Wstęp. Abstract. Streszczenie

Transkrypt

1 Streszczenie Cisplatyna (CPT) jest jednym z najpowszechniejszych chemioterapeutyków stosowanych w terapii nowotworów. Uszkodzenie genomowego DNA po wniknięciu CPT do jądra komórkowego wyzwala cytotoksyczne procesy prowadzące do śmierci komórek nowotworowych. Aktywacja kaskady proteolitycznej z udziałem członków rodziny kaspaz jest kluczowym elementem śmierci w komórkach apoptotycznych. Stosując technikę mikromacierzy oligonukleotydowych (Affymetrix) porównano ekspresję genów związanych z kaskadą kaspaz w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na CPT oraz w komórkach kontrolnych. Analiza sygnałów fluorescencji 1772 sond, wyselekcjonowanych z bazy NetAffx Analysis Center, umożliwiła wykazanie wzrostu ekspresji genów BIK, SAFB, BAX, SFRS2IP, FUT7, SIGMAR1, RALBP1, USO1, CASP6 oraz spadku poziomu ekspresji TNFAIP3, CD48 i PDE4B. Wyjaśnienie zmian ekspresji genów związanych z kaskadą kaspaz wywoływanych przez CPT może mieć istotne znaczenie w ustalaniu schematu terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem tego leku i przewidywaniu jej skuteczności. Słowa kluczowe: cisplatyna, ekspresja genów, kaspazy, kaskada kaspaz, komórki białaczki promielocytarnej, HL-60 Abstract Cisplatin (CPT) is one of the most popular chemiotherapeutics used in anticancer therapy. Damage followed by CPT binding to DNA after its incorporation to a cell nucleus triggers the cytotoxic processes leading to cancer cell death. Activation of proteolytic cascades, involving members of the family of caspases, is the key element causing the apoptotic cells death. Using oligonucleotide microarray technique (Affymetrix) we compared the expression of genes involved in the cascade of caspases in promyelotic leukemia HL-60 cells exposed to CPT and in control cells. Analysis of the fluorescence signals of 1772 probes, selected from the NetAffx Analysis Center database, showed the increased expression of BIK, SAFB, BAX, SFRS2IP, FUT7, SIGMAR1, RALBP1, USO1, CASP6 and inhibition of TNFAIP3, CD48 and PDE4B. Explaining changes in expression of genes associated with caspases cascade induced by CPT may have a significant role in determining the regimen of anticancer therapy and predicting its effectiveness. Key words: cisplatin, gene expression, caspases, caspases cascade, promyelotic leukemia cells, HL-60 Wstęp Większość aktualnie stosowanych terapii przeciwnowotworowych wywołuje śmierć komórek nowotworowych poprzez indukcję apoptozy [1]. Jednym z najczęściej stosowanych chemioterapeutyków jest cisplatyna (CPT), powszechnie stosowana w rakach płuc, głowy, szyi, przełyku, żołądka, okrężnicy, pęcherza moczowego, jąder, jajników i szyjki macicy oraz w większości innych zaawansowanych raków, takich jak rak piersi, trzustki, wątroby, nerek, prostaty, jak również przeciwko glejakom, czerniakom przerzutowym oraz międzybłoniakowi otrzewnej i międzybłoniakowi opłucnej [2]. Przyłączenie CPT do genomowego DNA (gdna) w jądrze komórkowym jest głównym wydarzeniem odpowiedzialnym za przeciwnowotworowe właściwości tego związku. W ten sposób, uszkodzenie powstałe po tym połączeniu może hamować transkrypcję oraz mechanizmy replikacji. Następnie zmiany te mogą wyzwalać cytotoksyczne procesy prowadzące do śmierci komórek nowotworowych [3]. Jednakże, selektywne defekty wewnątrzkomórkowych białek sygnalizacyjnych i kaspaz mogą znosić wrażliwość nowotworów na bodźce apoptotyczne, co w konsekwencji prowadzi do oporności komórek nowotworowych na różne formy chemioterapii i immunoterapii, których skuteczność zależy

