: B l o o m S.E., G o o d p a s t u r e C. (1976). An improved technique for selective silver staining of molecular regions in human chromosomes. Hum. Genet., 34: B o n n e a u M., B o s c h e r J., P o p e s c u P., L e g a u l t C. (1991). Consequences zootechniques des translocations réciproques dans un tropeau expérimental porcin: incidénce économique. J. Rech. Porc. France, 23: B o n n e t - G a r n i e r A., G u a r d i a S., P i n t o n A., D u c o s A., Y e r l e M. (2009). Analysis using sperm-fish of a putative interchromosomal effect in boars carrying reciprocal translocations. Cytogenet. Genome Res. 126: C a s p e r s s o n T., F a r b e r S., F o l e y G.E., K u d y n o w s k i J., M o d e s t E.J., S i m o n s s o n E., W a g h U., Z e c h L. (1968). Chemical differentiation along metaphase chromosomes. Exp. Cell Res., 49: C h a r o n K.M., Ś w i t o ń s k i M. (2000). Genetyka zwierząt. Wyd. Nauk. PWN, Warszawa. C h a u d h a r y R., K i j a s J., R a u d s e p p T., G u a n X.Y., Z h a n g H., C h o w d h a r y B.P. (1998). Microdissection of pig chromosomes: dissection of whole chromosomes, arms and bands for construction of paints and libraries. Hereditas, 128: C h o w d h a r y B.P. (1998). Cytogenetics and physical chromosome maps. W: The genetics of the pig. Rothschild M.F., Ruvinsky A. eds. CABI, Oxon, pp C h o w d h a r y B.P., R a u d s e p p T. (2001). Chromosome painting in farm, pet and wild animal species. Methods Cell Sci., 23: C o u l l i n P., R o y L., P e l l e s t o r F., C a n d e l i e r J.J., B e d - H o m B., G u i l l i e r - G e n c i k Z., B e r n h e i m A. (2002). PRINS, the other in situ DNA labeling method useful in cellular biology. Am. J. Med. Genet., 107: C o u n c e S.J., M e y e r G.F. (1973). Differentiation of the synaptonemal complex and the kinetochore in Locusta spermatocytes studied by whole mount electron microscope. Chromosoma, 44: D a n i e l a k B. (1992). Wykorzystanie technik prążkowych w ocenie kariotypu świń. IZ Kraków. D a n i e l a k - C z e c h B. (2005). Chromosomal instability in sows with reproductive disturbances. Med. Wet., 61, s. 42. D a n i e l a k - C z e c h B., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., S ł o t a E., R e j d u c h B., K w a c z y ń - s k a A. (1996 a). Preliminary identification of pair 1 chromosome rearrangement in the Polish Landrace sow. Arch. Zootec., 45:

16 16 E. Słota i B. Danielak-Czech D a n i e l a k - C z e c h B., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., S ł o t a E., R e j d u c h B., O k u l a r c z y k S. (1996 b). Decrease in pig fertility as result of reciprocal translocations and associated economic effects on the basis of rcp(7;13)(q13;q46). J. Appl. Genet., 36: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2002). Unstable chromosomal regions in subfertile farm animals. Ann. Anim. Sci., 2: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2004). Mutagen-induced chromosome instability in farm animals. J. Anim. Feed Sci., 13: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2006). Cytogenetic localization of FRM1 gene in farm animals. 