BIAŁKA FLUORESCENCYJNE NOWE NARZĘDZIE W NEUROBIOLOGII. Marta Dziedzicka-Wasylewska

Transkrypt

1 BIAŁKA FLUORESCENCYJNE NOWE NARZĘDZIE W NEUROBIOLOGII Marta Dziedzicka-Wasylewska Instytut Farmakologii PAN, Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii UJ

2 Podziękowania Mgr Agata Faron-Górecka IF PAN Mgr Katarzyna Grymek WFiIS AGH Mgr Magdalena Gąska IF PAN Dr Andrzej Górecki WBBiB UJ Dr Agnieszka Polit WBBiB UJ

3 Dedykacja

4 Fluorescencja - mierzone parametry widma emisji fluorescencji (mikrootocznie sondy, wygaszanie fluorescencji) czasy życia fluorescencji polaryzacja, anizotropia fluorescencji (orientacja i dynamika) transfer energii wzbudzenia (odległość => dynamika) lokalizacja fluorescencji

5 Fluorescencja - zastosowanie analityczne strukturalne lokalne konformacje, struktura trzeciorzędowa białek, denaturacja kompleksowanie, tworzenie wiązań mikroskopia fluorescencyjna fluorescencja jest znacznie wrażliwsza na zmianę środowiska fluoroforu niż spektroskopia absorpcyjna w zakresie UV/Vis

6 Pomiar czasów życia fluorescencji Umożliwia wyznaczenie czasów życia fluorescencji kilku takich samych fluoroforów znajdujących się w makrocząsteczce, a także określić ich udziały Umożliwia wyznaczenie więcej niż jednego czasu życia fluorescencji danego fluorofora (dynamika konformacyjna) Stosowane do pomiarów wygaszania fluorescencji (pozwala jednoznacznie odróżnić gaszenie statyczne od dynamicznego) Stosowane do pomiarów transferu energii (FRET)

7 Techniki pomiaru czasów życia fluorescencji Fluorymetr fazowy (frequrency-domain) - fluorescencja zostaje wzbudzona światłem modulowanym o okresie modulacji dłuższym od mierzonego czasu zaniku. Po wzbudzeniu światłem modulowanym fluorescencja ma tę samą częstość modulacji ale jest przesunięta w fazie. Mierzy się różnicę faz światła wzbudzającego i fluorescencyjnego Fluorymetr impulsowy (time-domain fluorescence) - naświetlanie próbki światłem impulsowym i śledzenie zaniku fluorescencji (u nas: metoda pojedynczego zliczania fotonów, TCSPC, fluorescencyjny mikroskop odwrócony, dioda laserowa nanoled jako źródło wzbudzenia, moduł detekcyjny Horiba Jobin Yvon)

8

9 Ograniczenia obie techniki nie są w stanie wyodrębnić czasów życia fluorescencji różniących się o 20% (np: 1 vs. 1.2ns) rozwikłanie zaniku wieloeksponencjalnego jest równie trudne

10 Transfer energii Warunki konieczne do zajścia FRET: donor i akceptor muszą być od siebie w odległości Å widmo absorpcji akceptora musi się pokrywać z widmem emisji donora energii (optimum ~30%) nie ma emisji fotonu podczas transferu energii s1 kt A1 Wzbudzenie donora Emisja akceptora s0 A0

11 FRET Fluorofor A widmo absorpcyjne i emisyjne Fluorofor B widmo absorpcyjne i emisyjne Donor A Absorbancja Akceptor B Absorbancja Nakładanie się Fluorescencja FRET emisja A pokrywa się z absorpcją B Fluorescencja Odległość decyduje, czy pojawi się emisja B

12 Wydajność transferu energii Wydajność transferu energii (E) od donora do akceptora (A do B) R Fluorofor A E =1 F da E =1 Fd τda τd Fluorofor B Fda intensywność fluorescencji w obecności akceptora Fd intensywność fluorescencji bez akceptora tda czas życia fluorescencji donora w obecności akceptora td - czas życia fluorescencji donora w nieobecności

13 Wydajność transferu energii E= R 6o R6o R6 R0 odległość Förstera; odległość przy której wydajność transferu energii wynosi 50 % 1 R0= 8, κ 2 n 4 Qd J λ [ ] 6 czynnik geometryczny orientacji dipoli przejść (0 4) przypadkowe ułożenie =2/3 Qd wydajność kwantowa fluorescencji donora pod nieobecność akceptora n współczynnik załamania światła (1,2-1,4 ) ( J całka nakładania się widm

14 Wydajność transferu energii Wydajność transferu 1 E= R 6o R6o R6 1/6 1 R= 1 E 0.25 R0 Jeżeli E = 50% to R=R Distance in Angstrom Odległość w Å Odległość mierzy się w przedziale od ~0,5 R0 do ~1,5 R0

15 Typowe pary donor akceptor Donor Akceptor Fluoresceina Tetrametylorodamina IAEDANS Fluoresceina EDANS Dabcyl Fluoresceina Fluoresceina BODIPY FL BODIPY FL Fluoresceina QSY 7 i QSY 9 R0 (Å)

