Mikroskopia fluorescencyjna

Transkrypt

1 Mikroskopia fluorescencyjna

2 Mikroskop fluorescencyjny to mikroskop świetlny, wykorzystujący zjawisko fluorescencji większość z nich to mikroskopy tzw. epi-fluorescencyjne zjawisko fotoluminescencji: fluorescencja i fosforescencja

3 Struktura, którą chcemy uwidocznić Emitują głównie światło widzialne Fluoresceina Rodamina BARWNIKI DAPI (4,6- diamydino-2-fenyloindol) Oranż akrydynowy Źródło wzbudzające + przeciwciała fluoryzujące Barwa emitowanego światła zależy od substancji fluoryzującej

4 Budowa mikroskopu fluorescencyjnego

5 Rys. 1. Schemat mikroskopu fluorescencyjnego źródło: Rys. 2. Mikroskop fluorescencyjny Źródło:

6 Źródło: erwatorska/materialy/techniki%20mikrosko powe1.pdf

7 Elementy mikroskopu fluorescencyjnego Źródło światła żarówka emitująca promieniowanie UV Zestaw filtrów: o Filtr wzbudzenia przepuszcza światło o pożądanej długości fali o Filtr barierowy (supresyjny) przepuszcza jedynie widzialną część widma, pochłania ultrafiolet Lusterko dichroiczne rozdziela ścieżki wzbudzenia i emisji Obiektyw skupia światło wzbudzające na preparacie, wysoka apertura numeryczna

8 Zasada działania mikroskopu fluorescencyjnego

9 Zjawisko fluorescencji powstawanie światła widzialnego w wyniku naświetlania obiektu promieniami ultrafioletowymi, niebieskimi lub zielonymi Próbka może wykazywać zdolność do naturalnej fluorescencji lub może być wyznakowana barwnikami fluorescencyjnymi Uzyskiwany obraz jest negatywem obrazu z typowego mikroskopu świetlnego: na ciemnym tle uwidaczniają się świecące struktury. Źródło: roduction.html Źródło: ane_proteins.jpg&filetimestamp=

10 Oświetlenie w mikroskopii fluorescencyjnej W mikroskopach fluorescencyjnych można stosować dwa sposoby oświetlania preparatu: system diailuminacji - odpowiada przebiegowi wiązki oświetlającej w normalnym mikroskopie optycznym, system epiiluminacji - standardowy w nowoczesnych mikroskopach, w których promienie przechodzą przez obiektyw i padają na preparat z góry, światło emitowane przez preparat przechodzi z powrotem przez ten sam obiektyw. W tym przypadku wiązka wzbudzająca po przejściu przez preparat ulega rozproszeniu i poza nielicznymi promieniami odbitymi nie wpada do obiektywu, a obraz tworzony jest wyłącznie przez promienie widzialnego zakresu widma emitowane na drodze fluorescencji. Taki sposób oświetlenia preparatu polepsza jakość obrazu i zmniejsza narażenie żywych komórek na kontakt ze szkodliwym ultrafioletem.

11 Stosując odpowiedni zestaw filtrów można uzyskać efekt ciemnego pola. We współczesnych mikroskopach fluorescencyjnych najczęściej światło wzbudzające kierowane jest na preparat poprzez obiektyw. Światło emitowane z preparatu zbierane jest przez obiektyw i po przejściu przez zestaw filtrów kierowane jest do okularu. W starszych konstrukcjach stosowano układ optyczny podobny do układu wywołującego efekt ciemnego pola w mikroskopach świetlnych. Obecnie stosowany system wzbudzenia (obiektyw skupia światło wzbudzające na preparacie) pozwala uzyskać duże lokalne natężenia światła wzbudzającego przy niewielkiej mocy źródła. Źródło: em/katedry/leki_bioche mia/dydaktyka/biofizyka/ cz4.pdf

12 Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego wewnętrznego odbicia Powstała jako modyfikacja klasycznej mikroskopii fluorescencyjnej i stała się szczególnie użyteczna w badaniu zjawisk zachodzących bezpośrednio pod i na powierzchni komórek. Polega ona na oświetleniu próbki światłem wzbudzającym, jednak pod takim kątem (kąt graniczny), aby padające światło uległo całkowitemu wewnętrznemu odbiciu przed wejściem do próbki: w szkiełku nakrywającym próbkę (typu epi-), w kwarcowym pryzmacie (typu trans-).

