Mikroskopia fluorescencyjna. Komórki osteoblastomy, fot: J.Korczyński

Transkrypt

1 Mikroskopia fluorescencyjna Komórki osteoblastomy, fot: J.Korczyński

2 Podział mikroskopów Optyczne Elektronowe Inne... - świetlny - polaryzacyjny - fluorescencyjny - konfokalny - transmisyjny (TEM) - skaningowy (SEM) - sił atomowych (AFM) - akustyczny - holograficzny

3 Fluorescencja Co to jest fluorescencja?

4 Fluorescencja Wzbudzenie i emisja barwnika FITC Diagram Jabłońskiego

5 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna??? Astrocyty. Autor: dr H.Mansour, University of Syndey

6 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów??

7 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki)? W świetlówce światło emituje luminofor, wzbudzony przez promieniowanie, powstałe wskutek wyładowania elektrycznego w rurze wypełnionej gazem.

8 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki) F F I inne... Fluorescencja chlorofilu zdjęcie z satelity ORBVIEW pokazuje globalną koncentracje chlorofilu w wodach oceanu.

9 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Proszek do prania oglądany w świetle dziennym... Zabezpieczenia banknotów Lampy fluorescencyjne (świetlówki) I inne......i w świetle UV.

10 Przykłady fluorescencji Mikroskopia fluorescencyjna Zabezpieczenia banknotów Fluoryt w świetle dziennym i świetle UV. Lampy fluorescencyjne (świetlówki) I inne...

11 Fluorescencyjny mikroskop Zwierciadło dichroiczne Filtr barierowy

12 Fluorescencyjny mikroskop Wzbudzenie i emisja barwnika FITC

13 Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD) Fluoresceina (FITC) Rodamina

14 Barwniki fluorescencyjne Zasady fotoaktywacji Mechanizm konwersji barwnika fluorescencyjengo Kaede

15 Barwniki fluorescencyjne Zasady fotoaktywacji Ruch białek zlokalizowanych w błonie ER znakowanych pagfp (J.Runions, Univ. of Cambridge, UK) Mechanizm konwersji barwnika fluorescencyjengo Kaede

16 Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD)

17 2008 Nagroda Nobla z dziedziny chemii Za odkrycie i badania nad rozwojem Green Fluorescence Protein (GFP) Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien GFP (wt) 395/ Green Fluorescent Proteins EGFP Orange Fluorescent Proteins Kusabira Orange Emerald Kusabira Orange Superfolder GFP morange Azami Green morange mwasabi dtomato TagGFP dtomato-tandem TurboGFP TagRFP AcGFP TagRFP-T ZsGreen DsRed T-Sapphire Blue Fluorescent Proteins DsRed EBFP DsRed-Express (T1) EBFP DsRed-Monomer Azurite mtangerine mtagbfp Red Fluorescent Proteins Cyan Fluorescent Proteins mruby ECFP mapple mecfp mstrawberry Cerulean AsRed CyPet mrfp AmCyan JRed Midori-Ishi Cyan mcherry TagCFP HcRed mtfp1 (Teal) mraspberry Yellow Fluorescent Proteins dkeima-tandem EYFP HcRed-Tandem Topaz Venus mplum mcitrine AQ YPet TagYFP PhiYFP ZsYellow mbanana

18 Badania przyżyciowe Glioma C6 Hipokamp szczura

19 Badania przyżyciowe Źródło: New Scientist

20 Barwniki fluorescencyjne Stosowane fluorochromy: - Małe molekuły (zwykle z pierścieniem aromatycznym) - Białka fluorescencyjne - Kropki kwantowe (QD) Kropki kwantowe (ang. quantum dots - QD) są to półprzewodnikowe nanokryształy o wielkości od 2-10 nm. Ograniczona liczba atomów oraz średnica kilku nanometrów daje kropkom kwantowym wyjątkowe właściwości absorpcji i emisji promieniowania

21 Aplikacje w mikroskopii fluorescencyjnej

22 Obrazowanie przyżyciowe

23 Obrazowanie przyżyciowe Kontrola środowiska: Nowy inkubator Pecon: oświetlenie, blokada światła lasera Ogrzewany stolik (Tokai) Kontrola temp. i CO 2 zintegrowana w programie LAS X. Glejak C6, fot. J.Korczynski

24 Obrazowanie przyżyciowe Chamber slides (Lab-Tek) Glass bottom Petri dishes Ludin chambers, heating stages etc.

25 Obrazowanie przyżyciowe Automatyczny podajnik immersji wodnej (Water microdispenser) Długotrwałe eksperymenty z immersją wodną Sterowanie z poziomu programu LAS X