16 FRET metody pomiarów Pomiary widm emisyjnych donora, akceptora i układu donorakceptor Mikroskopia konfokalna Pomiary czasów życia fluorescencji donora pod nieobecność i w obecności akceptora (niezależne od stężenia)

17

18

19 Świecące organizmy morskie - przykłady Aequorea victoria Anemonia sulcata Sinularia densa

20 Białko GFP, odkryte w latach 60-tych, gen poznany w 1992 r.

21 Struktura łańcucha polipeptydowego

22 Green Fluorescent Protein - struktura

23 Struktura GFP

24 Schemat przepływu informacji w komórce DNA RNA Białko

25 Nowe białka fluorescencyjne powstałe w wyniku mutacji w GFP

26

27

28

29

30 Komórka zwierzęca

31

32 Schemat budowy błony komórkowej

33 Photobleaching recovery

34 Schemat neuronu

35 Schemat neurotransmisji

36 Fragment błony z receptorem i efektorem

37 Metodyka Linia komórkowa HEK 293 Plazmid pcdna3.1 Human DRD1 Human DRD2

38 Overlap Extension PCR WT sequention Matrix DNA PCR with mutagenic primers PCR with flanking primers Zmutowane DNA

39 FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer

40 FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer

41 Kolokalizacja receptorów w tym samym neuronie D1 D2 Aizman et al. 2000

42 Pomiar Widm Fluorescencji

43 Pomiar Widm Fluorescencji si is Em on ht g li on i ss i m E t h lig EYFPion s is Em Excitation light ECFP Excitation light EYFP ht il g

44 Pomiar Widm Fluorescencji 6 R Φ = R R 0 T 6 6 0

45 Wpływ ligandów receprotów DA na widma fluorescencji A 1,2e+6 8,0e+5 intensywno æ fluorescencji [cps] 4,0e+5 0,0 B 2,1e+6 1,4e+6 7,0e+5 0,0 450x103 C chloro-abp i quinpirole 0,1 µm quinpirole 0,1 µm chloro-abp 300x x d³ugo æ fali [nm] 540

46 Mikroskopia konfokalna

47 Mikroskopia konfokalna

48 Photobleaching on i s is Em Excitation light ECFP Excitation light EYFP ht il g i m E ht on i ss lig

49 Photobleaching FRET Eff = D post D pre D post

50 Wpływ ligandów na dimeryzację D1-D2

51 Fluorescence Lifetime Microscopy (FLM)

52 Fluorescence Lifetime Microscopy E =1 τ da τ d

53 FLM dimeryzacja D1-D2

54

55 Wnioski Badania FRET trzema różnymi metodami wykazują dimeryzację receptorów dopaminowych D1 i D2 - wydajność transferu wynosi ok. 3.8 % i wzrasta do ok. 8.3 % po równoczesnej stymulacji obydwu receptorów Równoczesna stymulacja obydwu receptorów dopaminowych prowadzi do aktywacji innych procesów wewnątrz komórki niż aktywacja każdego z nich z osobna (Lee et al., 2004)

56 D 1 D AC G s /o lf 2 AC G i/ o ca M P ca M P D D 1 G 2 PLC q C a 2+ Hipoteza robocza: Wpływ na dimeryzację receptorów może mieć znaczenie dla działania leków stosowanych w terapii schizofrenii, np. klozapiny

57 Klozapina jest zaliczana do grupy neuroleptyków atypowych, nie wywołuje efektów ubocznych i jest skuteczna w terapii objawów wytwórczych i ubytkowych Przyczyny schizofrenii nie są znane. Pierwotna koncepcja schizofrenii zakłada, że jedną z przyczyn tej choroby jest nadczynność układu dopaminowego: mezostriatalnego i mezolimbicznego czyli stymulacja receptorów dopaminowych jest nadmierna

58 Klozapina wykazuje właściwości antagonistyczne w stosunku do receptorów dopaminowych D2 (Rupnick et al.1985) Postulowany jest również odwrotny agonism klozapiny do receptorów dopaminowych D2 (Akam and Strange, 2004) Hipoteza luźnego wiązania, w której postuluje się, że klozapina blokuje receptory D2 w sposób przerywany (Kapur and Seeman, 2001)

59 Klozapina wykazuje właściwości antagonistyczne w stosunku do receptorów dopaminowych D1 (Murray et al., 1990) Postulowane jest również działanie klozapiny jako agonisty receptorów dopaminowych D1 (Alhenius, 1999) Klozapina także w wielu badaniach zachowuje się jak odwrotny agonista receptorów D1 (Cai et al., 1999)

60 Postuluje się, że powinowactwo klozapiny do receptora dopaminowego D1 jest większe w korze frontalnej niż w prążkowiu i że zależy ono od poziomu endogennej dopaminy ( Chou et al., 2006) Endogenna dopamina może rywalizować o miejsce wiązania z radioligandem (Seeman et al., 2003)