2 od indukcji apoptozy. Aktywacja kaskady proteolitycznej z udziałem członków rodziny kaspaz jest kluczowym elementem realizacji śmierci w komórkach apoptotycznych [1]. Kaspazy to wewnątrzkomórkowe enzymy z rodziny proteaz cysteinowych (ang. cysteine-dependent aspartate-directed proteases) [4], które odgrywają główną rolę w kontrolowaniu procesu apoptozy, a także związane są z funkcjonowaniem układu immunologicznego [5]. Pierwszą, zidentyfikowaną w 1993 roku kaspazą był enzym konwertujący IL-1β ICE (ang. interleukin 1β converting enzyme), posiadający zdolność przekształcenia prekursora pre-il-1β w aktywną cytokinę [4]. Kaspazy reprezentują 3 podgrupy białek. Bazując na homologii ich sekwencji aminokwasowych, dzielone są na: inicjatorowe - aktywujące inne kaspazy, efektorowe - uczestniczące w dalszych etapach apoptozy oraz zapalne - związane z cytokinami [6, 7]. Poszczególne kaspazy różnią się od siebie swoistością substratową oraz sposobem aktywacji. Wszystkie poznane dotychczas kaspazy są syntetyzowane jako nieaktywne proenzymy [8]. Celem prezentowanej pracy było określenie, jakie zmiany w ekspresji genów związanych z kaskadą kaspaz, wywołuje CPT w ludzkich komórkach białaczki promielocytarnej (HL-60). Do analizy ekspresji genów zastosowano technikę mikromacierzy oligonukleotydowych Human Genome U133A Set (HG-U133A; Affymetrix). Materiał i metody Hodowle komórkowe Materiałem, który został wykorzystany do badań zmiany ekspresji genów z wykorzystaniem mikromacierzy oligonukleotydowych, były hodowane ludzkie komórki białaczki promielocytarnej (HL-60). Komórki linii HL-60 hodowano w mieszaninie RPMI 1640 (Gibco) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; Sigma), 2 mm glutaminy (Sigma), 1 mm pirogronianu sodu (Sigma), 4,5 g/l glukozy, 100 μg/ml streptomycyny i 100 U/ml penicyliny (Sigma). Hodowle komórkowe prowadzono w warunkach stałej wilgotności powietrza (95%), stałej temperatury (37 C) oraz atmosfery 5% CO 2. Po inkubacji, trwającej 48 godzin, dodawano pożywkę zawierającą CPT (Sigma) rozpuszczoną w DMSO (Sigma), tak aby w hodowlach uzyskać stężenie 0,22 μg/ml, zgodne z wcześniej wyznaczoną wartością ID30 (Inhibitory Dose 30%). Hodowle stanowiące układ odniesienia prowadzono w identyczny sposób, dodając po 48 godzinach pożywkę z dodatkiem DMSO, tak by jego stężenie było identyczne jak w próbach z CPT. Po trwającej 6 godzin inkubacji komórki zbierano i przygotowano do ekstrakcji RNA. Ekstrakcja całkowitego RNA Ekstrakcję całkowitego RNA przeprowadzono z wykorzystaniem odczynnika TRIZOL (Invitrogen Life Technologies) zgodnie z zaleceniami producenta. Uzyskane ekstrakty oczyszczano przy użyciu RNeasy Mini Kit (Qiagen). Następnie oceniano je jakościowo techniką elektroforezy agarozowej w obecności bromku etydyny oraz ilościowo w oparciu o pomiar spektrofotometryczny z wykorzystaniem GeneQuant II (Pharmacia Biotech; λ = 260 nm). Analiza aktywności transkrypcyjnej genów techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HG-U133A (Affymetrix) Całkowity RNA, w ilości 8μg, został następnie wykorzystany do syntezy dwuniciowego cdna (Gibco BRL Super- Script Choice system), który stanowił matrycę do syntezy biotynylowanego crna (reakcja transkrypcji in vitro, Enzo kit). W dalszym etapie, po fragmentacji biotynylowanego crna, przeprowadzono hybrydyzację z mikromacierzą Test3, a następnie, po pozytywnej weryfikacji, hybrydyzację z mikromacierzą HG-U133A (Affymetrix). Produkty