17th Europ. Colloq. Anim. Cytogenet. Gene Map., Book of Abstracts., p. 28. D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2007). A new case of reciprocal translocation t(10;13)(q16;q21) diagnosed in an AI boar. J. Appl. Genet., 48: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2008 a). Karyotype control system of AI boars in Poland: the current survey. Ann. Anim. Sci., 8: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E. (2008 b). Tandem fusion-translocation: a unique karyotype rearrangement in the domestic pig. Ann. Anim. Sci., 8: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E., B u g n o M., P i e ń k o w s k a - S c h e l l i n g A., S c h e l l i n g C. (2006). Application of chromosome microdissection and chromosome painting techniques for reciprocal translocations diagnosis in pigs. Ann. Anim. Sci., 6: D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., R e j d u c h B. (2010). A unique chromosome mutation in pigs: tandem fusion-translocation. Chromosome Res., pp D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E., Ś w i t o ń s k i M. (1994). Identification of the first reciprocal translocations in the pig population bred in Poland. Proc. 11th Europ. Colloq. Cytogenet. Domest. Anim., pp D a n i e l a k - C z e c h B., Ś w i t o ń s k i M., S ł o t a E. (1997). First identification of reciprocal translocations in Polish pigs. J. Anim. Breed. Genet., 114: D i x o n S.C., M i l l e r N.G., C a r t r N.P., T u c k e r E.M. (1992). Bivariate flow cytometry of farm animal chromosomes: a potential tool for gene mapping. Anim. Genet., 23: D u c o s A., B e r l a n d H.M., B o n n e t N., C a l g a r o A., B i l l o u x S., M a r y N., G a r n i e r - B o n - n e t A., D a r r é R., P i n t o n A. (2007). Chromosomal control of pig population in France: survey. Genet. Sel. Evol., 39: D u c o s A., P i n t o n A., S é g u é l a A., B e r l a n d H.M., B l a n c M.F., D a r r é A., P i n t o n P., Y e r l e M., D a r r é R. (1997). A pericentric inversion of chromosome 4 in pigs. Gent. Sel. Evol., 29: D u c o s A., P i n t o n A., Y e r l e M., S é q u é l a A., B e r l a n d H.M., B r u n - B a r r o n a t C., B o n n e t N., D a r r é R. (2002). Cytogenetic and molecular characterization of eight new reciprocal translocations in the pig species. Estimation of their incidence in French populations. Genet. Sel. Evol., 34: D u c o s A., R e v a y T., K o v a c s A., H i d a s A., P i n t o n A., B o n n e t - G a r n i e r A., M o l - t e n i L., S ł o t a E., Ś w i t o ń s k i M., A r r u g a M.V., va n H a e r i n g e n W.A., N i c o - l a e I., C h a v e s R., G u e d e s - P i n t o H., A n d e r s s o n M., I a n n u z z i L. (2008). Cytogenetic screening of livestock populations in Europe: an overview. Cytogenet. Genome Res., 120: D u t r i l l a u x B. (1973). Nouveau systeme de marquage chromosomique: Les bands T. Chromosoma, 41: D u t r i l l a u x B., L a u r e n t C., C o u t u r i e r J., L e j e u n e J. (1973). Coloration par l acridine orange de chromosomes prealablement trites par le 5-bromodeoxyuridine (BudR). Comp. Rend. Acad. Sci., 276: E v a n s E.P., B r e c k o n G., F o r d C.E. (1964). An air drying method of meiotic preparation from mammalian testes. Cytogenetics, 3: F o r d C.E., P o l l o c k D.L., G u s t a v s s o n I. (1980). Proceedings of the First International Conference for Standardisation of Banded Karyotypes of Domestic Animals. Hereditas, 92: G a l m a n O., Y e r l e M., E c h a r d E. (1991). The high resolution G-banded karyotype of Sus scrofa domestica L. Genet. Sel. Evol., 23: G u s t a v s s o n I. (1980). Banding techniques in chromosome analysis of domestic animals. Adv. Vet. Sci. Comp. Med., 24: G u s t a v s s o n I. (1988). Standard karyotype of domestic pig. Hereditas, 109:

17 Cytogenetyka molekularna w diagnozie wad genetycznych u świń 17 G u s t a v s s o n I. (1990). Chromosomes of the pig. Adv. Vet. Sci. Comp. Med., 34: H o r n a k M., H u l i n s k a P., M u s i l o v a P., K u b i c k o v a S., R u b e s J. (2009). Investigation of chromosome aneuploidies in early porcine embryos using comparative genomic hybridization. Cytogenet. Genome Res., 126: H o w e l l W.M., B l a c k D.A. (1980). Controlled silver-staining of nucleolus organizer regions with a protective colloidal developer: a 1-step method. Experientia, 36: K a c z o r U., D a n i e l a k - C z e c h B., S h a r a n M. (2009). Comparative mapping of the CGG tandem repeats of the human FRM1 gene in farm animals. The Anim. Biol., 11: K a ł u ż e w s k i B., C o n s t a n t i n o u M., Z a j ą c E. (2003). Molecular cytogenetic techniques in detecting subtle chromosomal imbalances. J. Appl. Genet., 44: K a w a r a s a k i T., M a t s u m o t o K., C h i k y u M., I t a g a k i Y., H o r i u c h i A. (2000). Sexing of porcine embryo by in situ hybridization using chromosome Y- and 1-specific DNA probes. Theriogenology, 53: K a w a r a s a k i T., W e l c h G.R., L o n g C.R., Y o s h i d a M., J o h n s o n I.A. (1998). Verification of flow cytometrically-sorted X- and Y-bearing porcine spermatozoa and reanalysis of spermatozoa for DNA content using the fluorescence in situ hybridization (FISH) technique. Theriogenology, 50: K o c h J.E., K ø l v r a a S., P e t e r s e n K.B., G r e g e r s e n N., B o l u n d L. (1989). Oligonucleotidepriming methods for the chromosome-specific labelling of alpha satellite DNA in situ. Chromosoma, 98: K o n f o r t o v a G.D., M i l l e r N.G., T u c k e r E.M. (1995). A new reciprocal translocation (7q+;15q ) in the domestic pig. Cytogenet. Cell Genet., 71: K u b i c k o v a S., C e r n o h o r s k a H., M u s i l o v a P., R u b e š J. (2002). The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res., 10: L a n g f o r d C.F., T e l e n i u s H., C a r t e r N.P., M i l l e r N.G., T u c k e r E.M. (1992). Chromosome painting using chromosome-specific probes from flow-sorted pig chromosomes. Cytogenet. Cell Genet., 61: L a n g f o r d C.F., T e l e n i u s H., M i l l e r N.G., T h o m s e n P.D., T u c k e r E.M. (1993). Preparation of chromosome-specific paints and complete assignment of chromosome in the pig flow-sorted karyotype. Anim. Genet., 24: L e c h n i a k D., W a r z y c h E., P e r s - K a m c z y c E., S o s n o w s k i J., A n t o s i k P., R u b e s J. (2007). Gilts and sows produce similar rate of diploid oocytes in vitro whereas the incidence of aneuploidy differs significantly. Theriogenology, 68: L e g a u l t C. (1985). Selection of breeds, strains and individual pigs for prolificacy. J. Reprod. Fert., 33: L e g a u l t C., P o p e s c u C.P. (1993). Les translocations réciproques chez le porc domestique: détection, éradication et prévention. Elevage Insémination, 254: L o n g S. (1988). Segregation patterns and fertility of domestic mammals with chromosome translocations. W: The Cytogenetics of Mammalian Autosomal Rearrangements. Alan R. Liss. Inc., New York, pp L o n g S. (1991). Reciprocal translocations in the pig (Sus scrofa): a review. Vet. Rec., 128: M a l e k i n e j a d H., S c h o e v e r s E.J., D a e m e n I.J., Z i j l s t r a C., C o l e n b r a n d e r B., Fi n k - - G r e m m e l s J., R o e l e n B.A. (2007). Exposure of oocytes to the Fusarium toxins zearalenone and deoxynivalenol causes aneuploidy and abnormal embryo development in pigs. Biol. Reprod., 77: M a s s i p K., B e r l a n d H., B o n n e t N., C a l g a r o A., B i l l o u x S., B a q u i é V., M a r y N., B o n - n e t - G a r n i e r A., D u c o s A., Y e r l e M., P i n t o n A. (2008). Study of inter- and intra-individual variation of meiotic segregation patterns in t(3;15)(q27;q13) boars. Theriogenology, 70: M a s s i p K., B o n n