61 Powinowactwo klozapiny do receptorów dopaminowych D1 i D % [ H ] S p ip e r o n e B o u n d 3 % [ H ] S C H B ound 125 D1WT/D2WT log [Clozapine (M)] D1WT/D2WT log [Clozapine (M)]

62 Dipsplacement of [3H]SCH23390 by clozapine Low-affinity [M] 1,31E-07 High-affinity [M] 2,91E-9 D1 WT- D2 WT 2,55E E-11 * D1 WT 2,85E-07 5,27E-10 * D1 WT D2 Ser311Cys

63 Czasy życia fluorescencji E =1 τ da τ d

64 Czasy życia fluorescencji Faron-Górecka i wsp., 2007

65 Podsumowanie Niskie stężenie klozapiny 10-9M (działąjące tylko na pulę receptorów w stanie o wysokim powinowactwie) powoduje spadek dimeryzacji receptorów, czyli zablokowanie tworzenia się heterodimerów Być może ten właśnie efekt klozapiny ma znaczenie terapeutyczne przywraca bowiem normalne (poprzez AC) funkcjonowanie receptorów dopaminowych nawet w obecności nadmiaru dopaminy Tylko pomiary dimeryzacji receptorów poprzez czasy życia fluorescencji pozwalają na uchwycenie tego subtelnego efektu

66 Podsumowanie stosowanych metod Wymagania względem pary fluoroforów: Odporność na zmienne czynniki środowiskowe (niewrażliwość na zmiany ph, temperatury, stężenia jonów np. Cl-) Fotostabilność Nie tworzenie oligomerów Wysoka wydajność kwantowa donora, przy dużej absorbancji akceptora Wydajność FRET zależy od rozmiarów FP

67 Podsumowanie stosowanych metod Uwagi ogólne Konformacja konstruktu receptor-fp (wpływ linkera: długość, struktura I rzędowa, miejsce wklonowania) Dobór pary białek fluorescencyjnych: donor-akceptor (wydajność FRET, stabilność układu) Zawsze należy sprawdzić lokalizację białka fuzyjnego w komórce Pomiary na żywych komórkach (temperatura, ph, CO2) Pomiary na preparatach utrwalonych (możliwe zmiany konformacyjne FP) Autofluorescencja komórek Wygaszanie fluorescencji

68 donor przed wybieleniem akceptora akceptor przed wybieleniem akceptora donor po wybieleniu akceptora akceptor po wybieleniu akceptora

69 Podsumowanie stosowanych metod Spektroskopia fluorescencji Pomiar jakościowy ilość donora i akceptora wysoce uzależniona od wydajności transfekcji, a następnie od poziomu ekspresji białka w komórkach (niemożność określenia koncentracji obu białek) Uzyskany wynik jest wartością uśrednioną procesów dynamicznych zachodzących w komórce Fluktuacje intensywności światła wzbudzającego w różnych miejscach preparatu - efektem są różnice w intensywności światła emitowanego przez fluorofor

70 Podsumowanie stosowanych metod Mikroskopia konfokalna Zaletą jest wysoka rozdzielczość uzyskanego obrazu w porównaniu z tradycyjną mikroskopią fluorescencyjną, możliwość tworzenia obrazów trójwymiarowych Możliwość wizualizacji w czasie procesów dynamicznych w układach biologicznych Cyfrowa rejestracja obrazu umożliwia dodatkowe polepszenie jakości przy zastosowaniu odpowiednich algorytmów obróbki obrazu właściwości układu detekcyjnego (wydajność kwantowa, szumy SNR) Wpływ środowiska na konformację białek (ph, temperatura, współczynnik załamania światła na granicy faz błona cytoplazma)

71 Podsumowanie stosowanych metod Mikroskopia konfokalna cd. Wymagania aparaturowe (mikrodrgania stolika mikroskopu, stabilność temperatury przy pracy na układach żywych) Zjawiska ograniczające możliwości mikroskopii konfokalnej: Fototoksyczność Fotoblaknięcie problemem przy wielokrotnie powtarzanych pomiarach efekt bleed-through wzbudzenie akceptora może być wynikiem wzbudzenia bezpośredniego i FRET/ efekt filtra wewnętrznego efekt cross-talk częściowe pokrywanie się widm emisji donora i akceptora

72 Podsumowanie stosowanych metod Czasy życia fluorescencji do oznaczenia FRET Czasy życia fluorescencji nie zależą stężenia fluorofora (ale wzrasta wygaszanie fluorescencji w wyniku zderzeń cząsteczek) i długości drogi optycznej w badanej próbce Silna zależność od warunków środowiska (temperatura) pomiary in vivo w ogrzewanych komorach Ważny wybór odpowiedniego modelu analizy wyników (czasem zanik wieloeksponencjalny wynikający z różnych stanów konformacyjnych fluorofora) Technika trudna i pracochłonna, ale pozwala uzyskać wiarygodne ilościowe wyniki

73