hybrydyzacji znakowano kilkustopniowo kompleksem streptawidyna fikoerytryna, znakowanymi przeciwciałami przeciw biotynie oraz przeciwciałami przeciw kompleksowi streptawidyna fikoerytryna zgodnie z protokołem EukGEWS2v4 zalecanym dla mikromacierzy oligonukleotydowej HG U133A w przewodniku Gene Expression Analysis Technical Manual (Affymetrix). W kolejnym etapie płytki mikromacierzy odczytywano używając skanera Agilent GeneArray Scanner G2500A (Agilent Technologies). Otrzymane wyniki intensywności fluorescencji zapisano i zarchiwizowano w programie Microarray Suite oraz specjalnie do tego celu przygotowanej bazie danych. Analizę porównawczą transkryptomów przeprowadzono, po normalizacji wyników w programie RMA Express, polegającej na przekształceniu logarytmicznym wartości sygnału fluorescencji dla każdego transkryptu (log 2 ), wykorzystując programy komputerowe: Statistica v.7,0, Gnumeric, oraz Microsoft Excel. Spośród znajdujących się na mikromacierzy HG-U133A sond, wykorzystując dane zaczerpnięte z bazy Affymetrix NetAffxTM Analysis Center ( po wpisaniu kwerend: caspases i caspase, wyselekcjonowano te określające ekspresję genów związanych z kaskadą kaspaz. Sumaryczny zbiór 1772 sond stanowił podstawę do poszukiwania genów, których sygnał ekspresji różnił się w próbach badanych i kontrolnych, co najmniej, ±2STD (dwukrotna wartość odchylenia standardowego). Wyniki W niniejszej pracy porównywano ekspresję genów związanych z kaskadą kaspaz komórek eksponowanych na CPT względem hodowli kontrolnych. Posługując się programem komputerowym Gnumeric wyfiltrowano 1772 sygnały fluorescencji, charakteryzujące ekspresję wybranych transkryptów związanych z kaskadą kaspaz, z grupy sond mrna, obecnych na mikromacierzy HG-U133A (Affymetrix). Porównując wartości parametru SLR (stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, ang. signal log ratio), wyznaczono geny związane z kaskadą kaspaz, których ekspresja pod wpływem CPT w największym stopniu uległa zmianie, a SLR różnił się, co najmniej ±2STD w odniesieniu do komórek hodowli kontrolnych. W komórkach HL-60 eksponowanych na CPT w największym stopniu stymulowana była ekspresja genów BIK, SAFB, BAX, SFRS2IP, FUT7, SIGMAR1, RALBP1, USO1, CASP6. Genami, których ekspresja została najbardziej zahamowana, okazały się TNFAIP3,

3 Tab. I. Ekspresja genów różnicujących związanych z kaskadą kaspaz w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60 eksponowanych na CPT względem prób odniesienia (komórki eksponowane na DMSO) Nazwa sondy Symbol genu Nazwa kodowanego białka Wartość SLR _at BIK białko z rodziny BCL-2, promotor śmierci komórkowej (BCL-2-interacting killer) + 1, _s_at SAFB czynnik B wiążący chromatynę (scaffold attachment factor B) + 1, _s_at BAX białko X związane z BCL-2 (BCL-2-associated X protein) + 1, _s_at SFRS2IP białko oddziałujące z bogatym w serynę/argininę czynnikiem splicingowym 2 (serine/arginine-rich splicing factor 2, interacting protein) + 1, _at FUT7 fukozylotransferaza 7 (fucosyltransferase 7) + 1, _s_at SIGMAR1 nieopioidowy wewnątrzkomórkowy receptor sigma 1 (sigma non-opioid intracellular receptor 1) + 1, _s_at RALBP1 białko wiążące rala (rala binding protein 1) + 1, _s_at USO1 homolog białka drożdży dokujący do pęcherzyka USO1 (USO1 vesicle docking protein homolog (yeast)) + 1, _s_at CASP6 kaspaza 6 (caspase 6, apoptosis-related cysteine peptidase) + 1, _at PDE4B fosfodiesteraza camp 4B (phosphodiesterase 4B, camp-specific) - 1, _at CD48 antygen różnicowania komórkowego 48 (cluster of differentiation 48) - 1, _s_at TNFAIP3 białko 3 indukowane czynnikiem martwicy nowotworów alfa (tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3) - 1, _s_at TNFAIP3 białko 3 indukowane czynnikiem martwicy nowotworów alfa (tumor necrosis factor, alpha-induced protein 3) - 2,07 SLR ang. signal log ratio stosunek zlogarytmowanych uśrednionych wartości fluorescencji transkryptu w porównywanych próbach, strzałka nadekspresja, strzałka spadek ekspresji genu w komórkach HL-60 eksponowanych na CPT CD48 i PDE4B. Szczegółowe dane uwzględniające nazwy sond, nazwy genów, funkcje tych genów oraz wartości liczbowe SLR zestawiono w tabeli I. Dyskusja Zastosowanie metody mikromacierzy oligonukleotydowych umożliwiło określenie wpływu CPT na profil ekspresji genów kodujących białka związane z kaskadą kaspaz w komórkach białaczki promielocytarnej HL-60. Zaobserwowano, że genem o najbardziej stymulowanej ekspresji był BIK, który koduje proapoptotyczne białko BIK. Białko to zlokalizowane jest głównie w siateczce śródplazmatycznej (ER) i indukuje apoptozę za pośrednictwem szlaku mitochondrialnego poprzez mobilizację wapnia z ER do mitochondriów oraz przebudowę grzebieni wewnętrznej błony mitochondrialnej. Białko BIK jest proapoptotyczym supresorem nowotworów w różnych ludzkich tkankach i jego ekspresja w nowotworach jest zablokowana przez delecje chromosomalne obejmujące locus Bik lub poprzez wyciszanie epigenetyczne. Białko BIK wydaje się być kluczowym efektorem w apoptozie indukowanej toksynami, cytokinami i infekcjami wirusowymi. Kilka leków przeciwnowotworowych aktywuje ekspresję genu BIK poprzez szlaki transkrypcyjne zależne od takich czynników transkrypcyjnych jak E2F i białka P53 lub poprzez usunięcie zmian epigenetycznych w chromatynie [9]. Białko BIK, wraz z innymi białkami proapoptotycznymi takimi jak BAD i BID, uczestniczy w modulowaniu funkcji apoptosomu. Białka te poprzez związanie się z białkami BCL-2/x L umożliwiają i ułatwiają aktywację kaspazy 9 przez Apaf-1 [10]. Kolejnym genem różnicującym, którego ekspresja była stymulowana w komórkach HL-60 jest SAFB. Jego produktem jest białko SAFB, którego plejotropowość wiąże się z obecnością w jego strukturze licznych domen. Domena SAP obecna na N-końcu jest charakterystyczna dla białek, które zaangażowane są w procesy takie jak: transkrypcja, przetwarzanie RNA, apoptotyczna degradacja chromatyny i naprawa DNA. SAFB odgrywa niekorzystną rolę w rozwoju nowotworów piersi. Białko to funkcjonuje jako korepresor dla receptorów estrogenowych. Nadekspresja SAFB powoduje zahamowanie aktywności tych receptorów. Ponadto nade-

4 kspresja SAFB w hodowlach komórkowych doprowadza do zahamowania wzrostu i generuje komórki o wielu jądrach [11]. Gen BAX, którego ekspresja również znacząco wzrosła, koduje białko należące do rodziny białek BCL-2, która stanowi grupę onkogenów komórkowych regulujących proces śmierci komórki. Białka z rodziny BCL-2 mają wspólny co najmniej jeden z czterech regionów określanych jako domeny homologii z BCL-2 (BCL-2 homology domains- BH): BH1, BH2, BH3 i BH4. Rodzinę białek BCL-2 można podzielić na trzy grupy, biorąc pod uwagę ich strukturę oraz pełnione funkcje. Do I grupy należą białka antyapoptotyczne, takie jak BCL-2, MCL-1, BCL-xL, które praktycznie zawsze posiadają wszystkie 4 domeny BH. Do grupy II klasyfikuje się białka proapoptotyczne, jak na przykład Bak, Bax, i inne (tzw. multidomain proapoptotic proteins). Do grupy III należą białka proapoptotyczne posiadające tylko