26 Obrazowanie przyżyciowe Zmotoryzowana korekcja obiektywu dla grubości szkiełka.

27 Intensywność fluorescencji Pomiar intensywności barwienia immunofluorescencyjnego R&D Systems protocol

28 Intensywność fluorescencji Pomiar intensywności barwienia immunofluorescencyjnego LAS AF

29 Badanie ilości białek Technika Western blot Źródło: Leinco Technologies Inc.

30 Badanie ilości białek Technika Western blot Sondy fluorescencyjne Źródło: Abcam Co.

31 Pomiary wapniowe

32 Obraz ratio pokazuje zmiany w poziomie wewnątrzkomórkowego wapnia. Pomiary wapniowe FURA AM barwnik fluorescencyjny wrażliwy na stężenie wapnia exc. 340 nm stężenie wapnia związanego exc. 380 nm stężenie wolnych jonów wapnia

33 Pomiary wapniowe Reakcja wapniowa po stymulacji receptora P2Y 2 za pomocą UTP była mierzona na powiomie subkomórkowym za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego Leica AF7000. UTP UTP Reakcja wapniowa w komórkach z blokadą ROCK. Ratio 340 / 380

34 Kolokalizacja Pomiar współwystępowanie receptorów P2Y 2 z integrynami α V β 5 Komórki kontrolne Czerwony α V β 5, zielony P2Y 2 Rs LAS AF Boulte et al. Journal of Microscopy, 2006

35 Kolokalizacja Pomiar współwystępowanie receptorów P2Y 2 z integrynami α V β 5 Komórki kontrolne Czerwony α V β 5, zielony P2Y 2 Rs

36 Mikroskopia konfokalna dr Jarosław Korczyński Specjalista ds. mikroskopii

37 Zobaczyć niewidoczne Podział komórki - metafaza Mikroskopy konfokalne osiągnęły limit rozdzielczości określonej dla mikroskopii świetlnej przez Ernsta Abbego :09

38 Mikroskopia konfokalna Marvin Minsky wynalazca i konstruktor pierwszego mikroskopu konfokalnego (1955) Idealny mikroskop świetlny powinien: - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie

39 Mikroskopia konfokalna Idealny mikroskop świetlny powinien: - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie. Marvin Minsky Zalety Lepsza rozdzielczość i kontrast Akwizycja cienkich skrawków optycznych próbki rekonstrukcja 3D

40 Mikroskopia konfokalna - Odcinać światło nie pochodzące z płaszczyzny ostrości obiektywu. - Skanować preparat punkt po punkcie. Marvin Minsky Glejak C6 Korczyński et. al. Acta Biochim Pol. 2011

41 Mikroskopia konfokalna Leica TCS SPE Leica TCS SP5 II Leica TCS SMD Leica TCS STED CW Leica TCS LSI

42 Mikroskopia konfokalna

43 Mikroskopia konfokalna Źródło światła Schemat Leica SP8

44 Źródło światła Laser Ściśle zdefiniowana dł. fali Wysoka moc światła Punktowe źródło światła AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) Wybór danej długości fali światła Ustawianie intensywności światła

45 Źródło światła Laser Ściśle zdefiniowana dł. fali Wysoka moc światła Punktowe źródło światła AOTF (Acousto Optical Tunable Filter) Wybór danej długości fali światła Ustawianie intensywności światła Źródło światła White Light Laser Biały laser umożliwia wybór dowolnej długości fali światła wzbudzającego z dokładnością do 1 nm w zakresie od 470 nm do 670 nm.

46 Mikroskopia konfokalna Dzielnik wiązki

47 Dzielnik wiązki AOBS Dichroic mirrors

48 Dzielnik wiązki AOBS Wyższa transmisja Elektronicznie ustawiane zakresy Jedno stałe urządzenie (bez mechanicznych ruchów) Szybki czas przełączania (mikrosekundy) Do 8 linii światła wzbudzenia oraz emisji jednocześnie Kryształ AOBS

49 Mikroskopia konfokalna Fotodetektory Leica SP8 scheme

50 Fotodetektory Detektory spektralne: Płynna regulacja zakresu odbieranych fal Zapobiega nakładaniu się barwników na obrazie (crosstalk) Brak filtrów barierowych podwyższa jakość obrazu Fotopowielacz: Wzmocnienie słabego sygnału emisji Ochrona preparatu przed wyświecaniem