e t N., C a l g a r o A., B i l l o u x S., B a q u i é V., M a r y N., B o n n e t - G a r - n i e r A., D u c o s A., Y e r l e M., P i n t o n A. (2009). Male meiotic segregation analyses of periand paracentric inversions in the pig species. Cytogenet. Genome Res., 125: M e l t z e r P.S., G u a n X.Y., B u r g e s s A., T r e n t J.M. (1992). Rapid generation of region specific probes by chromosome microdissection and their application. Nat. Genet., 1: M i l a n D., Y e r l e M., S c h m i t z A., C h a p u t B., V a i m a n M., F r e l a t G., G e l l i n J. (1993). A PCR-based method to amplify DNA with random primers: determining the chromosomal

18 18 E. Słota i B. Danielak-Czech content of porcine flow-karyotype peaks by chromosome painting. Cytogenet. Cell Genet., 62: M o o r h e a d P.S., N o w e l l P.G., M e l l m a n W.J., B a t t i p s D.M., H u n g e r f o r d D.A. (1960). Chromosome preparations from leucocytes cultured from human peripheral blood. Exp. Cell Res., 20: P a r r i l l a I., V a z q u e z J.M., O l i v e r - B o n e t M., N a v a r r o J., Y e l a m o s J., R o c a J., M a r t i - n e z E.A. (2003). Fluorescence in situ hybridization in diluted and flow cytometrically sorted boar spermatozoa using specific DNA direct probes labelled by nick translation. Reproduction, 126: P e l l e s t o r F., G i r a r d e t A., L e f o r t G., A n d r é o B., C h a r l i e u J.P. (1995). PRINS as a method for rapid chromosomal labeling on human spermatozoa. Mol. Reprod. Dev., 40: P i n k e l D., S t r a u m e T., G r a y J.W. (1986). Cytogenetic analysis using quantitative, high sensitive, fluorescence hybridization. Proc. of Nat. Acad. Sci. USA, 83, p P i n t o n A., C a l g a r o A., B o n n e t N., F e r c h a u d S., B i l l o u x S., D u d e z A.M., M a r y N., M a s s i p K., B o n n e t - G a r n i e r A., Y e r l e M., D u c o s A. (2009). Influence of sex on the meiotic segregation of a t(13;17) Robertsonian translocation: a case study in the pig. Hum. Reprod., 24: P i n t o n A., D u c o s A., B e r l a n d H., S e g u e l a A., B r u n - B a r o n n a t C., D a r r é A., D a r r é R., S c h m i t z A., Y e r l e M. (2000). Chromosomal abnormalities in hypoprolific boars. Hereditas, 132: P i n t o n A., D u c o s A., S é g u é l a A., B e r l a n d H.M., D a r r é R., D a r r é A., P i n t o n P., S c h m i t z A., C r i b i u E.P., Y e r l e M. (1998). Characterization of reciprocal translocations in pigs using dualcolour chromosome painting and primed in situ DNA labelling. Chromosome Res., 6: P i n t o n A., D u c o s A., Y e r l e M. (2003). Chromosomal rearrangements in cattle and pigs revealed by chromosome microdissection and chromosome painting. Genet. Sel. Evol., 35: P i n t o n A., D u c o s A., Y e r l e M. (2004). Estimation of the proportion of genetically unbalanced spermatozoa in the semen of boars carrying chromosomal rearrangements using sperm-fish. Genet. Sel. Evol., 36: P i n t o n A., F a r a u t T., Y e r l e M., G r u a n d J., P e l l e s t o r F., D u c o s A. (2005). Comparison of male and female meiotic segregation patterns in translocation heterozygotes: a case study in an animal model (Sus scrofa domestica L.). Hum. Reprod., 20: P o p e s c u C.P., B o n n e a u M., T i x i e r M., B a h r i I., B o s c h e r J. (1984). Reciprocal translocations in pigs. Their detection and consequences on animal performance and economic losses. J. Hered., 75: R e j d u c h B., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., S ł o t a E., S y s a P., W r z e s k a M. (2006). Ocena zmian chromosomalnych w gonadach oraz potencjalny