domenę BH3 (tzw. BH3-only proteins), m.in. o białka BIK, BAD, NIX, BLK, NIP3. Białko BAX w żywotnych komórkach obecne jest w formie monomeru w cytozolu albo luźno przylega do zewnętrznej błony mitochondrialnej. Jednak w formie monomeru nie jest zdolne do tworzenia kanałów w błonach lipidowych, ani do uwalniania cytochromu C z mitochondriów. Dopiero z chwilą wystąpienia sygnałów indukujących przepuszczalność błony mitochondrialnej cytozolowy BAX oraz BAX znajdujący się przy błonie mitochondrialnej ulegają homooligomeryzacji i jako multimer są wprowadzane w zewnętrzną błonę mitochondrialną. Oligomeryzacja BAX jest możliwa dzięki działaniu innego białka proapoptycznego, a mianowicie białka BID, które wcześniej musi być rozszczepione przez kaspazę 8/10 do postaci tbid [12]. Wykazano, że zwiększona ekspresja BAX w warunkach in vivo jest skorelowana w wielu typach komórek z wrażliwością na chemioterapię [13]. Zaobserwowano również, że komórki linii komórkowej jelita DLD-1 transfekowanej genem BAX w większym stopniu ulegają apoptozie pod wpływem cytostatyków CPT i doksorubicyny w porównaniu z komórkami nietransfekowanymi [14]. Innym genem, którego ekspresja była znacząco stymulowana był gen CASP6, kodujący kaspazę 6, która obok kaspazy 3 i 7 jest jedną z trzech kaspaz efektorowych - końcowych enzymów kaskady kaspaz. Aktywacja kaskady kaspaz doprowadza w efekcie do śmierci komórki przez rozkład jej struktur, fragmentację DNA oraz inaktywację mechanizmów naprawczych DNA [15]. Aktywna kaspaza 6 trawi laminę, wchodzącą w skład strukturalnych blaszek jądrowych, co powoduje rozszczelnienie błony jądrowej [6]. A zatem można stwierdzić, że zwiększona ekspresja genu CASP6 może być odpowiedzialna za promowanie apoptozy w komórkach nowotworowych linii HL-60. Na uwagę zasługuje również gen RALBP1, którego ekspresja także była stymulowana po ekspozycji na CPT. Gen ten koduje białko 1 wiążące RAL (RLIP76), które jest białkiem błonowym transportującym na zewnątrz komórki koniugaty glutationu, związki elektrofilowe i inne ksenobiotyki w tym chemioterapeutyki [16]. Białko to często wykazuje nadekspresję w komórkach nowotworowych i odgrywa w nich znaczącą rolę antyapoptotyczną [17]. Drake i wsp. [18] wykazali, że nadekspresja RALBP1 w ludzkiej linii komórek nowotworowych białaczki szpikowej K562, jest odpowiedzialna za oporność min. na CPT, doksorubicynę i mitomycynę-c. A zatem zwiększona ekspresja RALBP1 w linii HL-60 prawdopodobnie jest powiązana z opornością na CPT. Wśród genów, których ekspresja została znacząco zahamowana po ekspozycji na CPT występuje TNFAIP3, określany również jako A20. Początkowo został on uznany za gen, który jest indukowany przez czynnik martwicy nowotworu (TNF) w ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej. Późniejsze badania wykazały, że A20 jest również indukowany w wielu innych typach komórek przez szeroką gamę bodźców [19]. Produktem tego genu jest białko cytoplazmatyczne zawierające motyw palca cynkowego, który hamuje aktywność jądrowego czynnika kappa-b (NFκB), a także programowaną śmierć komórki przebiegającą z udziałem TNF [20]. A zatem można założyć, że obniżona ekspresja tego genu sprzyja apoptozie indukowanej przez CPT. Przedstawione wyniki badań sugerują, że CPT w znaczny sposób modyfikuje ekspresję genów związanych z kaskadą kaspaz w komórkach HL-60. Poznanie efektów towarzyszących zmianie ekspresji tych genów wydaje się być niezwykle istotne do określenia mechanizmów działania leków, przeciwdziałania oporności a także