13 Zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia towarzyszy powstanie fali zanikającej (wiąże się to z różnicą między współczynnikiem załamania światła szkła, czyli kwarcu i wody, czyli próbki współczynnik ten dla szkła (kwarcu) jest większy), która nie ulega odbiciu, ale penetruje środowisko (próbkę) po drugiej stronie szkiełka lub pryzmatu. Czyni to jednak tylko na pewną określoną głębokość (fala ta zanika wykładniczo wraz z odległością), co w praktyce oznacza zwykle około nm. W tym obszarze głębokości próbki, fala ta może wzbudzić obecne w próbce fluorofory, a one zaczną emitować światło (co ważne, fala zanikająca ma tę samą długość co fala która uległa odbiciu). To emitowane światło jest następnie odbierane przez obiektyw, przepuszczane przez odpowiednie filtry i przetwarzane jak w klasycznym mikroskopie fluorescencyjnym. W ten sposób w TIRFM następuje bardzo selektywna wizualizacja obszarów położonych zaraz pod szkiełkiem lub pryzmatem, ponieważ obszar wzbudzenia powstaje tylko w zasięgu fali zanikającej, co znacznie ogranicza wpływ tła (wnętrza komórki), zwiększając rozdzielczość uzyskanych obrazów.

14 1. Próbka 2. Zasięg fali zanikającej 3. Szkiełko nakrywkowe 4. Olejek immersyjny 5. Obiektyw 6. Promień emitowany (sygnał) 7. Promień wzbudzający Rys. 2. Schemat zasady TIRFM w systemie epi- (światło pada i odbierane jest z tej samej strony próbki). Źródło: witego_wewn%c4%99trznego_odbicia

15 Rys. 3. Schemat zasady TIRFM w systemie trans- (światło pada i odbierane jest z różnych stron próbki). Źródło: witego_wewn%c4%99trznego_odbicia 1. Obiektyw 2. Promień emitowany 3. Olejek immersyjny 4. Szkiełko nakrywkowe 5. Próbka 6. Zasięg fali zanikającej 7. Promień wzbudzający 8. Pryzmat kwarcowy

16 Zastosowania mikroskopii fluorescencyjnej

17 Nauki biologiczne Rys.3. Fibroblasty komórek naskórka jelenia Rys.4. Immunofluorescencja. Mikrotubule w komórkach nerki myszy Rys.1. Trzy markery fluorescencyjne Rys.2. Odmienne stężenie jonów wapnia w komórce Purkynie go w móżdżku świnki morskiej Rys.5. Oddziaływanie białko białko ulegające apoptozie, badanie metodą FRET

18 Diagnostyka chorób Choroby genetyczne Diagnozowanie nowotworów Obrazowanie i identyfikacja komórek rakowych w badanym preparacie Rys.6 i 7. Dyspersja światła przechodzącego przez zarażone tkanki. Rys.8. Potrójne barwienie w komórkach ludzkich.

19 Komórki nowotworu czerniaka Streptomyces coelicolor produkujący podjednostkę polimerazy DNA Mikrokapsułki alginianowe zawierające liposomy z ciprofloksacyną Kryształy antybiotyku ciprofloksacyny

20 Rys. Komórki śródbłonka tętnicy Rys.5. Móżdżek transgenicznej myszy Rys.6. Autofluorescencja chlorofilu Rys.7. Neurony

21 Mikroskopy fluorescencyjne stały się ważnym narzędziem w biologii, stając się podstawą do rozwoju bardziej zaawansowanych technik mikroskopii fluorescencyjnej, takich jak: TIRFM, mikroskopia konfokalna, mikroskopia dwufotonowa, FLIC (Mikroskopia fluorescencyjna kontrastu interferencyjnego).

22 Dziękujemy za uwagę

23