ich wpływ na płodność knurów. Med. Wet., 62: R e j d u c h B., S ł o t a E., S y s a P., K w a c z y ń s k a A., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., D a n i e l a k - - C z e c h B. (2003). Diagnosis of a new reciprocal translocation rcp(9;14)(q14;q23) in infertile boar after the synaptonemal complex analysis. Ann. Anim. Sci., 3: R e z á c o v á O., K u b í c k o v á S., C e r n o h o r s k á H., R u b e s J. (2003). Comparison of spontaneous background genomic aberration frequencies among cattle, pig and humans using dual-colored FISH. Chromosome Res., 11: R i g g s P.K., K u c z e k T., C h r i s m a n C.L., B i d w e l l C.A. (1993). Analysis of aphidicolin-induced chromosome fragility in the domestic pig (Sus scrofa). Cytogenet. Cell Genet., 62: R i g g s P.K., R ø n n e M. (2009). Fragile sites in domestic animal chromosomes: molecular insights and challenges. Cytogenet. Genome Res., 126: R o g e l - G a i l l a r d C., H a y e s H., C o u l l i n P., C h a r d o n P., V a i m a n M. (1997). Swine centromeric DNA repeats revealed by primed in situ (PRINS) labeling. Cytogenet. Cell Genet., 79: R ø n n e M. (1989). Chromosome preparation and high resolution R- and G-banding techniques. W: Cytogenetics of animals. Clive R.E. Halnan, ed., C.A.B. International, R ø n n e M. (1990 a). Chromosome preparation and high resolution banding (review). In Vivo, 4: R ø n n e M. (1990 b). The high resolution R-banded karyotype of Sus scrofa domestica L. In Vivo, 4:

19 Cytogenetyka molekularna w diagnozie wad genetycznych u świń 19 R ø n n e M. (1995). Localization of fragile sites in the karyotype of Sus scrofa domestica; Present status. Hereditas, 117: R ø n n e M., R i g g s P., L o n g S.E., Y a n g M.Y., G y l d e n h o l m A.O., S t o r m C.O. (1994). Localization of fragile sites in the karyotype of Sus scrofa domestica. Proc. 11th Europ. Colloq. Cytogenet. Domest. Anim., pp R u b e š J. (1987). Chromosomal aberrations and sister chromatid exchanges in swine. Mut. Res., 191: R u b e š J., B o r k o v e c L., H o ř i n o v á Z., U r b a n o v á J., P r o r o k o v á I., K u l i k o v á L. (1992). Cytogenetic monitoring of farm animals under conditions of environmental pollution. Mut. Res., 283: R u b e š J., P i n t o n A., B o n n e t - G a r n i e r A., F i l l o n V., M u s i l o v a P., M i c h a l o v a K., K u - b i c k o v a S., D u c o s A., Y e r l e M. (2009). Fluorescence in situ hybridization applied to domestic animal cytogenetics. Cytogenet. Genome Res., 126: S c h e r m e l l e h L., T h a l h a m m e r S., H e c k l W., P ö s l H., C r e m e r T., S c h ü t z e K., C r e - m e r M. (1999). Laser microdissection and laser pressure catapulting for the generation of chromosome-specific paint probes. Biotechniques, 27: S c h m i t z A., C h a r d o n P., G a i n c h e I., C h a p u t B., G u i l l y M.N., F r e l a t G., V a i m a n M. (1992). Pig standard bivariate flow karyotype and peak assignment for chromosomes X, Y, 3, and 7. Genomics, 14: S e a b r i g h t M. (1971). A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet, 2: S ł o t a E., B u g n o M., R e j d u c h B., K o z u b s k a - S o b o c i ń s k a A., D a n i e l a k - C z e c h B. (2007). Sex chromosome aberrations in animals evolution of diagnostic methods. Konf. Nauk. Investigations on animal genome and their utilization in science and modern breeding., Balice, , Mat. Konf., ss S ł o t a E., D a n i e l a k - C z e c h B. (2002). Unstable chromosomal regions in subfertile farm animals. Chromosome Res., 10, s. 1. S u m n e r A.A. (1983). New approaches to study of