51 Aplikacje w mikroskopii konfokalnej: F-techniki

52 FRET (Förster resonance energy transfer) Thodor Förster - w 1946 roku opublikował w Naturwissenschaften artykuł dotyczący przeniesienia energii pomiędzy dwiema molekułami fluorochromu w roztworze po wzbudzeniu jednej z nich. G. L. Liu et al. Nature Methods 4, 1015 (2007)

53 FRET FRET (Fluorescence/Forster resonance energy transfer) Bada mechanizm wymiany energii między dwoma wybarwionymi cząsteczkami (donor i akceptor) Przekazanie energii następuje bez emisji światła. Dystans między donorem a akceptorem: < 10 nm (prawdziwa kolokalizacja). Diagram Jabłońskiego Zasada oddziaływania FRET

54 FRET FRET zachodzi gdy: 1) widmo emisji fluorescencji donora pokrywa się z widmem absorpcji akceptora 2) odległość między cząsteczką donora a akceptora jest mniejsza niż 10 nm 3) gdy występuje odpowiednia, wzajemna orientacja między momentami dipolowymi przejścia dla emisji donora i absorpcji akceptora E wydajność FRET R 0 odległość Forstera r dystans między donorem a akceptorem Spektrum wzbudzenia i emisji dla białek CFP (donor) i YFP (akceptor). Nakładanie się spektrum emisji donora ze spektrum wzbudzenia akceptora zaznaczono na szaro.

55 FRET Black box Zapytanie Odpowiedź

56 FRET Black box Zapytanie Odpowiedź FRET?

57 FRET Acceptor Photobleaching PreBleach Image

58 FRET Acceptor Photobleaching Bleaching

59 FRET Acceptor Photobleaching PostBleach Image

60 FRET Acceptor Photobleaching Quantification Image

61 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Technika do obserwacji ruchu wybarwionych cząstek na poziomie subkomórkowym. Używa się w tym celu silnego źródła światła wyświecającego fluorochromy w danym miejscu preparatu.

62 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Dyfuzja koniugatu FITC-dekstran w wodzie. Ruch konstruktu H1-GFP w mysich fibroblastach in vivo FRAP: MF [%] = 103 Theory: MF [%] = 100 FRAP: MF [%] = 91 Theory: MF [%] = ~90 From: Kappel C., Eils R. FRAP with the Leica TCS SP2

63 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Monitorowanie spadku fluorescencji w sąsiadujących obszarach podczas ciągłego wyświecania określonego miejsca.

64 FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Ocena ciągłości błon komórkowych Ocena płynności błon komórkowych - Komóki Mel JuSo z podjednostkami proteasomów znakowanych GFP - Sekwencyjne wyświecanie miejsca w cytoplazmie lub w jądrze w komórkach przez 180 min. - Intensywność fluorescencji pomiędzy jądrem, a cytoplazmą jest różna - Wniosek: Proteasomy nie dyfundują pomiędzy tymi obszarami (przez otoczkę jądrową) From: Lippincott-Schwartz J, et al., Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells, Nat Cell Biol. 2003

65 FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) FISH metoda służąca do wykrywania w badanym materiale genetycznym określonej sekwencji DNA za pomocą fluorescencyjnych sond. Procedura: Wyizolowanie jąder komórkowych Naniesienie fluorescencyjnej sondy DNA Denaturacja zerwanie wiązań pomiędzy nićmi DNA Inkubacja hybrydyzacja sond Odpłukanie sond i barwienie DAPI Źródło: Bishop R, Bioscience Horizons 2010

66 FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) Zastosowanie Diagnostyka chorób genetycznych Rozpoznawanie mikroorganizmów Badanie relacji ewolucyjnych między gatunkami Fish analysis di george syndrome autorstwa Adriano R Tonelli1, Kalyan Kosuri1, Sainan Wei2 and Davoren Chick1 - Seizures as the first manifestation of chromosome 22q11.2 deletion syndrome in a 40-year old man: a case report.

67 Wybór właściwego mikroskopu Cienki preparat? (<50 um) nie Czy jest z fluorescencją? tak Czy jest z fluorescencją? tak Fluorescencyjny tak nie Czy rozprasza światło? nie tak Ciemne pole Konfokal Czy jest kontrastująco Wybarwiony? tak Jasne pole nie Czy jest przeźroczysty? tak Kontrast fazowy lub DIC nie Czy zawiera kryształy? tak Polaryzacja Rubbi, C.P., 1994

68 Dziękuję za uwagę!