do wdrażania innych niż chemioterapia podejść terapeutycznych jak np. przeciwnowotworowa terapia genowa, która dzięki modulowaniu aktywności poszczególnych genów może stanowić uzupełnienie standardowych metod leczenia. Wnioski 1. CPT powoduje zmiany ekspresji genów związanych z kaskadą kaspaz w komórkach nowotworowych białaczki promielocytarnej HL Wśród genów związanych z kaskadą kaspaz różnicujących odpowiedź komórek HL-60 hodowli eksponowanej na CPT w porównaniu do hodowli kontrolnej najbardziej stymulowana była ekspresja genów BIK, SAFB, BAX, a najbardziej zahamowana TNFAIP3, CD48 i PDE4B. 3. Wyjaśnienie zmian ekspresji genów związanych z kaskadą kaspaz wywoływanych przez CPT może mieć istotne znaczenie w ustalaniu schematu terapii przeciwnowotworowej z zastosowaniem tego leku i przewidywaniu jej skuteczności. Piśmiennictwo 1. Kolenko VM i wsp. Caspase-dependent and independent death pathways in cancer therapy. Apoptosis 2005; 1: Boulikas T. Molecular mechanisms of cisplatin and its liposomally encapsulated form, Lipoplatin TM. Lipoplatin TM as a chemotherapy and antiangiogenesis drug. Cancer Ther 2007; 5: Cepeda V i wsp. Biochemical mechanisms of cisplatin cytotoxicity. Anti-Cancer Agents Med Chem 2007; 7: Korzeniewska-Dyl I. Kaspazy struktura i funkcja. Pol Merk Lek 2007; 23: Korzeniewska-Dyl I. Kaspazy nowy cel w terapii przeciwzapalnej i przeciwnowotworowej? Pol Merk Lek 2008; 24: 5-7.

5 6. Fang TJ i wsp. Caspase family proteases and apoptosis. Acta Biochem Biophys Sin 2005; 37: Ślesak B, Harłozińska A, Knast W. Ekspresja kaspazy 3 (CPP32), Ki-67 w relacji do wczesnych faz apoptozy w złośliwych i zapalnych guzach trzustki. Adv Clin Exp Med 2005; 14: Hordyjewska A, Pasternak K. Apoptotyczna śmierć komórki. Adv Clin Exp Med 2005; 14: Chinnadurai G, Vijayalingam S, Rashmi. BIK, the founding member of the BH3-only family proteins: mechanisms of cell death and role in cancer and pathogenic processes. Oncogene 2009; 27: Maślińska D. Programowana śmierć komórki (apoptoza) w procesie zapalnym. Nowa Med 1999; 12: Towson S i wsp. SAFB2, a new scaffold attachment factor homolog and estrogen receptor corepressor. J Biol Chem 2003; 278: Rupniewska Z, Bojarska-Junak A. Apoptoza: Przepuszczalność błony mitochondrialnej i rola pełniona przez białka z rodziny BCL-2. Postepy Hig Med Dosw 2004; 58: data otrzymania pracy: r. data akceptacji do druku: r. 13. Øyan AM i wsp. Genes of cell-cell interactions, chemotherapy detoxification and apoptosis are induced during chemotherapy of acute myeloid leukemia. BMC Cancer 2009; 9: Rzońca S, Małecki M. Proapoptotyczna terapia genowa a wrażliwość nowotworów na chemioterapię. Współcz Onkol 2009; 13: Malinowska I. Rola apoptozy w patogenezie i leczeniu nowotworów układu hematopoetycznego. Postepy Hig Med Dosw 2004; 58: Awasthi S i wsp. RLIP76 and Cancer. Clin Cancer Res 2008; 14: Singhal SS i wsp. Regession of lung and colon cancer xenografts by depleting or inhibiting RLIP76 (Ral-Binding Protein 1). Cancer Res 2007; 67: Drake KJ i wsp. Multidrug-resistance conferred by RalBP1/RLIP76. Int J Oncol 2007; 30: Coornaert B, Carpentier I, Beyaert R. A20: Central gatekeeper in inflammation and immunity. Biol Chem 2009; 284: Lee EG i wsp. Failure to regulate TNF-induced NFkappaB and cell death responses in A20-deficient mice. Science 2000; 289: Adres do korespondencji: mgr Ewelina Aleksander Katedra i Zakład Biofarmacji Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach ul. Narcyzów Sosnowiec ewelina.aleksander@gmail.com