chromosome organization. Sci. Progr. Oxford, 68: S y s a P.S. (1991). Cytogenetyka świni domowej (Sus scrofa domestica). Rozpr. Nauk. Monogr. SGGW- AR Warszawa. Ś w i t o ń s k i M. (1991). Paracentric inversion involving NOR of chromosome 8 in a boar: studies of synaptonemal complexes under a light microscope. Genet. Sel. Evol., 23: Ś w i t o ń s k i M. (2008). Postępy genomiki zwierząt domowych. Nauka, 1: Ś w i t o ń s k i M., D a n i e l a k - C z e c h B., S ł o t a E., S y s a P. (1998). Lack of pairing loop formation in synaptonemal complex preparation of a boar carrying an inversion. Hereditas, 128: Ś w i t o ń s k i M., S ł o t a E., J a s z c z a k K. (2006). Diagnostyka cytogenetyczna zwierząt domowych. Wyd. AR Poznań. Ś w i t o ń s k i M., S t r a n z i n g e r G. (1998). Studies of synaptonemal complexes in farm mammals a review. J. Hered., 89: T e l e n i u s H., P e l m e a r A.H., T u n n a c l i f f e A., C a r t e r N.P., B e h m e l A., F e r g u s o n - - S m i t h M.A., N o r d e n s k j ö l d M., P f r a g n e r R., P o n d e r B.A. (1992). Cytogenetic analysis by chromosome painting using DOP-PCR amplified flow-sorted chromosomes. Genes Chromosomes Cancer, 4: V i l l a g ό m e z D.A.F. (1993). Zygotene-pachytene substaging and synaptonemal complex karyotyping of boar spermatocytes. Hereditas, 118: V i l l a g ό m e z D.A.F., P i n t o n A. (2008). Chromosomal abnormalities, meiotic behaviour and fertility in domestic animals. Cytogenet. Genome Res., 120: V o z d o v a M., M a c h a t k o v a M., K u b i c k o v a S., Z u d o v a D., J o k e s o v a E., R u b e š J. (2001). Frequency of aneuploidy in pig oocytes matured in vitro and of the corresponding first polar bodies detected by fluorescent in situ hybridization. Theriogenology, 56: W a c h t l e r F., H o p m a n A.H.N., W i e g a n t J., S c h w a r z a c h e r H.G. (1986). On the position of nucleolus organizer regions (NORs) in interphase nuclei. Studies with a new, non-autoradiographic in situ hybridization method. Exp. Cell Res., 167: W a n g H.C., F e d o r o f f S. (1972). Banding in human chromosomes treated with trypsin. Nat. New Biol., 235:

20 20 E. Słota i B. Danielak-Czech Y a n g M.Y., L o n g S.E. (1993). Folate sensitive common fragile sites in chromosomes of the domestic pig (Sus scrofa). Res. Vet. Sci., 55: Y e r l e M., G a l m a n O., E c h a r d G. (1991). The high resolution GTG-banding pattern of pig chromosomes. Cytogenet Cell Genet., 56: Y e r l e M., S c h m i t z A., M i l a n D., C h a p u t B., M o n t e a g u d o L., V a i m a n M., F r e l a t G., G e l l i n J. (1993). Accurate characterization of porcine bivariate flow karyotype by PCR and fluorescence in situ hybridization. Genomics, 16: Y u n i s J.J. (1976). High resolution of human chromosomes. Science, 101: Y u n i s J.J., S o r e n g A.L., B o w e A.E. (1987). Fragile sites are targets of divers mutagens and carcinogens. Oncogene, 1: Z u d o v a D., R e z a c o v a O., K u b i c k o v a S., R u b e s J. (2003). Aneuploidy detection in porcine embryo using fluorescence in situ hybridization. Cytogenet. Genome Res., 102: EWA SŁOTA, BARBARA DANIELAK-CZECH Use of molecular cytogenetic methods in diagnosis and prevention of genetic defects in pigs SummarY The increased productivity of pigs that has taken place over the last several decades results from the advances in pig breeding associated with the application of the latest achievements of animal production and biological sciences. This mainly concerns the introduction into genetic studies of molecular biology techniques (molecular cloning, PCR amplification of DNA fragments, DNA sequencing, in situ hybridization ISH, identification of microsatellite sequence polymorphism), which increased our knowledge of the molecular basis of variation in production traits. Molecular genetics (hybridocytochemical techniques: FISH, PCR/RT-PCR in situ, PRINS, CGH) play a significant role in the study of structure, function and changes of metaphase or interphase chromosomes (in somatic, reproductive and embryonic cells), ensuring considerable progress in structural genomics of the pig. Molecular analysis that includes FISH techniques finds increasing use in breeding practice as complementary to the classical cytogenetic diagnosis, necessary for identification and characterization of genetic defects determined by chromosomal aberrations and for evaluation of their biological and population consequences. It is believed that the new diagnostic tools of quantitative molecular cytogenetics such as CGH and mcgh (microarray-cgh method involving hybridization of labelled DNA to a microchip) will contribute to identifying further chromosomal mutations and to increasing our knowledge of etiopathogenesis of genetic defects in pigs. Key words: pigs, genetic defects, molecular cytogenetics, cytogenetic diagnostics, prevention of karyotype abnormalities

21 Aktualne trendy w badaniach nad udoskonalaniem użytkowości trzody chlewnej w oparciu o metody genetyki molekularnej R o b e r t E c k e r t, M a r i a O c z k o w i c z Instytut Zootechniki Państwowy Instytut Badawczy, Dzial Genetyki i Hodowli Zwierząt, Balice k. Krakowa Metody biologii molekularnej już od jakiegoś czasu wykorzystywane są do szeroko pojętego przyspieszania postępu w rolnictwie. Dotyczy to zarówno uprawy roślin, jak i hodowli zwierząt. W ostatnich latach zmieniły się główne cele w selekcji trzody chlewnej. Już od kilku lat zaprzestano selekcji na procentową zawartość mięsa, a wyższy nacisk kładzie się na poprawę jakość mięsa, cech tucznych oraz użytkowości rozpłodowej. Podobny trend zaznacza się w badaniach prowadzonych w IZ PIB. W związku ze zmianą oczekiwań rynku aktualnie prowadzone badania dotyczą genów głównych wpływających na cechy jakości mięsa na cechy użytkowości tucznej oraz rozpłodowej. Geny potencjalnie wpływające na daną cechy wybierane są na podstawie ich funkcji biologicznej oraz lokalizacji loci cech ilościowych (QTL- Quantitative Trait Locus). Aby możliwe było zidentyfikowanie genu głównego konieczna są badania molekularne na poziomie DNA identyfikacja zmian w sekwencji nukleotydów polimorfizmów, na poziomie mrna zmiana poziomu ekspresji lub zmiana w sekwencji kodującej, na poziomie białka zmiana ilości lub struktury białka. Niezbędna jest również ocena wpływu danego genu na fenotyp, przeprowadzona na dużej populacji zwierząt. Silna selekcja w kierunku wysokiej zawartości mięsa w tuszy przyczyniła się do obniżenie jakości mięsa, w tym zawartości tłuszczu śródmięśniowego (IMF) (Tyra i Żak, 2010). Wśród genów potencjalnie wpływających na tę cechę dotychczas intensywnie badany był gen (heart fatty acid binding protein) H-FABP (Gerbens i in. 1999, 2000). Również w naszym instytucie badano frekwencję alleli dwóch polimorfizmów w tym genie (polimorfizm HaeIII i HinfI) i stwierdzono, że wpływają one na zawartość tłuszczu śródmięśniowego w mięśniu longissimus dorsi i semimembranosus. Co więcej, udało się wykazać korelację pomiędzy poziomem ekspresji mrna tych genów w dwóch mięśniach a zawartością IMF (Tyra i in., 2010, w druku). Jednym z intensywnie badanych genów potencjalnie wpływających na cechy tuczne świń jest gen nowo odkrytego białka greliny (GHRL). Białko to syntetyzo-